專利名稱：調(diào)節(jié)血管生成的新靶標(biāo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定在腫瘤血管中表達(dá)增加的多核苷酸和多肽。本發(fā)明還涉及經(jīng)鑒定 的多核苷酸和多肽及所述多核苷酸和多肽的抑制劑在調(diào)節(jié)血管生成以及診斷和治療血管 生成相關(guān)疾病(例如癌癥)中的用途。
背景技術(shù)：
血管生成是新的毛細(xì)血管的生長(zhǎng)，是實(shí)體瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵組分(Folkman，N. Engl. J. Med. 285 :1182(1971)).使用貝伐單抗，一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的單克隆抗 體，用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的抗血管生成靶向療法，已證實(shí)對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者具有功效 (Miller,E2100Study. Scientific session on monoclonal antibody therapy in breast cancer (乳腺癌單克隆抗體療法科學(xué)會(huì)議).Ann. Mtg. Am. Soc. Clin. Oncol. 8-29-2005)，并 且驗(yàn)證了用于該疾病的抗血管生成治療的方法。盡管VEGF是參與乳腺癌血管生成的一種 關(guān)鍵性生長(zhǎng)因子(Schneider 等，Nat. Clin. Pract. Oncol. 4 :181 (2007)),但是更詳盡地了 解在乳腺腫瘤血管中表達(dá)的基因的分類可有利于開發(fā)新的分子靶向的抗血管生成藥。若干研究已建立證據(jù)表明供應(yīng)腫瘤的血管所表達(dá)的基因并不被存在于正常 組織中的血管所共有(Buckanovich 等，J. Clin. Oncol. 25 :852(2007) ；Madden 等， Am. J. Pathol. 165 601 (2004) ；Parker 等，Cancer Res. 64 :7857 (2004) ；St. Croix 等， Science 289 :1197 (2000))。St. Croix等人采用組織解離和細(xì)胞免疫純化方法來(lái)分離腫瘤 和正常肉皮細(xì)胞，然后，將從一種結(jié)腸直腸癌中得到的內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜與從同一患 者的正常結(jié)腸粘膜中得到的進(jìn)行了比較(St. Croix等，Science 289 1197 (2000))。利用基 因表達(dá)系列分析，該分析鑒定出46種稱為腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志(TEM)的轉(zhuǎn)錄物，與正常內(nèi)皮相比， 所述轉(zhuǎn)錄物在腫瘤中顯著上調(diào)。Parker等人采用類似的方法，從兩種人乳腺腫瘤和一種正 常乳房縮小成形術(shù)(reduction mammoplasty)中分離出內(nèi)皮細(xì)胞，并鑒定出與正常乳腺組 織相比是差異表達(dá)的基因(Parker等，Cancer Res. 64 :7857 (2004)) 0該項(xiàng)研究鑒定出30 種乳腺腫瘤血管基因，通過(guò)原位雜交證實(shí)了其中的冊(cè)孔和PRL3位于內(nèi)皮中。這些研究還 表明結(jié)腸、乳腺和腦腫瘤之間在腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志方面具有腫瘤特異性差異。Buckanovich等人 隨后使用激光捕獲顯微切割來(lái)自卵巢癌和正常卵巢的血管細(xì)胞，鑒定出70種差異表達(dá)的 TEM(Buckanovich 等，J. Clin. Oncol. 25 852 (2007)) 使用DNA微陣列的基因表達(dá)研究已鑒定出若干不同的乳腺癌亞型(Perou等， Nature 406 :747 Q000))，所述亞型將乳腺癌分成在預(yù)后中明顯不同的各個(gè)組(Sorlie等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 10869 (2001)) 固有亞型(intrinsic subtype)包括雌激 素受體(ER)陰性腫瘤的2個(gè)主要亞型基礎(chǔ)亞型(Basal subtype) (ER陰性且Her2/neu陰性)和Her2/neu亞型(Her2/neu陽(yáng)性且ER陰性)；以及ER陽(yáng)性(管腔亞型(luminal subtype))。已知TEM在不同腫瘤類型之間不同，并且乳腺癌是分子異質(zhì)的，需要確定在乳 腺癌的不同分子亞型內(nèi)TEM是否也不同。本發(fā)明通過(guò)提供可用于診斷和治療方法的新的血管生成靶標(biāo)，而克服了本領(lǐng)域的 現(xiàn)有缺點(diǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于在腫瘤血管中表達(dá)增加的多核苷酸和多肽的鑒定及它們?cè)谘?生成中所起的作用。本發(fā)明還基于這些多核苷酸和多肽及其抑制劑在調(diào)節(jié)血管生成以及診 斷和治療血管生成相關(guān)疾病中的用途。因此，一方面，本發(fā)明提供抑制細(xì)胞中的血管生成的方法，所述方法包括降低細(xì)胞 中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供抑制受試者組織的血管生成的方法，所述方法包括降 低受試者組織中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療受試者中與過(guò)度或不需要的血管生成有關(guān)的病癥 的方法，所述方法包括降低受試者中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防受試者中的癌癥的方法，所述方法包括降 低受試者中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防受試者中的癌轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括降低受試者中 表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明涉及減少受試者中的腫瘤發(fā)生的方法，所述方法包括降 低所述受試者中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明涉及抑制受試者組織中的血管生成的方法、治療受試者 中的與過(guò)度或不需要的血管生成有關(guān)的病癥的方法、治療或預(yù)防受試者中的癌癥的方法、 治療或預(yù)防受試者中的癌轉(zhuǎn)移的方法和/或減少受試者中的腫瘤發(fā)生的方法，所述方法包 括將鈣依賴磷酸酶或NF-ATc抑制劑(例如他克莫司(tacrolimus))遞送至受試者。在這些方面中的每一個(gè)中，所述受試者可能被診斷出患有癌癥，例如乳腺癌。在某 些實(shí)施方案中，通過(guò)降低編碼多肽的核酸的水平(例如用反義RNA、微小RNA或siRNA)、降 低多肽本身的水平或降低多肽的活性(例如用特異抑制多肽本身或多肽的上游或下游信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抗體、適配體或小分子)，來(lái)降低所述一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種多肽選自SFRP2、JAK3和FAP或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，所述一種或多種多肽不包括SFRP2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種多肽不包 括JAK3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種多肽不包括FAP。本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及增加細(xì)胞中的血管生成的方法，所述方法包括增加細(xì)胞 中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)向細(xì)胞遞送編 碼多肽的核酸或多肽本身，來(lái)增加表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及增加受試者組織中的血管生成的方法，所述方法包括增 加受試者組織中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。在某些實(shí)施方案中，通過(guò) 向受試者遞送編碼多肽的核酸或多肽本身，來(lái)增加表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/ 或活性。
本發(fā)明還涉及診斷受試者中的癌癥的方法，所述方法包括從受試者中獲取樣品 (例如組織樣品或細(xì)胞)，并測(cè)定樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，其 中與對(duì)照樣品中的表達(dá)和/或活性水平相比，表達(dá)和/或活性增加指示癌癥。在一個(gè)實(shí)施 方案中，測(cè)定了至少2、5、10個(gè)或更多個(gè)所列多肽的表達(dá)和/或活性。在某些實(shí)施方案中， 表達(dá)可通過(guò)測(cè)定編碼多肽的核酸水平或多肽本身來(lái)測(cè)定。本發(fā)明的另外一個(gè)方面涉及測(cè)定受試者中癌的血管生成潛力的方法，所述方法包 括從受試者的癌中獲取樣品(例如組織樣品或細(xì)胞)，并測(cè)定樣品中表1所列的一種或多種 多肽的表達(dá)和/或活性，其中與對(duì)照樣品中的表達(dá)和/或活性水平相比，表達(dá)和/或活性增 加表示癌的血管生成潛力提高。本發(fā)明還涉及測(cè)定受試者中癌的轉(zhuǎn)移潛力的方法，所述方法包括從受試者的癌中 獲取樣品(例如組織樣品或細(xì)胞)，并測(cè)定樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或 活性，其中與對(duì)照樣品中的表達(dá)和/或活性水平相比，表達(dá)和/或活性增加表示癌的轉(zhuǎn)移潛 力提高。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及監(jiān)測(cè)受試者中癌癥治療的有效性的方法，所述方法包括 從已接受癌癥治療的受試者中獲取樣品(例如組織樣品或細(xì)胞)，測(cè)定樣品中表1所列的一 種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，以及將表達(dá)和/或活性水平與對(duì)照樣品中的表達(dá)和/或 活性水平進(jìn)行比較，其中與對(duì)照樣品相比，樣品中表達(dá)和/或活性水平的降低表示治療有 效。本發(fā)明還涉及監(jiān)測(cè)受試者中的癌癥進(jìn)展的方法，所述方法包括從患有癌癥的受試 者中獲取樣品(例如組織樣品或細(xì)胞)，測(cè)定樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/ 或活性，以及將表達(dá)和/或活性水平與對(duì)照樣品中的表達(dá)和/或活性水平進(jìn)行比較，其中與 對(duì)照樣品相比，樣品中的表達(dá)和/或活性水平提高表示癌癥的進(jìn)展。本發(fā)明還涉及區(qū)分乳腺癌亞型的方法，所述方法包括從受試者中獲取乳腺癌樣 品，測(cè)定樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，以及根據(jù)表達(dá)譜和/或活性 譜確定癌癥的亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用來(lái)區(qū)分ER陰性和ER陽(yáng)性乳腺癌。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用來(lái)區(qū)分基底亞型(basal subtype)、Her2/neu亞型和管腔亞 型(luminal subtype)。本發(fā)明還涉及區(qū)分原位乳腺癌和侵襲性乳腺癌的方法，所述方法包括從受試者中 獲取乳腺癌樣品，測(cè)定樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，以及根據(jù)表達(dá) 譜和/或活性譜確定癌癥的類型。另外，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)血管生成的化合物的方法，所述方法包括在試驗(yàn)化合 物存在和不存在時(shí)，在基于細(xì)胞的測(cè)定或非基于細(xì)胞的測(cè)定中測(cè)定表1所列的一種或多種 多肽的表達(dá)和/或活性，以及篩選出與該化合物不存在時(shí)的水平相比，所述一種或多種多 肽的表達(dá)和/或活性水平提高或降低的化合物作為調(diào)節(jié)血管生成的化合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及鑒定用于抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的化合物的方法，所述方 法包括在試驗(yàn)化合物存在和不存在時(shí)，在基于細(xì)胞的測(cè)定或非基于細(xì)胞的測(cè)定中測(cè)定表1 所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，以及篩選出與該化合物不存在時(shí)的水平相比， 所述一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性水平提高或降低的化合物作為用于抑制腫瘤生長(zhǎng) 或轉(zhuǎn)移的化合物。
本發(fā)明還涉及核酸(例如寡核苷酸)或多肽(例如抗體)陣列，所述陣列包含編 碼至少兩種表1所列多肽的核酸，例如至少5、10、15、20種或更多種多肽。本發(fā)明還涉及增加或降低表1所列多肽或編碼該多肽的核酸的表達(dá)和/或活性的 分子。所述分子可以是例如反義RNA、siRNA、適配體、抗體、小分子等。在一個(gè)實(shí)施方案中， 本發(fā)明涉及包含所述分子的藥物組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于評(píng)估血管生成的試劑盒，所述試劑盒包含用于測(cè) 定表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性的試劑。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于診斷癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含用于測(cè)定表1 所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性的試劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于測(cè)定癌癥轉(zhuǎn)移潛力的試劑盒，所述試劑盒包含用 于測(cè)定表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性的試劑。在本發(fā)明的以下描述中更詳盡地陳述了本發(fā)明的這些方面和其它方面。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示在顯微切割前后激光捕獲顯微切割的人乳腺血管細(xì)胞G00X)。圖2顯示RNA完整性分析(RNA integrity analyses)。將低和高豐度水平的基因 的RT-PCR引物用于來(lái)自“整鋪片”和“LCM”的cDNA，整鋪片是指顯微切割前完整腫瘤的冷 凍切片，LCM是指從人乳腺腫瘤冷凍切片中顯微切割的血管樣品。泳道1，DNA梯；泳道2， 來(lái)自“整鋪片”的低表達(dá)的ADP核糖基化因子I基因(ARE Fl)的3，端Q39bp)；泳道3，來(lái) 自“整鋪片”的ARF Fl的5，端(336bp)；泳道4，來(lái)自“整鋪片”的持家基因GAPDH的3，端 (540bp)；泳道5，來(lái)自“整鋪片”的GAPDH的5’端(887bp)；泳道6，來(lái)自顯微切割的血管細(xì) 胞的ARFFl的3’端；泳道7，來(lái)自顯微切割的血管細(xì)胞的ARF Fl的5’端；泳道8，來(lái)自顯微 切割的血管細(xì)胞的GAPDH的3’端；泳道9，來(lái)自顯微切割的血管細(xì)胞的GAPDH的5’端。圖3顯示鑒定血管的基因表達(dá)分析。從左到右排列的為L(zhǎng)CM血管細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞系 和乳腺腫瘤衍生細(xì)胞系的陣列。把體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的陣列標(biāo)記為真皮-微血管-內(nèi) 皮-細(xì)胞、臍帶-靜脈-內(nèi)皮-細(xì)胞、臍帶-靜脈-內(nèi)皮-細(xì)胞、主動(dòng)脈-平滑-肌-細(xì) 胞。把體外乳腺腫瘤衍生的細(xì)胞系的陣列標(biāo)記為T47D-1、T47D-2、MCF7、MDA-MB-365、 MDA-MB-453、HCC1937-1、HCC1937-2。對(duì)不同基因集的數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定，并且群集在以降序排 列的各相關(guān)類別中A)內(nèi)皮基因、B)TEM、C)造血基因、D)周細(xì)胞基因和E)上皮基因。圖4顯示血管標(biāo)志基因的血管來(lái)源的確證。以600X放大倍數(shù)拍照。圖5A-5D顯示乳腺腫瘤血管與正常乳腺血管之間血管基因的差異蛋白質(zhì)表達(dá)。圖6顯示SFRP2在尿囊絨膜上誘導(dǎo)血管生成。圖7顯示在劃痕損傷試驗(yàn)(wound scratch assay)中SFRP2加快內(nèi)皮細(xì)胞遷移。圖8顯示SFRP2在8小時(shí)內(nèi)以濃度依賴性方式誘導(dǎo)的內(nèi)皮管道形成(endothelial tube formation)。圖9顯示SFRP2在小鼠基質(zhì)膠栓試驗(yàn)(Matrigel plug assay)中誘導(dǎo)血管生成。圖10顯示SFRP2在MEC細(xì)胞中抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。圖11顯示用和未用SFRP2處理的內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜。圖12顯示在用SFRP2處理的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞核和胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白表達(dá)的蛋 白質(zhì)印跡分析。
圖13顯示用和未用SFRP2 (700pM)處理1小時(shí)的MEC細(xì)胞的細(xì)胞核部分的蛋白質(zhì) 印跡分析。圖14顯示他克莫司體外抑制SFRP2誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞管道形成。圖15顯示他克莫司體外逆轉(zhuǎn)SFRP2誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞管道形成。圖16顯示與對(duì)照小鼠內(nèi)皮細(xì)胞相比，SFRP2在SVR血管肉瘤細(xì)胞系中增加。圖17A-17D顯示A) SFRP2在MEC細(xì)胞中誘導(dǎo)管道形成；B)他克莫司在SFRP2誘導(dǎo) 的MEC細(xì)胞中抑制管道形成；C)他克莫司在SVR血管肉瘤細(xì)胞中抑制管道形成；和D) SVR 管道形成被抗SFRP2的多克隆抗體抑制。圖18顯示他克莫司體外抑制2H11細(xì)胞中SFRP2誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞管道形成。圖19顯示他克莫司體外抑制2H11細(xì)胞中VEGF誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞管道形成。圖20A-20B顯示抗SFRP2的多克隆抗體體外抑制SVR管道形成。圖21顯示SFRP2的siRNA體外抑制SVR管道形成。圖22顯示針對(duì)SFRP2的不同表位產(chǎn)生的多克隆抗體的抑制活性。按1 100稀 釋度使用來(lái)自針對(duì)SFRP2的肽序列(AbA、AbB、AbC、AbD、AbE)免疫的小鼠血清和對(duì)照血清。 肽AbA、AbB、AbC和AbD的抗體全都抑制管道形成，然而，AbB和AbC具有最大抑制。對(duì)于所
有組別N = 4。圖23A-23C顯示針對(duì)SFRP2產(chǎn)生的單克隆抗體抑制管道形成。A)代表性對(duì)照孔。 B)用來(lái)自分泌抗體的雜交瘤的上清液處理的血管肉瘤細(xì)胞顯示管道形成的抑制。C)與來(lái) 自選擇用于進(jìn)一步亞克隆的8種雜交瘤的上清液相比，對(duì)照血管肉瘤細(xì)胞的分支點(diǎn)。圖M顯示SFRP2在癌癥患者的血清中過(guò)量表達(dá)。泳道C1-C3為對(duì)照，泳道P1-P6 為乳腺癌患者的血清樣品(P < 0.0001)。圖25通過(guò)免疫組織化學(xué)法顯示SFRP2蛋白存在于各種腫瘤類型的內(nèi)皮中。人腫 瘤的石蠟包埋切片用抗SFRP2抗體染色。以600X放大倍數(shù)拍攝照片。圖沈顯示他克莫司抑制裸小鼠中的SVR血管肉瘤異種移植物的生長(zhǎng)。照片顯示 在治療第19天的代表性對(duì)照小鼠腫瘤和代表性他克莫司治療的小鼠腫瘤。圖27顯示他克莫司抑制MMTV-neu轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤的生長(zhǎng)速率(n = 12他克莫司 治療，η = 9未治療，ρ = 0. 04)。圖觀利用雞尿囊絨膜(CAM)試驗(yàn)顯示Jak3體內(nèi)促進(jìn)血管生成的能力。柱狀圖顯 示與對(duì)照相比Jak3處理的圓片(disk)周圍血管的定量分析。照片顯示與對(duì)照相比Jak3 處理的圓片周圍血管中的血管生成。圖四利用劃痕損傷試驗(yàn)(scratch wound assay)顯示Jak3在HCAEC上的遷移性 質(zhì)。曲線顯示在所有孔中的損傷閉合(mnmd closure)速率的定量分析。照片顯示在觀 小時(shí)內(nèi)對(duì)照對(duì)比起Jak3處理的細(xì)胞的相對(duì)損傷閉合。圖30利用內(nèi)皮細(xì)胞管道形成試驗(yàn)顯示Jak3在HCAEC上的管道形成性質(zhì)。柱狀圖 顯示所有孔中分支點(diǎn)數(shù)目的定量分析。照片顯示對(duì)照對(duì)比起Jak3處理的細(xì)胞中的相對(duì)管 道形成。圖31顯示HCAEC中Jak3對(duì)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。圖32顯示在Jak3存在下的HCAEC增殖。圖33利用磷酸化STAT3 (P-STAT3)的小肽抑制劑顯示STAT3活化在Jak3介導(dǎo)的管道形成中的作用。柱狀圖顯示所有孔中分支點(diǎn)數(shù)目的定量分析。照片顯示Jak3處理的 細(xì)胞對(duì)比Jak3+P-STAT3抑制劑處理的細(xì)胞中的相對(duì)管道形成。發(fā)明詳述現(xiàn)將參照附圖對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述，附圖中顯示了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。 然而，本發(fā)明可以不同的形式體現(xiàn)，并且不應(yīng)解釋為局限于本文所給出的實(shí)施方案。更確切 地說(shuō)，提供的這些實(shí)施方案使得本公開內(nèi)容將是完整和全面的，并且向本領(lǐng)域技術(shù)人員全 面地傳達(dá)了本發(fā)明的范圍。除非另有規(guī)定，否則本文使用的所有科技術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人 員通常理解的含義。在本文中用于本發(fā)明說(shuō)明書中的術(shù)語(yǔ)的目的只是為了描述具體的實(shí)施 方案，并不意圖限制本發(fā)明。本文引用的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利、專利出版物和其它參 考文獻(xiàn)都通過(guò)整體引用予以結(jié)合，用于出現(xiàn)參考文獻(xiàn)的有關(guān)句子和/或段落的教導(dǎo)。僅通過(guò)單鏈以5'至3'的方向從左到右來(lái)表示核苷酸序列，除非另有具體說(shuō)明。 在本文中以IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的方式表示核苷酸和氨基酸，或者通過(guò)一 字母碼或三字母碼表示(對(duì)于氨基酸)，兩者都遵照37C. F. R. § 1. 822和已確立的用法。除非另有說(shuō)明，否則本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可用于克隆基因、擴(kuò)增和檢 測(cè)核酸等。這類技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版(ColdSpring Harbor, NY,1989) ；Ausubel 等，Current Protocols in MolecularBiology(Green Publishing Associates,Inc. and John Wiley & Sons, Inc. , New York)。I.定義當(dāng)用于描述本發(fā)明和隨附權(quán)利要求時(shí)，未加數(shù)詞的單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形 式，除非文中另有明確說(shuō)明。同樣，本文使用的“和/或”是指并且包括有關(guān)列出項(xiàng)目中的一個(gè)或多個(gè)的任何和 所有可能的組合，以及當(dāng)以或者(“或”)解釋時(shí)是指不構(gòu)成組合。術(shù)語(yǔ)“基本上由......組成”(及語(yǔ)法變體)當(dāng)用于本發(fā)明的多核苷酸或多肽序
列時(shí)，是指多核苷酸或多肽由所列舉的序列(例如SEQ IDN0)和在所列舉序列的5'和/ 或3'或N端和/或C端上的共10個(gè)以下的(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))額外核 苷酸或氨基酸兩者組成，使得多核苷酸或多肽的功能不會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變。共10個(gè)以下的 額外核苷酸或氨基酸包括在兩端加在一起的額外核苷酸或氨基酸的總數(shù)。術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)性改 變”當(dāng)用于本發(fā)明的多核苷酸時(shí)，是指與由所列舉的序列組成的多核苷酸的表達(dá)水平相比， 表達(dá)編碼多肽的能力提高或降低至少約50%以上。術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)性改變”當(dāng)用于本發(fā)明的多 肽時(shí)，是指與由所列舉的序列組成的多肽的活性相比，血管生成刺激活性提高或降低至少 約50%以上。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”或其語(yǔ)法變體是指增強(qiáng)(例如提高)或抑制(例如降低)特定的水 平或活性。術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)”或“提高”是指具體參數(shù)提高至至少約1. 25倍、1. 5倍、2倍、3倍、4 倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍或甚至15倍。 本文使用的術(shù)語(yǔ)“抑制”或“降低”或其語(yǔ)法變體是指特定水平或活性降低或減少 至少約 15%、25%、35%、40%、50%、60%、75%、80%、90%、95% 以上。在具體的實(shí)施方案中，抑制或減少導(dǎo)致很少或基本上無(wú)可檢出活性(至多是不明顯的量，例如小于約10%或 甚至5% )。本文使用的“治療有效”量是給受試者提供某種改善或益處的量。換句話說(shuō)，“治 療有效”量是以下的量其將為受試者的至少一種臨床癥狀提供某種減輕、緩解或減少(例 如在癌癥的情況下，減少腫瘤負(fù)荷、防止腫瘤進(jìn)一步生長(zhǎng)、防止轉(zhuǎn)移或延長(zhǎng)生存時(shí)間)。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，治療效果無(wú)需是徹底或治愈的，只要給受試者提供一定益處即可。術(shù)語(yǔ)“治療”或其語(yǔ)法變體是指受試者病況的嚴(yán)重程度降低或至少部分改善或改 進(jìn)，并在至少一種臨床癥狀上實(shí)現(xiàn)一定減輕、緩解或降低。表述“腫瘤發(fā)生”主要是指一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的腫瘤狀況(例如細(xì)胞的瘤性轉(zhuǎn)化程 度、細(xì)胞的惡性水平、細(xì)胞形成腫瘤和/或具有腫瘤特征的傾向或者僅僅是患者或組織/器 官中腫瘤細(xì)胞的存在或不存在)，其反映出細(xì)胞或細(xì)胞群從正常到惡性狀態(tài)的改變。腫瘤 發(fā)生表明腫瘤細(xì)胞存在于樣品中，和/或細(xì)胞從正常向腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化正在進(jìn)行中，這可 通過(guò)腫瘤發(fā)展的任何標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定法來(lái)證實(shí)。改變通常包括細(xì)胞以快于在相同條件下的正常 細(xì)胞所觀察到的生長(zhǎng)速度增殖，并且其典型特征在于一個(gè)或多個(gè)下列特性即使在刺激因 子(例如致癌物、病毒)不再存在后仍繼續(xù)生長(zhǎng)；缺乏結(jié)構(gòu)組織性和/或與正常組織的協(xié)調(diào) 性，通常形成組織團(tuán)塊或腫瘤。因此，腫瘤最常描述為由腫瘤生長(zhǎng)導(dǎo)致的細(xì)胞增殖(例如瘤 形成、瘤(growth)、息肉)，而且最典型的是惡性腫瘤。在瘤性轉(zhuǎn)化的情況下，瘤形成是惡性 的或易變成惡性。惡性腫瘤通常表征為退行發(fā)育性(以缺乏分化為特征的原始細(xì)胞生長(zhǎng))、 侵襲性(移動(dòng)至周圍組織并破壞周圍組織)和/或轉(zhuǎn)移性(擴(kuò)散到機(jī)體的其它部位)。本文使用的表述“與過(guò)度或不需要的血管生成有關(guān)的病癥”是指其中出現(xiàn)不需要 的血管生成的任何疾病、病癥或病況。這類病癥的實(shí)例包括而不限于癌癥、感染性疾病、自 身免疫性病癥、血管畸形、迪格奧爾格綜合征(DiGeorge syndrome)、HHT、海綿狀血管瘤、動(dòng) 脈粥樣硬化、移植性動(dòng)脈病(transplant arteriopathy)、肥胖癥、銀屑病、疣、變應(yīng)性皮炎、 瘢痕疙瘩(scar keloid)、化膿性肉芽腫、起泡性疾病(blistering disease)、卡波西肉瘤 (Kaposi ‘ s sarcoma)、持續(xù)增生性玻璃體綜合征(persistent hyperplastic vitreous syndrome)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、脈絡(luò)膜新生血管、原發(fā)性肺 動(dòng)脈高壓、哮喘、鼻息肉、炎性腸病、牙周病、腹水、腹膜粘連、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮出血、卵 巢囊腫、卵巢過(guò)度刺激、異位妊娠、關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、骨髓炎和/或骨贅形成。本文使用的術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指細(xì)胞的任何良性或惡性的異常生長(zhǎng)。實(shí)例包括而不 限于乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、惡性黑素瘤、卵巢癌、腦 癌、原發(fā)性腦癌、頭頸部癌、膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、頭或頸癌、 乳腺癌、卵巢癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、維爾姆斯瘤(Wilms' tumor)、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、 胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、泌尿生殖器癌(genitourinary carcinoma)、甲狀腺癌、食 管癌、骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腎上腺癌、腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌、惡性胰島腺 瘤(malignant pancreatic insulinoma)、惡性類癌(malignantcarcinoid carcinoma)、絨 毛膜癌、蕈樣肉芽腫病、惡性高鈣血癥、宮頸增生、白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋 巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性 粒細(xì)胞性白血病、毛細(xì)胞性白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、真性紅細(xì)胞增 多、原發(fā)性(essential)血小板增多癥、霍奇金病(Hodgkin' s disease)、非霍奇金淋巴瘤、軟組織肉瘤、骨源性肉瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中， 癌癥選自形成腫瘤的癌(tumor-forming cancer)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“乳腺癌”是指起于受試者乳腺細(xì)胞的癌癥。該術(shù)語(yǔ)包括侵襲性 癌和原位癌，并包括乳腺癌的全部亞型，包括基底亞型(ER陰性且Her2/neu陰性)、Her2/ neu亞型(Her2/neu陽(yáng)性且ER陰性)和管腔亞型(ER陽(yáng)性)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)照樣品”是指用來(lái)將表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或 活性水平與目標(biāo)樣品的表達(dá)和/或活性水平進(jìn)行比較的組織或細(xì)胞樣品。對(duì)照樣品可例如 來(lái)自受試者中的相同組織或細(xì)胞類型的正常(即非患病)部分、來(lái)自受試者中的不同組織 或細(xì)胞類型、來(lái)自匹配的個(gè)體、或者可以是由從受試者群獲取的平均測(cè)量值推導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照樣品可以例如在診斷時(shí)、在治療前或在治療期后從受試者的疾病 組織獲得。本文使用的“核酸”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”可互換使用，而且包括RNA和DNA 兩者，包括cDNA、基因組DNA、mRNA、合成(例如化學(xué)合成的)DNA或RNA及RNA和DNA的嵌 合體。術(shù)語(yǔ)多核苷酸、核苷酸序列或核酸是指核苷酸鏈而不考慮鏈的長(zhǎng)度。核酸可以是雙 鏈或單鏈。如果是單鏈，則核酸可以是有義鏈或反義鏈。核酸可以用寡核苷酸類似物或衍 生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成?？蓪⑦@類寡核苷酸用于例如制備具有改變的堿 基配對(duì)能力或增強(qiáng)的核酸酶抗性的核酸。本發(fā)明還提供與本發(fā)明的核酸、核苷酸序列或多 核苷酸互補(bǔ)(可以是完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ))的核酸?！胺蛛x的多核苷酸”是不與其在生物體(分離的核苷酸序列從中獲得)天然存在的 基因組中是直接鄰接(一條在5'端，而另一條在3'端)的核苷酸序列直接鄰接的核苷酸 序列(例如DNA或RNA)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸包括與編碼序列直接鄰接 的5'非編碼(例如啟動(dòng)子)序列中的一些或全部。因此，該術(shù)語(yǔ)包括例如摻入載體、摻入 自主復(fù)制質(zhì)?；虿《净蛘邠饺朐松锘蛘婧松锏幕蚪MDNA的重組DNA，或者獨(dú)立于 其它序列作為單獨(dú)分子(例如通過(guò)PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA 片段)存在的。其還包括是編碼額外多肽或肽序列的雜交核酸的一部分的重組DNA。包含 基因的分離多核苷酸不是包含這種基因的染色體片段，而是包含與該基因有關(guān)的編碼區(qū)和 調(diào)節(jié)區(qū)，但卻無(wú)天然存在于染色體上的其它基因的染色體片段。術(shù)語(yǔ)“分離的”可以是指基本上不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)和/或培養(yǎng)基(當(dāng)通過(guò)重 組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí))或者化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)(當(dāng)化學(xué)合成時(shí))的核酸、核苷酸序列 或多肽。此外，“分離的片段”為不是作為片段天然存在的且不以天然狀態(tài)存在的核酸、核苷 酸序列或多肽的片段?！胺蛛x的”并不意味著制備物是工業(yè)純的(均質(zhì)的)，但卻純得足以 提供可用于預(yù)期目的形式的多肽或核酸。分離的細(xì)胞是指與在其天然狀態(tài)下是通常關(guān)聯(lián)其的其它組分分離的細(xì)胞。例如， 分離的細(xì)胞可以是培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體中的細(xì)胞。因此， 可將分離細(xì)胞遞送至和/或引入受試者。在一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞可以是從受試者 中取出，并如本文所述進(jìn)行離體操作，然后送回受試者的細(xì)胞。用于多核苷酸的術(shù)語(yǔ)“片段”應(yīng)理解為是指與參比核酸或核苷酸序列相比，長(zhǎng)度 縮短的核苷酸序列，并且包含與參比核酸或核苷酸序列同一或幾乎同一(例如90%、92%、 95^^98^^99%同一性)的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列、基本由和/或由所述連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成。如果適當(dāng)?shù)脑?，本發(fā)明的這類核酸片段可包括在較大的多核苷酸內(nèi)作為 其組分。在一些實(shí)施方案中，這類片段可包含長(zhǎng)度為本發(fā)明核酸或核苷酸序列的至少約8、 10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200個(gè)以上連續(xù)核苷酸的寡核苷酸、基本由
和/或由所述寡核苷酸組成。用于多肽的術(shù)語(yǔ)“片段”應(yīng)理解為是指與參比多肽或氨基酸序列相比，長(zhǎng)度縮短 的氨基酸序列，其包含與參比多肽或氨基酸序列同一或幾乎同一(例如90 %、92 %、95 %、 98%、99%同一性)的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列、基本由和/或由所述連續(xù)氨基酸的氨基酸 序列組成。如果適當(dāng)?shù)脑挘景l(fā)明的這類多肽片段可以包括在較大多肽內(nèi)作為其組分。在 一些實(shí)施方案中，這類片段可包含長(zhǎng)度為本發(fā)明多肽或氨基酸序列的至少約4、6、8、10、12、 15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200個(gè)以上連續(xù)氨基酸的肽、基本由和/或由所述 肽組成?！拜d體”是用于將核酸克隆和/或轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的任何核酸分子。載體可以是另一 核苷酸序列可與之連接以供所連接的核苷酸序列復(fù)制之用的復(fù)制子?！皬?fù)制子”可以是在體 內(nèi)起核酸復(fù)制的自主單位作用(即能夠在自我控制下復(fù)制)的任何遺傳元件(例如質(zhì)粒、 噬菌體、粘粒、染色體、病毒基因組)。術(shù)語(yǔ)“載體”包括用于在體外、離體和/或體內(nèi)將核酸 導(dǎo)入細(xì)胞的病毒和非病毒(例如質(zhì)粒)核酸分子?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種載體來(lái)操作 核酸，將應(yīng)答元件和啟動(dòng)子摻入基因等。例如，可通過(guò)將合適的核酸片段與具有互補(bǔ)粘性末 端的選定載體連接，來(lái)實(shí)現(xiàn)將對(duì)應(yīng)于應(yīng)答元件和啟動(dòng)子的核酸片段插入合適的載體中?；?者，可對(duì)核酸分子的末端進(jìn)行酶促修飾，或可通過(guò)使核苷酸序列(接頭)與核酸末端連接而 產(chǎn)生任何位點(diǎn)?？蓪?duì)這類載體進(jìn)行工程改造使其含有編碼選擇標(biāo)記的序列，該選擇標(biāo)記提 供對(duì)含有載體和/或載體的核酸已摻入細(xì)胞基因組的細(xì)胞的選擇。這類標(biāo)記允許鑒定和/ 或選擇摻入并表達(dá)由該標(biāo)記編碼的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。“重組”載體是指包含一個(gè)或多個(gè)異 源核苷酸序列(即轉(zhuǎn)基因)的病毒或非病毒載體，例如2、3、4、5個(gè)以上異源核苷酸序列。在細(xì)胞以及活的動(dòng)物受試者中，病毒載體已被用于多種基因遞送應(yīng)用中?？墒褂?的病毒載體包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺伴隨病毒、痘病毒、甲病毒、桿狀病毒、痘 苗病毒、皰疹病毒、埃巴病毒和腺病毒載體。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電脂質(zhì)(細(xì) 胞轉(zhuǎn)染劑)、核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體和生物聚合體。除了目標(biāo)核酸以外，載體還可包含一個(gè)或 多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)和/或可用于選擇、測(cè)定和監(jiān)測(cè)核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(遞送到特定組織、表達(dá)持續(xù)時(shí)間 等)的選擇標(biāo)記?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知方法將載體導(dǎo)入所需細(xì)胞內(nèi)，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注 射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、使用基因槍或 核酸載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(參見例如mi等，J. Biol. Chem. 267 :963 (1992) ；Wu等，J. Biol. Chem. 263 :14621(1988)；以及Hartmut等人于1990年3月15日申請(qǐng)的加拿大專利申請(qǐng)?zhí)?2，012，311)。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)體內(nèi)脂轉(zhuǎn)染將本發(fā)明的多核苷酸遞送至細(xì)胞中。 可以使用設(shè)計(jì)以限制脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染所遇到的困難和危險(xiǎn)的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)，來(lái)制備用 于本發(fā)明的核苷酸序列體內(nèi)轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)體(Feigner等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413(1987) ；Mackey 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 :8027(1988)；以及 Ulmer 等， Science259 :1745(1993))。陽(yáng)離子脂質(zhì)的使用可促進(jìn)將帶負(fù)電荷的核酸包裹起來(lái)，并且還促進(jìn)與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜的融合(Feigner等，Science337 :387(1989))。對(duì)核酸轉(zhuǎn)移特別 有用的脂質(zhì)化合物和組合物描述于國(guó)際專利出版物W095/18863和W096/17823及美國(guó)專利 號(hào)5，459，127。體內(nèi)使用脂轉(zhuǎn)染將外源核苷酸序列導(dǎo)入特定器官具有某些實(shí)用優(yōu)勢(shì)。脂質(zhì) 體至特定細(xì)胞的分子靶向代表益處的一個(gè)方面。清楚的是，在具有細(xì)胞異質(zhì)性的組織中引 導(dǎo)至特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染將是特別優(yōu)選的，例如胰腺、肝、腎和腦。為了靶向的目的，可將脂 質(zhì)與其它分子進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)(Mackey等，1988，同上)。靶向肽，例如激素或神經(jīng)遞質(zhì)；以及 蛋白質(zhì)，例如抗體；或非肽分子可與脂質(zhì)體進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)。在各種實(shí)施方案中，其它分子可用于促進(jìn)體內(nèi)核酸遞送，例如陽(yáng)離子寡肽(例如 W095/21931)、來(lái)源于核酸結(jié)合蛋白的肽(例如W096/25508)和/或陽(yáng)離子聚合物(例如 W095/21931)。體內(nèi)導(dǎo)入作為裸核酸的載體也是可能的(參見美國(guó)專利號(hào)5，693，622,5, 589，466 和5，580，859)。也可以采用受體介導(dǎo)的核酸遞送方法(Curiel等，Hum. Gene Ther. 3 147 (1992) ；Wu 等，J. Biol. Chem. 262 4429 (1987))。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指細(xì)胞攝取外源或異源核酸(RNA和/或DNA)。當(dāng)外源 或異源核酸被導(dǎo)入或遞送到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，細(xì)胞已被這類核酸“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。當(dāng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn) 導(dǎo)的核酸賦予細(xì)胞表型改變和/或細(xì)胞活性或功能改變時(shí)，細(xì)胞已被外源或異源核酸“轉(zhuǎn) 化”?？蓪⑥D(zhuǎn)化核酸整合(共價(jià)連接)至構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA中，或者其可作為穩(wěn) 定質(zhì)粒存在。本文使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互換使用，并包括肽和蛋白質(zhì)兩者，除非另 有說(shuō)明?！叭诤系鞍住笔钱?dāng)編碼兩條(或更多條)在自然中未發(fā)現(xiàn)其融合在一起的不同多肽 的兩條異源核苷酸序列或其片段，在正確翻譯閱讀框內(nèi)融合在一起時(shí)產(chǎn)生的多肽。說(shuō)明性 的融合多肽包括本發(fā)明的多肽(或其片段)與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥牙糖結(jié)合蛋白或報(bào) 道分子蛋白(例如綠色熒光蛋白、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶等)、血 凝素、c-myc、FLAG表位等的全部或部分的融合物。本文使用的“功能性”多肽或“功能性片段”是基本上保持通常與該多肽有關(guān)的至 少一種生物活性(例如血管生成活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、配體或受體結(jié)合)的多肽或片段。在 具體的實(shí)施方案中，“功能性”多肽或“功能性片段”基本上保持未修飾肽所具有的全部活 性。所謂“基本上保持”生物活性，是指多肽保持天然多肽的至少約20^^30^^40^^50%, 60%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、99%以上的生物活性(甚至可具有比天然多肽高 的活性水平)。“無(wú)功能性”多肽是表現(xiàn)很少或基本上無(wú)可檢出的通常與該多肽有關(guān)的生物 活性的多肽(例如至多只是不明顯的量，例如小于約10%或甚至5% )?？刹捎帽绢I(lǐng)域眾所 周知和本文所述的測(cè)定法測(cè)定生物活性，例如蛋白質(zhì)結(jié)合和血管生成活性。多核苷酸編碼序列的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指序列轉(zhuǎn)錄，并任選翻譯。按照本發(fā)明，本發(fā) 明編碼序列的表達(dá)通常將導(dǎo)致本發(fā)明多肽的產(chǎn)生。完整表達(dá)的多肽或片段無(wú)需純化便可在 完整細(xì)胞內(nèi)起作用。當(dāng)提及可測(cè)量的值時(shí)，例如多肽的量、劑量、時(shí)間、溫度、酶活性或其它生物活性 等，本文使用的術(shù)語(yǔ)“約”是指包括指定量的士20%、士 10%、士5%、士 1%、士0.5%或甚至 士 0. 的差異。
II. ##癇血■胞沖卜.i周白姊浦_碰本發(fā)明人已鑒定并表征了與非腫瘤血管相比在腫瘤血管細(xì)胞中顯著上調(diào)的多肽 和編碼該多肽的多核苷酸。表1列舉了陽(yáng)種在與乳腺腫瘤血管相關(guān)的細(xì)胞中上調(diào)至少4 倍的多核苷酸。這些上調(diào)的多核苷酸和多肽中的每一種都代表著在研究血管生成、腫瘤形 成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中可用的靶標(biāo)。此外，這些靶標(biāo)可用于診斷和治療血管生成相關(guān)疾病和病癥 例如癌癥、缺血等。另外，這些靶標(biāo)可用來(lái)篩選可用于診斷和治療血管生成相關(guān)疾病和病癥 的藥劑。與表1中的公眾可獲取的標(biāo)識(shí)符和登記號(hào)有關(guān)的所有信息，包括基因的核酸序列 和由其編碼的多肽的氨基酸序列都通過(guò)整體引用結(jié)合至本文中。表1.在腫瘤血管細(xì)胞中具有超過(guò)4倍改變的上調(diào)基因
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞中的血管生成的方法，所述方法包括降低所述細(xì)胞中表1所列的一種 或多種多肽的表達(dá)和/或活性。
2.一種抑制受試者組織中血管生成的方法，所述方法包括降低所述受試者的所述組織 中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。
3.一種治療受試者的與過(guò)度或不需要的血管生成有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括降 低所述受試者中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。
4.一種治療受試者中的癌癥的方法，所述方法包括降低所述受試者中表1所列的一種 或多種多肽的表達(dá)和/或活性。
5.一種治療或預(yù)防受試者中的癌轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括降低所述受試者中表1所 列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。
6.一種減少受試者中的腫瘤發(fā)生的方法，所述方法包括降低所述受試者中表1所列的 一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者已被診斷患有癌癥。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
9.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中降低表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或 活性包括降低編碼所述多肽的核酸水平。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述方法包括將反義RNA遞送至所述受試者以降低編碼所 述多肽的核酸水平。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述方法包括將RNAi遞送至所述受試者以降低編碼所述 多肽的核酸水平。
12.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中降低表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或 活性包括降低所述多肽的活性。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括將特異結(jié)合所述多肽的抗體遞送至所述受 試者以降低所述多肽的活性。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括將特異結(jié)合所述多肽的適配體遞送至所述 受試者以降低所述多肽的活性。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法包括將特異抑制所述多肽的小分子遞送至所述 受試者以降低所述多肽的活性。
16.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中至少2種表1所列的多肽的表達(dá)和/或活性被 降低。
17.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中至少3種表1所列的多肽的表達(dá)和/或活性被 降低。
18.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述的一種或多種多肽選自SFRP2、JAK3和 FAP及其任何組合。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述多肽是SFRP2，并且通過(guò)將鈣依賴磷酸酶抑制劑遞送 至所述受試者而降低SFRP2的活性。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述鈣依賴磷酸酶抑制劑是他克莫司。
21.一種增加細(xì)胞中的血管生成的方法，所述方法包括增加所述細(xì)胞中表1所列的一 種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。
22.—種增加受試者組織中的血管生成的方法，所述方法包括增加所述受試者的所述 組織中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性。
23.權(quán)利要求21或22的方法，其中增加表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性 包括將編碼所述多肽的核酸遞送至所述受試者。
24.權(quán)利要求21或22的方法，其中增加表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性 包括將所述多肽遞送至所述受試者。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述受試者患有心血管疾病或經(jīng)歷過(guò)缺血或中風(fēng)。
26.一種在受試者的組織中檢測(cè)血管生成的方法，所述方法包括從所述組織中獲取樣 品，并測(cè)定所述樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，其中與對(duì)照樣品的表 達(dá)和/或活性水平相比，表達(dá)和/或活性增加表示血管生成。
27.—種診斷受試者中的癌癥的方法，所述方法包括從所述受試者中獲得組織樣品，并 測(cè)定所述樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，其中與對(duì)照樣品的表達(dá)和 /或活性水平相比，表達(dá)和/或活性增加指示癌癥。
28.權(quán)利要求沈或27的方法，其中所述方法包括測(cè)定表1所列的至少2種多肽的表達(dá) 和/或活性。
29.權(quán)利要求沈或27的方法，其中所述方法包括測(cè)定表1所列的至少5種多肽的表達(dá) 和/或活性。
30.權(quán)利要求沈或27的方法，其中所述方法包括測(cè)定表1所列的至少10種多肽的表 達(dá)和/或活性。
31.權(quán)利要求沈或27的方法，其中所述測(cè)定表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或 活性包括測(cè)定編碼所述一種或多種多肽的核酸的水平。
32.權(quán)利要求沈或27的方法，其中所述測(cè)定表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或 活性包括測(cè)定所述一種或多種多肽的水平。
33.權(quán)利要求沈或27的方法，其中在血管組織中測(cè)定所述表達(dá)和/或活性。
34.權(quán)利要求33的方法，其中在內(nèi)皮細(xì)胞和/或周細(xì)胞中測(cè)定所述表達(dá)和/或活性。
35.權(quán)利要求沈或27的方法，其中所述樣品選自血液、血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液 和汗液。
36.權(quán)利要求27的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
37.權(quán)利要求沈或27的方法，其中所述的一種或多種多肽選自SFRP2、JAK3和FAP。
38.一種測(cè)定受試者組織的血管生成潛力的方法，所述方法包括從所述受試者組織中 獲取樣品，并測(cè)定所述樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，其中與對(duì)照樣 品的表達(dá)和/或活性水平相比，表達(dá)和/或活性增加表示所述組織的血管生成潛力提高。
39.一種測(cè)定受試者中癌的轉(zhuǎn)移潛力的方法，所述方法包括從所述受試者的癌中獲取 組織樣品，并測(cè)定所述樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，其中與對(duì)照樣 品的表達(dá)和/或活性水平相比，表達(dá)和/或活性增加表示所述癌的轉(zhuǎn)移潛力提高。
40.一種監(jiān)測(cè)受試者中癌癥治療的有效性的方法，所述方法包括從已接受癌癥治療的 受試者中獲取樣品，測(cè)定所述樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，并將所 述表達(dá)和/或活性水平與對(duì)照樣品的表達(dá)和/或活性水平進(jìn)行比較，其中與對(duì)照樣品相比， 樣品中表達(dá)和/或活性水平降低表示治療有效。
41.一種監(jiān)測(cè)受試者中的癌癥進(jìn)展的方法，所述方法包括從患有癌癥的受試者中獲取 樣品，測(cè)定所述樣品中表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，并將所述表達(dá)和/或 活性水平與對(duì)照樣品的表達(dá)和/或活性水平進(jìn)行比較，其中與對(duì)照樣品相比，樣品的表達(dá) 和/或活性水平提高表示癌癥的進(jìn)展。
42.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)定表1所列的一種或多種多肽的表達(dá) 和/或活性包括測(cè)定編碼所述一種或多種多肽的核酸的水平。
43.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)定表1所列的一種或多種多肽的表達(dá) 和/或活性包括測(cè)定所述一種或多種多肽的水平。
44.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)的方法，其中在血管組織中測(cè)定所述表達(dá)和/或活性。
45.權(quán)利要求44的方法，其中在內(nèi)皮細(xì)胞和/或周細(xì)胞中測(cè)定所述表達(dá)和/或活性。
46.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
47.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種多肽選自SFRP2、JAK3和FAP。
48.一種鑒定調(diào)節(jié)血管生成的化合物的方法，所述方法包括在試驗(yàn)化合物存在和不存 在時(shí)，測(cè)定表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，并選出與所述化合物不存在時(shí)的 水平相比，所述一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性水平提高或降低的化合物作為調(diào)節(jié)血管 生成的化合物。
49.一種鑒定用于抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的化合物的方法，所述方法包括在試驗(yàn)化合物 存在和不存在時(shí)，測(cè)定表1所列的一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性，并選出與所述化合物 不存在時(shí)的水平相比所述一種或多種多肽的表達(dá)和/或活性水平提高或降低的化合物作 為用于抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的化合物。
50.權(quán)利要求48或49的方法，其中所述方法的至少一部分在細(xì)胞中進(jìn)行。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
53.一種核酸陣列，所述核酸陣列包含與編碼表1所列的至少2種多肽的多核苷酸雜交 的核酸。
54.一種抗體陣列，所述抗體陣列包含與表1所列的至少2種多肽特異結(jié)合的抗體。
55.一種與SFRP2特異結(jié)合的單克隆抗體。
56.權(quán)利要求55的單克隆抗體，所述單克隆抗體與人SFRP2特異結(jié)合。
57.權(quán)利要求56的單克隆抗體，所述單克隆抗體特異識(shí)別選自以下的表位氨 基酸 29-40(GQPDFSYRSNC(SEQ ID NO 1) )、85-96(KQCHPDTKKELC(SEQ ID NO :2))、 119-125 (VQVKDRC(SEQ IDNO :3))、138-152 (DMLECDRFPQDNDLC(SEQ ID NO :4))、 173-190(EACKNKNDDDNDIMETLC(SEQ ID NO 5)),202-220(EITYINRDTKIILETKSKT-Cys (SEQ ID NO 6))和 270-295 (ITSVKRWQKGQREFKRISRSIRKLQC(SEQ ID NO :7))。
58.一種用于評(píng)價(jià)血管生成的試劑盒，所述試劑盒包含用于測(cè)定表1所列的一種或多 種多肽的表達(dá)和/或活性的試劑。
59.一種用于診斷癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含用于測(cè)定表1所列的一種或多種多 肽的表達(dá)和/或活性的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定在腫瘤血管中表達(dá)增加的多核苷酸和多肽。本發(fā)明還涉及經(jīng)鑒定的多核苷酸和多肽以及多核苷酸和多肽的抑制劑在調(diào)節(jié)血管生成以及診斷和治療血管生成相關(guān)疾病(例如癌癥)中的用途。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102099491SQ200980128191
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日
發(fā)明者B·G·博恩, C·帕特森, N·K·德摩爾, R·巴蒂 申請(qǐng)人:北卡羅來(lái)納-查佩爾山大學(xué)