專利名稱：用于生產(chǎn)高容量重組腺病毒的自失活輔助性腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腺病毒載體領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，涉及通過(guò)使用自失活輔助性腺病毒的 第三代腺病毒載體或無(wú)腸(gutless)腺病毒載體的生產(chǎn)系統(tǒng)領(lǐng)域，其能允許通過(guò)使用輔助 性腺病毒在細(xì)胞中產(chǎn)生高容量腺病毒中污染最小的重組腺病毒。
背景技術(shù)：
高容量腺病毒(HC-Ad)，也被稱為無(wú)腸腺病毒或輔助病毒依賴型腺病毒，具有作 為基因治療的載體的能力，因?yàn)樵趪X類動(dòng)物和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物中它們都能維持高轉(zhuǎn)導(dǎo)效 率和其他腺病毒載體的向性，但是在感染的細(xì)胞中它們阻止與病毒蛋白表達(dá)相關(guān)的免疫原 性。此外，這些病毒載體具有插入目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的大容量(高達(dá)約361Λ)，其遠(yuǎn)高于其他病毒 載體的容量。高容量腺病毒載體是基于將其中所有病毒編碼序列“掏空”的腺病毒。這些載體 對(duì)腺病毒基因組末端區(qū)域(ITR，末端反向重復(fù)序列)和順式作用的包裝信號(hào)(Ψ)具有最低 的要求，ITR對(duì)于病毒復(fù)制是必要的。鑒于高容量腺病毒缺少所有的病毒編碼區(qū)域，所以其增殖需要使用刪除El區(qū)域 且提供反向病毒蛋白的輔助病毒。通過(guò)293細(xì)胞株的共轉(zhuǎn)染和協(xié)同感染進(jìn)行增殖，在增殖 時(shí)整合輔助病毒中刪除的El區(qū)域。然而，這個(gè)增殖系統(tǒng)也產(chǎn)生了不需要的病毒顆粒，其用殼體包裹輔助病毒基因組， 且污染了高容量腺病毒的最終制劑。輔助病毒的積累變化很大，但有時(shí)變得過(guò)于強(qiáng)烈以至 于取代了高容量腺病毒，這也是目前的生產(chǎn)方法對(duì)于臨床應(yīng)用不夠可靠的原因之一。其性 能是另一個(gè)限制因素，也部分地與輔助病毒的表象有關(guān)。直到現(xiàn)在才對(duì)用于減少輔助病毒 包裝效率的不同系統(tǒng)進(jìn)行開發(fā)和描述。這些系統(tǒng)一般都基于輔助病毒包裝信號(hào)的突變的合 并，基于基因組數(shù)量的增加，更特別的是基于病毒生產(chǎn)過(guò)程中包裝信號(hào)的特異性去除。Parks 等(Proc. Natl. Acad. ki. USA 1996 ；93 :13565-13570)描述 了通過(guò) Cre-IoxP重組系統(tǒng)去除輔助病毒的包裝信號(hào)Ψ的方法，其中所述病毒的信號(hào)Ψ兩側(cè)是 IoxP位點(diǎn)。如果在表達(dá)Cre重組酶的293細(xì)胞株中進(jìn)行增殖，重組酶將切除輔助病毒的信 號(hào)Ψ，阻止其進(jìn)行包裝，但這樣它保留了對(duì)于高容量腺病毒的包裝必要的編碼序列。可選擇 地，US 7，045，347和Ng等(Mol Ther 2001 3 :809-815)描述了基于輔助病毒的輔助病毒 失活系統(tǒng)，輔助病毒的包裝序列兩側(cè)具有FLP重組酶的frt識(shí)別位點(diǎn)，以使表達(dá)酵母FLP重 組酶的293細(xì)胞株中輔助病毒的增殖可引起包裝序列的切除。這些系統(tǒng)的缺點(diǎn)是重組酶催化的反應(yīng)是雙向的，由此能在輔助病毒的基因組中 再次引入包裝序列。為了阻止這個(gè)問題，Groth等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000:97: 5995-6000)提出使用單向重組酶，特別是WiiC31重組酶，使用特異性attB/attP識(shí)別序列 位于信號(hào)Ψ的兩側(cè)。當(dāng)WiiC31重組酶通過(guò)去除兩側(cè)為attB/attP位點(diǎn)的序列時(shí)，它更改 識(shí)別序列且將它們轉(zhuǎn)化為attR/attL序列，阻止識(shí)別再次發(fā)生(信號(hào)Ψ的重新引入)。然而，所有的方法都面臨著這樣的問題，S卩如果要去除輔助病毒的包裝序列則需要使位于宿主細(xì)胞基因組中編碼重組酶的序列表達(dá)。所述過(guò)程發(fā)生在病毒周期的一瞬間， 其中由于與腺病毒感染相關(guān)的細(xì)胞病變影響，細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)被部分抑制，因此可能達(dá) 不到消除所有輔助性腺病毒復(fù)制體的足夠高的胞內(nèi)重組酶水平。因此，提出了替代方法以阻止能夠被包裝的輔助性腺病毒的產(chǎn)生，或至少，延遲其 形成及無(wú)腸載體的形成。因此，專利文件W02007125146描述了前述方法的一種變型，其 中輔助性腺病毒載體包括一個(gè)位于包裝序列和與所述包裝序列最近的ITR之間的噬菌體 OC31 attB序列。即使不存在Φ031重組酶，包含所述attB位點(diǎn)將使與無(wú)腸腺病毒有關(guān) 的輔助性腺病毒的包裝延遲，這能減少在無(wú)腸病毒制備中污染的輔助性腺病毒的數(shù)量。然 而，這種方法只能使輔助性腺病毒的形成延遲，卻不能阻止有包裝能力的輔助性腺病毒的 形成。這個(gè)問題通過(guò)DE10159167所描述的腺病毒系統(tǒng)解決。在該系統(tǒng)中，重組酶由無(wú)腸 腺病毒編碼，而且輔助性腺病毒包括重組酶識(shí)別靶位點(diǎn)，其能限定一個(gè)包括包裝信號(hào)的區(qū) 域，而組酶識(shí)別靶位點(diǎn)的消除使存在于輔助性腺病毒3’端與表達(dá)沉默子有關(guān)的El腺病毒 基因接近AAV p5轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。因此，存在無(wú)腸腺病毒時(shí)，重組酶消除輔助性腺病毒基因組 中的包裝區(qū)域，同時(shí)允許El基因表達(dá)，其對(duì)于無(wú)腸腺病毒的包裝是必要的。然而，這個(gè)腺病 毒系統(tǒng)包括一個(gè)表達(dá)El的輔助病毒，因此，它是一種可復(fù)制病毒，而且比常規(guī)的輔助病毒 更危險(xiǎn)。此外，無(wú)腸病毒表達(dá)重組酶在潛在的臨床應(yīng)用的治療載體中是不必要的。另一個(gè)阻止包裝細(xì)胞對(duì)重組酶的依賴的可選擇的解決方案是使用由輔助病毒自 身編碼的重組酶。專利文件US20020072120描述了輔助性腺病毒載體編碼了一種通過(guò)Cre 重組酶形成的融合蛋白以及雌激素受體的配體結(jié)合域，所述融合蛋白由組成型啟動(dòng)子調(diào)控 的序列編碼。Cre-ER融合蛋白只能位移至細(xì)胞核且在有雌激素或類似物的存在下，發(fā)揮其 重組酶活性，借以消除用細(xì)胞表達(dá)重組酶的需求，同時(shí)通過(guò)向培養(yǎng)基中添加雌激素調(diào)節(jié)重 組酶活性從而阻止其毒性作用。因此，本領(lǐng)域需要能消除現(xiàn)有系統(tǒng)缺點(diǎn)的用于腺病毒載體的包裝系統(tǒng)，特別是能 夠最大化減少無(wú)腸腺病毒增殖期間產(chǎn)生輔助性腺病毒的方法。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明涉及一種多核苷酸，其包括a)編碼位點(diǎn)特異性重組酶的區(qū)域，其中所述區(qū)域由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控，以及b)對(duì)于腺病毒基因組的復(fù)制和/或包裝必不可少的區(qū)域，該腺病毒基因組的兩側(cè) 為對(duì)由序列a)編碼的重組酶具有特異性的識(shí)別序列，其中所述識(shí)別序列被定向，以使存在 所述重組酶時(shí)，切除所述重要區(qū)域。在第二方面，本發(fā)明涉及一種包括本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體。在第三方面，本發(fā)明涉及一種包括本發(fā)明多核苷酸序列的腺病毒顆粒。在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于自失活輔助性腺病毒復(fù)制和包裝的系統(tǒng)，其包 括a)根據(jù)本發(fā)明的一種多核苷酸、表達(dá)載體或腺病毒顆粒；以及b) 一個(gè)真核細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于獲得自失活輔助性腺病毒的方法，其包括
(i)在適合的條件下使細(xì)胞與本發(fā)明的一種多核苷酸、一個(gè)表達(dá)載體或一個(gè)腺病 毒顆粒及可選擇地一個(gè)或多個(gè)編碼對(duì)于細(xì)胞中腺病毒包裝或復(fù)制必要的腺病毒蛋白質(zhì)的 多核苷酸接觸，以使腺病毒基因組或包括所述基因組的多核苷酸進(jìn)入細(xì)胞，(ii)將該細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)臈l件下，允許細(xì)胞中腺病毒的包裝和復(fù)制，并阻止位 點(diǎn)特異性重組酶的表達(dá)，和(iii)從培養(yǎng)基中重新獲得腺病毒。在另一方面，本發(fā)明涉及一種根據(jù)前述段落所述的方法獲得的輔助性腺病毒。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的用于高容量腺病毒的生產(chǎn)和包裝的多核苷 酸、載體和腺病毒顆粒的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于高容量重組腺病毒生產(chǎn)的系統(tǒng)，其包括(a)根據(jù)本發(fā)明的一種多核苷酸、表達(dá)載體或腺病毒顆粒；(b) 一個(gè)腺病毒，其基因組包括目的基因且該腺病毒缺少編碼至少一個(gè)復(fù)制所需 的重要蛋白質(zhì)的序列，或缺少編碼至少一個(gè)對(duì)所述腺病毒包裝重要的蛋白質(zhì)的序列，或包 含所述腺病毒基因組的多核苷酸，和(c) 一個(gè)真核細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生表達(dá)目的基因的高容量腺病毒的方法，其包括 以下步驟(i)在適合條件下將一個(gè)細(xì)胞與一個(gè)腺病毒接觸，以使所述腺病毒基因組或包含 所述基因組的多核苷酸進(jìn)入該細(xì)胞，(ii)在適合條件下將所述細(xì)胞與選自下組中的第二組分接觸，(a) 一種多核苷酸，包括1.編碼位點(diǎn)特異性重組酶的區(qū)域，其中所述區(qū)域由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控，以及2. 一個(gè)腺病毒包裝信號(hào)Ψ，其兩側(cè)具有序列a)編碼的重組酶的特異性識(shí)別序列， 其中所述識(shí)別序列被定向，以使存在所述重組酶時(shí)，切除包裝信號(hào)Ψ，(b)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒載體，和(c)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒顆粒以使所述多核苷酸、所述腺病毒載體或所述腺病毒顆粒的基因組進(jìn)入該細(xì)胞中，(iii)將該細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)臈l件下，用于兩種病毒基因組編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)， 兩種腺病毒基因組的復(fù)制和步驟(ii)中使用的多核苷酸、載體或腺病毒編碼的重組酶的 表達(dá)。(iv)從細(xì)胞培養(yǎng)基中重新獲得高容量腺病毒。附圖簡(jiǎn)述

圖1示出了自失活輔助性腺病毒的操作方案。圖A示出了基于通過(guò)包裝細(xì)胞生產(chǎn) Cre的傳統(tǒng)方法。在強(qiáng)烈的病毒復(fù)制條件下，用于切除大量指數(shù)增殖的病毒基因組的包裝序 列，Cre的表達(dá)是不充分的。圖B示出了每個(gè)自失活輔助性病毒怎樣作為Cre基因的載體， 以使Cre的表達(dá)能力隨著病毒基因組的增加而增加。圖2示出了 Cre表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)的操作方案。組成型啟動(dòng)子(PGK)指導(dǎo)反式激活蛋 白rtTA-M2的表達(dá)。在誘導(dǎo)物(強(qiáng)力霉素)存在時(shí)，rtTA-M2 二聚化并激活調(diào)控Cre重組 酶的表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(tetO-pAlb)。PA，加尾序列。
圖3示出了蛋白質(zhì)tTS的操作方案。不存在強(qiáng)力霉素時(shí)，tTS與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子結(jié) 合并抑制Cre表達(dá)。當(dāng)添加強(qiáng)力霉素時(shí)，tTS失去與啟動(dòng)子的親和力，停止抑制Cre表達(dá)， 并允許二聚體介導(dǎo)激活反式激活蛋白。圖4示出了在293細(xì)胞株中tTS的穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)染表達(dá)tTS質(zhì)粒的293細(xì)胞株的 不同克隆的RNA被純化，并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)tTS mRNA的產(chǎn)生。包括cDNA的質(zhì)粒作為對(duì)照 組。MW，大小標(biāo)記物。圖5示出了在誘導(dǎo)型質(zhì)粒中Cre表達(dá)的調(diào)控。用標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞株在組 成型CMV啟動(dòng)子調(diào)控下pBS185表達(dá)Cre ；通過(guò)調(diào)控Cre表達(dá)，palbCre包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子； 在PGK啟動(dòng)子調(diào)控下pGKrtTA表達(dá)反式激活因子；prtTACre含有在一個(gè)或相同質(zhì)粒中Cre 和反式激活因子的表達(dá)框。在A中，所有的細(xì)胞都維持在強(qiáng)力霉素存在情況下。在B中，它 們?cè)诖嬖诨蛉狈?qiáng)力霉素下進(jìn)行比較。通過(guò)Western印跡檢測(cè)Cre表達(dá)。圖6示出了 AdTetCre病毒的圖示和其功能。包裝信號(hào)(Ψ)兩側(cè)是相同方向的 LoxP位點(diǎn)。rtTA-M2反式激活因子受小鼠PGK基因的組成型啟動(dòng)子調(diào)控，MerCreMer蛋白 受其TetO-palb誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控。存在強(qiáng)力霉素時(shí)，rtTA_M2反式激活因子二聚化并與 TetO-palb啟動(dòng)子結(jié)合。這激活了 MerCreMer蛋白的表達(dá)，存在他莫西芬時(shí)，MerCreMer蛋 白是有活性的，識(shí)別LoxP位點(diǎn)并消除阻止輔助性病毒衣殼化的包裝信號(hào)。ITR，末端反向重復(fù)。圖7示出了 pAdLoxPMerCre和pShutMer質(zhì)粒重組產(chǎn)生的AdTetCre病毒基因組。 在^3tTs細(xì)胞株中，pSiutMer和pAdLoxPMerCre質(zhì)粒均被I^acI限制性內(nèi)切酶酶切后共轉(zhuǎn) 染。重組發(fā)生在兩種質(zhì)粒的同源區(qū)域，感染腺病毒的基因組由MerCreMer完全表達(dá)框重建， 包裝信號(hào)兩側(cè)為L(zhǎng)oxP位點(diǎn)。圖8示出了 AdTetCre病毒中MerCreMer蛋白表達(dá)的調(diào)控。在存在(系7-9)或缺 乏(系4-6)他莫西芬和強(qiáng)力霉素的處理下，293tTs細(xì)胞株被AdTetCre病毒以2病毒/細(xì) 胞的MOI感染48小時(shí)。293細(xì)胞株提取物加載到系2，以驗(yàn)證具有抗體的野生型重組酶的 檢測(cè)。^3tTs細(xì)胞株在系3被pANMerCreMer質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。系1對(duì)應(yīng)于未感染的293細(xì)胞株， 作為陰性對(duì)照。通過(guò)免疫印跡檢測(cè)Cre和MerCreMer的表達(dá)。圖9示出了 AdTetCre病毒的生產(chǎn)的調(diào)控。^3tTs、293和^3Cre4細(xì)胞株被以2 病毒/細(xì)胞的MOI的AdTetCre病毒感染48小時(shí)，在細(xì)胞提取物中量化感染性病毒的產(chǎn)生。 該細(xì)胞株先接受M小時(shí)的強(qiáng)力霉素(Dox)、他莫西芬(Tam)、兩種同時(shí)(T/D)的處理或在該 階段不進(jìn)行處理(對(duì)照)，如圖所示。在感染期間仍保持處理。圖10示出了與標(biāo)準(zhǔn)輔助性腺病毒相比，AdTetCre病毒的生產(chǎn)的調(diào)控。293tTs,293 和293Cre4細(xì)胞株被以2病毒/細(xì)胞的MOI的AdTetCre或AdLC8cluc病毒感染。該細(xì)胞 株先接受M小時(shí)的強(qiáng)力霉素和他莫西芬(T/D)處理或在該時(shí)期不進(jìn)行處理(對(duì)照)，如圖 所示。在感染期間仍保持處理。在48小時(shí)結(jié)束時(shí)，在細(xì)胞提取物中量化感染病毒的產(chǎn)生。圖11示出了 AdTetCre和AdLC8cluc病毒的包裝信號(hào)的切除。(A) 293細(xì)胞株被 AdTetCre病毒以2病毒/細(xì)胞的MOI感染48小時(shí)。該細(xì)胞株先接受M小時(shí)的強(qiáng)力霉素和 他莫西芬(系4)處理或在該時(shí)期不進(jìn)行處理(系幻，如圖所示。在感染期間仍保持處理，感 染期后感染細(xì)胞的DNA被提取，且通過(guò)PCR擴(kuò)增與病毒基因組前端相關(guān)的區(qū)域。以pShutMer 質(zhì)粒作為PCR產(chǎn)物的模板，該質(zhì)粒包括基因組(系2)或產(chǎn)生于四3 8細(xì)胞株(系1)中的純化的AdTetCre病毒的相同區(qū)域，作為對(duì)照。(B) 293Cre4細(xì)胞株(系2)被AdLC8cluc病 毒以2病毒/細(xì)胞的MOI感染，其DNA在48小時(shí)后提取。進(jìn)行如前一節(jié)所述的PCR分析。 產(chǎn)生于293細(xì)胞株(系1)中的純化的AdLCScluc病毒的DNA，作為對(duì)照。對(duì)應(yīng)具有完整或 切除包裝信號(hào)的片段大小分別由黑色或白色箭頭指示。圖12示出了在HC-Ad生產(chǎn)中AdTetCre病毒的應(yīng)用。(A) 293Cre4細(xì)胞株與包括 HC-Ad KCZ基因組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，6小時(shí)后它們被AdTetCre輔助性病毒以MOI 1感染。所述 細(xì)胞株在48小時(shí)后收集(0代)。前一代的裂解物應(yīng)用于連續(xù)的代中與MOI 1的AdTetCre 病毒一起感染更多的^3Cre4細(xì)胞株。在60mm板中進(jìn)行0-3代的培養(yǎng)。在2個(gè)150mm板 中進(jìn)行4代培養(yǎng)，在8個(gè)150mm板中進(jìn)行5代培養(yǎng)，并且在相當(dāng)于30個(gè)的150mm板中進(jìn)行 6代培養(yǎng)。每代中KCZ和AdTetCre病毒的數(shù)量通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行定量。在所有情況 下，細(xì)胞株都進(jìn)行強(qiáng)力霉素和他莫西芬處理。(B) 293細(xì)胞株也通過(guò)相同的方案產(chǎn)生4代。 (C)293Cre4細(xì)胞株通過(guò)相同的方案使用AdLCScluc輔助性病毒而不進(jìn)行強(qiáng)力霉素和他莫 西芬處理。圖13示出了 AdTetCre病毒中MerCreMer蛋白的表達(dá)動(dòng)力學(xué)。293細(xì)胞株接受M 小時(shí)強(qiáng)力霉素和他莫西芬的預(yù)處理，此后它們被AdTetCre病毒以2病毒/細(xì)胞的MOI感染。 在6、12、36和48小時(shí)后，收集細(xì)胞并通過(guò)免疫印跡分析MerCreMer表達(dá)。未感染的293細(xì) 胞株的提取物為對(duì)照系。發(fā)明詳述本發(fā)明已經(jīng)示出輔助性腺病毒載體能令人驚訝地允許產(chǎn)生具有輔助病毒的低污 染的無(wú)腸腺病毒，所述輔助性腺病毒載體中的包裝序列兩側(cè)為重組酶的目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)，且 其還包括一編碼重組酶的序列，其中所述序列與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相關(guān)。與任何理論都不相關(guān)， 認(rèn)為在實(shí)際輔助性腺病毒中的編碼序列允許重組酶表達(dá)的增加而平行地增加實(shí)際病毒的 復(fù)制體，所以總有足夠數(shù)量的重組酶切除輔助性腺病毒基因組所有復(fù)制體的包裝序列，并 且總是對(duì)由實(shí)際病毒引起的細(xì)胞蛋白表達(dá)的抑制不敏感。圖1示出了傳統(tǒng)腺病毒包裝方法 的比較方案，其中重組酶由細(xì)胞表達(dá)，在細(xì)胞中進(jìn)行所述包裝(左圖)或根據(jù)本發(fā)明的方 法，重組酶由實(shí)際輔助病毒的基因組表達(dá)(右圖)。實(shí)驗(yàn)部分描述了一種示例性的實(shí)施方式 (見實(shí)施例幻，包括本發(fā)明特征的腺病毒依賴于培養(yǎng)基中強(qiáng)力霉素的存在表達(dá)重組酶。本發(fā)明的多核苷酸因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種多核苷酸，其包括i)編碼位點(diǎn)特異性重組酶的區(qū)域，其中所述區(qū)域由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控，以及ii)對(duì)于腺病毒基因組的復(fù)制和/或包裝必不可少的區(qū)域，該腺病毒基因組的兩 側(cè)為對(duì)序列a)編碼的重組酶具有特異性的識(shí)別序列，其中所述識(shí)別序列被定向，以使在所 述重組酶時(shí)，切除所述重要區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，位點(diǎn)特異性重組酶應(yīng)理解為是一種能夠促進(jìn)對(duì)于所述酶的靶位點(diǎn)間 進(jìn)行特異性重組的蛋白質(zhì)。適合用于本發(fā)明的重組酶包括Pl噬菌體(LoxP)的Cre重組酶、 釀酒酵母(Frt)的FLP重組酶、來(lái)自鏈霉菌屬Φ031噬菌體(attB，attP)的整合酶、TP901-1 重組酶、R4重組酶或λ整合酶。在一優(yōu)選實(shí)施例中，由本發(fā)明的多核苷酸編碼的重組酶是 Cre 重組酶，其包括最初由 Abreinski 和 Hoess (J. Biol. Chem. 1984,259 :1509-1514)描述 的Pl噬菌體的Cre重組酶和包括重組酶序列和一調(diào)控重組酶活性的第二多肽的融合蛋白。該Cre重組酶，無(wú)論是作為自身使用時(shí)，還是作為融合蛋白的形式使用，都可以被改性以使 其對(duì)于靶序列有更廣泛的特異性，如W02000060091中所描述的那樣。如果本發(fā)明的核苷酸包括一編碼融合蛋白的序列，所述融合蛋白包括一重組酶， 將多肽用作激活核定位序列是可能的，也就是，它們只在特定配體存在時(shí)發(fā)揮作用。因此， 可自由地調(diào)節(jié)重組酶活性，以使其在只在所述配體存在時(shí)位移到細(xì)胞核并發(fā)揮活性。在一 優(yōu)選實(shí)施例中，可激活核定位序列來(lái)自核受體。適合用于本發(fā)明的核定位序列包括以下定 位序列，它們來(lái)自于PPAR(過(guò)氧化物酶體增殖因子激活受體)，其在15-脫氧-[δ ]-前列腺 素J2存在時(shí)位移到細(xì)胞核；維甲酸受體，其在存在9-順式維甲酸的α，β或Y異構(gòu)體時(shí) 位移到細(xì)胞核；由維甲酸和TTNPB激活的法尼醇X受體；由24-羥基膽固醇激活的肝X受 體；由4-氨基丁基苯甲酸激活的苯甲酸X受體；由16-氰基孕烯醇酮誘導(dǎo)的組成型雄烷受 體，孕烷受體；由利福平誘導(dǎo)的類固醇和異型生物質(zhì)受體；由甲羥基孕酮、米非司酮致效劑 和拮抗劑、19-炔諾酮衍生物誘導(dǎo)的黃體酮受體；由糖皮質(zhì)激素激活的糖皮質(zhì)激素受體；由 Τ3和/或Τ4激活的甲狀腺激素受體；由雌激素和其衍生物如17 β -雌二醇和雌二醇激活 的雌激素受體?？商娲兀部梢允褂猛ㄟ^(guò)與其他蛋白結(jié)合而失活的融合蛋白，且在配體存 在時(shí)，其與所述其他蛋白分離，從而導(dǎo)致融合蛋白的誘導(dǎo)活化?？杉せ詈硕ㄎ恍蛄袃?yōu)選地對(duì)應(yīng)于雌激素受體的配體結(jié)合域，如W002^175中所 述。在本發(fā)明的上下文中，“配體結(jié)合域”可理解為雌激素受體的雌激素結(jié)合域序列，而且 優(yōu)選其變體包括一個(gè)或幾個(gè)由一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的插入、刪除和/或替換所引起的基因突 變，但是在特定配體存在時(shí)，其仍能夠大體上完整地位移到細(xì)胞核，盡管變體的優(yōu)選配體可 以根據(jù)野生型受體的配體變化。因此，本發(fā)明主要考慮優(yōu)選對(duì)應(yīng)于雌激素受體(雌二醇、雌 素三醇或雌素酮)天然配體或不同致效劑和拮抗劑的核定位序列的應(yīng)用，如他莫昔芬、ICI 164384、RU 54876,己烯雌酚、雷洛昔芬、珠氯米芬和托瑞米芬。重組酶和核定位序列可在與融合蛋白其他組分有關(guān)的任何相關(guān)位置被發(fā)現(xiàn)。因 此，本發(fā)明主要考慮編碼融合蛋白的多核苷酸，其中核定位序列的C-末端區(qū)域與重組酶的 N-末端區(qū)域相連接，編碼融合蛋白的多核苷酸，其中重組酶的C-末端區(qū)域與核定位序列的 N-末端區(qū)域相連接，而且優(yōu)選地編碼融合蛋白的多核苷酸序列由重組酶構(gòu)成，所述重組酶 兩側(cè)具有相同的或不同的核定位序列，然而它們優(yōu)選是相同的。另外，本發(fā)明還主要考慮核 定位序列變體的應(yīng)用，其示出了與野生型受體的核定位序列不同配體的親和力。因此，本發(fā) 明主要考慮包括G512R突變(根據(jù)人類雌激素受體編號(hào))的雌激素受體的配體結(jié)合域的序 列的應(yīng)用。該突變引起配體結(jié)合域?qū)μ烊慌潴w的親和力，其比野生型受體的配體結(jié)合域所 示出的少1000倍，但是不影響其對(duì)4-羥基他莫昔芬的親和力。因此，可以通過(guò)使用4-羥 基他莫昔芬促進(jìn)具有重組酶活性蛋白的融合蛋白的位移，而不影響包裝細(xì)胞對(duì)雌激素的可 能響應(yīng)?？商娲兀萍に厥荏w的配體結(jié)合域可包括G400V/MM3A/LM4A突變，其產(chǎn)生一個(gè) 比細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)敏感10倍的配體結(jié)合域，且使用4倍低于激活G512R突變細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)所必需 的的劑量激活。所述配體結(jié)合域可替代地包括M543和L544A突變，其產(chǎn)生一與他莫昔芬和 4-羥基他莫昔芬的敏感度10倍高于G400V/MM3A/LM4A突變所示的分子。在一優(yōu)選實(shí)施 例中，可激活核定位序列為人類雌激素受體(Metger等，1995，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92 :6991-6995)或 G521R變體(Feil 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93 :10887-10890) 的配體結(jié)合域。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，重組酶包括由雌激素激活的核定位序列的G525R變體，所述雌激素來(lái)源于小鼠雌激素受體(所述受體的氨基酸觀1_599)在所述蛋白的末端， 諸如，例如 Verrou 等(Biol. Chem.，1999，380 :1435-1438)和 Louet M.等 Ofepatology, 2002 ；35 ；1072-1081)詳細(xì)描述的MerCreMer蛋白，其內(nèi)容通過(guò)參考引入本文中。本發(fā)明的多核苷酸包括一編碼重組酶的序列，且其被一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控。在本 發(fā)明的上下文中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子理解為存在一化合物或特定條件時(shí)，能夠促進(jìn)位于3’端的 多核苷酸轉(zhuǎn)錄的任何DNA序列。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是響 應(yīng)于誘導(dǎo)劑的，在缺乏誘導(dǎo)劑時(shí)表現(xiàn)為不表達(dá)或不重要的基礎(chǔ)表達(dá)，且該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能 夠促進(jìn)位于3’端的基因的活化。根據(jù)誘導(dǎo)劑的類型，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子被分為四環(huán)素(Tet) 開 / 關(guān)啟動(dòng)子(Gossen, M. and H. Bujard(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :5547-5551 ； Gossen，M.et al.，1995，Science 268 :1766-1769 ；Rossi,F. Μ. V.和 H. M. Blau，1998，Curr. Opin.Biotechnol. 9 :451-456) ；Pip 開 / 關(guān)啟動(dòng)子(US 6, 287,813)；抗孕酮依賴型啟動(dòng) 子(US 2004132086)；蛻皮素依賴型啟動(dòng)子(Christopherson 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :6314-6318 ；No 等，1996，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 :3346-3351, Suhr 等， 1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,95 :7999-8004 和 W09738117)；金屬硫蛋白依賴型啟動(dòng)子 (W08604920)和雷帕霉素依賴型啟動(dòng)子(Rivera 等，1996，Nat. Med. 2 :1028-32)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是一四環(huán)素依賴型系統(tǒng)。該系統(tǒng)允許通過(guò)四環(huán) 素或其衍生物例如強(qiáng)力霉素調(diào)節(jié)的方式達(dá)到高表達(dá)水平。在該系統(tǒng)中，存在強(qiáng)力霉素時(shí)基 因表達(dá)被激活，缺乏強(qiáng)力霉素時(shí)基因不表達(dá)。該系統(tǒng)基于兩個(gè)發(fā)生在大腸桿菌四環(huán)素抗性 操縱子的調(diào)節(jié)元件，具體地，與四環(huán)素阻遏物結(jié)合的四環(huán)素調(diào)節(jié)序列。目的基因在關(guān)于包括 幾個(gè)四環(huán)素敏感元件的啟動(dòng)子的3’端被克隆。第二質(zhì)粒包括編碼調(diào)節(jié)元件的序列，其被稱 作為四環(huán)素-調(diào)控反式作用因子，該反式作用因子由單純皰疹病毒的VP16轉(zhuǎn)錄因子和野生 型四環(huán)素阻遏物(rtTA-M2，Zabala等描述，Cancer Res. ,64 :2799-2804)組成。因此，存在 強(qiáng)力霉素時(shí)，四環(huán)素阻遏物和VP16與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相互作用促進(jìn)位于啟動(dòng)子3’端的基因 轉(zhuǎn)錄，形成融合蛋白。優(yōu)選地幾個(gè)四環(huán)素操縱子(TetO)的復(fù)制體融合成最小啟動(dòng)子形成所 述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如CMV最小啟動(dòng)子，人類乙型肝炎病毒中心蛋白的四個(gè)堿基對(duì)的啟動(dòng) 子，或196或84堿基對(duì)小鼠白蛋白基因的5’區(qū)域的啟動(dòng)子，或白蛋白啟動(dòng)子(Zabala等， 2004,supra)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是四環(huán)素應(yīng)答的反式作用因子能被用于包裝的細(xì)胞 基因組編碼，被實(shí)際的多核苷酸編碼，該多核苷酸包括在對(duì)四環(huán)素敏感的啟動(dòng)子調(diào)控下編 碼重組酶的序列，或在一優(yōu)選實(shí)施例中，兩者均可編碼。反式作用因子產(chǎn)生的量依賴于細(xì) 胞中腺病毒基因組復(fù)制體的數(shù)量，其反過(guò)來(lái)使反式作用因子的量適應(yīng)細(xì)胞中存在的啟動(dòng)子 的量。編碼反式作用因子的序列由一組成型啟動(dòng)子調(diào)控。組成型啟動(dòng)子適合于調(diào)控配體 依賴型反式作用因子，其中它們是巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、二氫葉酸還原酶 (DHFR)啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、延伸因子Ia(EFla)啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng) 子、載脂蛋白Al(ApoAl)啟動(dòng)子、角蛋白啟動(dòng)子、CD3啟動(dòng)子、免疫球蛋白重鏈或輕鏈啟動(dòng) 子、神經(jīng)絲啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異性烯醇化酶啟動(dòng)子、L7啟動(dòng)子、CD2啟動(dòng)子、肌球蛋白輕鏈激 酶啟動(dòng)子、HOX基因啟動(dòng)子、胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動(dòng)子、RNA聚合酶II啟動(dòng)子、MyoD基 因啟動(dòng)子、磷酸甘油激酶(PGK)基因啟動(dòng)子、低密度脂蛋白(LDL)啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白基因啟 動(dòng)子。在一優(yōu)選實(shí)施例中，調(diào)控反式作用因子表達(dá)的啟動(dòng)子是PGK基因啟動(dòng)子。
本發(fā)明的多核苷酸還包括一腺病毒復(fù)制和/或包裝的重要區(qū)域，其兩側(cè)具有所述 多核苷酸編碼的重組酶的靶位點(diǎn)。對(duì)于所述基因組的復(fù)制和/或包裝重要的腺病毒基因組 區(qū)域包括末端反向重復(fù)序列(ITR)和腺病毒包裝信號(hào)Ψ。根據(jù)本發(fā)明，末端反向重復(fù)序列或ITR應(yīng)被理解為大約100堿基對(duì)的序列，其在腺 病毒線性基因組的兩側(cè)且對(duì)于腺病毒基因組的復(fù)制很重要(Stow，N. D. ,1982, Nucl. Acid. Res, 10 :5105-5109)。根據(jù)本發(fā)明，腺病毒包裝信號(hào)Ψ應(yīng)被理解為大約160堿基對(duì)長(zhǎng)的序列，在2和5 血清型腺病毒的情況下，其在基因組的190到350之間的位置延伸。腺病毒基因組序列的 切除阻止在病毒增殖過(guò)程中產(chǎn)生的DNA分子有效地整合到新形成的衣殼(Hearing，P.等， 1987，J.Virol. ,61 :2555-2558)，但是不能阻止包裝細(xì)胞中所述基因組的復(fù)制，與ITRs的 切除不同。在一優(yōu)選實(shí)施例中，形成本發(fā)明多核苷酸部分的腺病毒基因組序列是腺病毒包裝 信號(hào)。顯而易見地，兩側(cè)為腺病毒包裝信號(hào)的相應(yīng)的靶位點(diǎn)必須基于本發(fā)明多核苷酸編碼 的重組酶進(jìn)行選擇。因此，如果多核苷酸編碼的重組酶為Cre重組酶，包裝序列的兩側(cè)必須 為L(zhǎng)oxP位點(diǎn)。如果多核苷酸編碼的重組酶為FLP重組酶，包裝序列的兩側(cè)必須為FLP位點(diǎn)。 在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明多核苷酸編碼的重組酶為Cre重組酶，且包裝信號(hào)Ψ兩側(cè)為同 向的所述重組酶的靶位點(diǎn)(LoxP位點(diǎn))，以切除兩位點(diǎn)之間的序列。LoxP位點(diǎn)由34個(gè)堿基對(duì)的序列構(gòu)成，該34個(gè)堿基對(duì)由8個(gè)堿基對(duì)的中心區(qū)域和 其兩側(cè)的兩個(gè)13個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)序列依次構(gòu)成。本發(fā)明還主要考慮了野生型LoxP 序列變體的應(yīng)用，其不能與LoxP序列進(jìn)行重組，但是其只能與相同的LoxP變體重組，如 W0199925851和W02007085906所述。當(dāng)將被用作腺病毒包裝的細(xì)胞包括其基因組中兩側(cè) 為野生型LoxP序列的區(qū)域時(shí)，變體LoxP序列尤其重要。本發(fā)明使用的變體LoxP序列包括 IoxP、1οχΡ2、1οχΡ511、1οχΡ514、loxB、loxC2、loxL、loxR、1οχΑ86、1οχΑ117、loxP3 和 1οχΡ23 序列。本發(fā)明的輔助性腺病毒載體前面所述本發(fā)明的多核苷酸能構(gòu)成表達(dá)載體的部分或用于構(gòu)建表達(dá)載體，該表達(dá) 載體包括其作為腺病毒載體發(fā)揮作用時(shí)必要的序列。因此，本發(fā)明的另一方面涉及一包括 本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施例中，包括本發(fā)明多核苷酸的載體是一輔助性 腺病毒載體。在本發(fā)明的上下文中，“輔助性載體”應(yīng)被理解為能夠部分或完全與重組病毒載體 反式互補(bǔ)的載體，該重組病毒載體不能被復(fù)制。因此，它是一遲早能夠產(chǎn)生至少一個(gè)多肽的 載體，該多肽不能由重組載體產(chǎn)生但對(duì)病毒顆粒的形成是必要的。輔助性載體與腺病毒載 體完全互補(bǔ)，也就是說(shuō)，輔助性載體能夠提供腺病毒載體缺少的對(duì)腺病毒復(fù)制必不可少的 所有組分，或輔助性載體只能與腺病毒載體部分互補(bǔ)，也就是說(shuō)，其只能補(bǔ)充腺病毒載體缺 少的部分功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是輔助性腺病毒載體的序列依賴于所應(yīng)用的腺病毒載 體，考慮到依賴于腺病毒載體中缺少的腺病毒基因組的編碼序列的數(shù)量，輔助性載體必須 包括更高或更低數(shù)量的序列以允許所述腺病毒載體的復(fù)制和包裝。如果腺病毒載體是一無(wú) 腸載體(也被認(rèn)為是高容量腺病毒載體或輔助病毒依賴型載體)，本發(fā)明的輔助性載體必須包括幾乎所有的早期和晚期腺病毒轉(zhuǎn)錄區(qū)域，不包括對(duì)體外病毒復(fù)制不是必須的早期的 E3區(qū)域和可有包裝細(xì)胞提供的El區(qū)域。在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的輔助性載體包括第一 代腺病毒載體的基因組，其特征在于，缺少El和E3蛋白的編碼序列，其中插入編碼重組酶 的基因取代了 El蛋白的編碼區(qū)域。因此，本發(fā)明的輔助性腺病毒載體包括下述組分-5’末端反向重復(fù)序列，-兩側(cè)為重組酶識(shí)別靶位點(diǎn)的包裝信號(hào)Ψ，-由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的重組酶序列，-除了El和Ε3區(qū)域的腺病毒編碼序列，-3’末端反向重復(fù)序列.在一優(yōu)選實(shí)施例中，輔助性腺病毒的基因組編碼一反式作用因子，其能夠在配體 存在時(shí)促進(jìn)重組酶的表達(dá)。在一更優(yōu)選實(shí)施例中，反式作用因子為rtTA-M2反式作用因子， 由與單純皰疹病毒的VP16蛋白相結(jié)合的四環(huán)素阻遏物構(gòu)成，在該情況下存在四環(huán)素類似 物，優(yōu)選為強(qiáng)力霉素時(shí)，進(jìn)行所述方法的步驟(iii)。圖2提供了本發(fā)明腺病毒載體的圖示，其包括在PGK基因啟動(dòng)子的調(diào)控下編碼轉(zhuǎn) 錄反式作用因子的序列，且其中重組酶受一啟動(dòng)子調(diào)控，該啟動(dòng)子由幾個(gè)四環(huán)素重復(fù)序列 和白蛋白基因最小啟動(dòng)子相結(jié)合組成。優(yōu)選地包裝信號(hào)Ψ兩側(cè)為L(zhǎng)oxP位點(diǎn)。在一更優(yōu)選實(shí)施例中，重組酶為Cre重組 酶或MerCreMer重組酶，其受一啟動(dòng)子調(diào)控，該啟動(dòng)子由一系列TetO操縱子重復(fù)序列和例 如白蛋白啟動(dòng)子的小啟動(dòng)子構(gòu)成。還可能使用兩側(cè)為重組酶靶位點(diǎn)的衰減包裝序列。這些 信號(hào)顯示了被衣殼化的較低能力，且可如W094^152所述，通過(guò)去除包裝區(qū)域而獲得。對(duì)于位于所述腺病毒基因組的另一重要區(qū)域的額外的重組酶識(shí)別靶位點(diǎn)，例如 ITR區(qū)域，還可能通過(guò)使用一對(duì)重組酶識(shí)別靶位點(diǎn)增加輔助性載體的安全性，以使重組酶的 存在引起對(duì)于腺病毒的復(fù)制或衣殼化必需的多個(gè)腺病毒基因組區(qū)域的切除。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是輔助性載體是一可復(fù)制病毒，也就是，它具有所有 對(duì)其復(fù)制和包裝重要的基因，或者它是缺失一個(gè)或幾個(gè)基因的缺陷型腺病毒，可阻止周圍 環(huán)境中腺病毒載體的可能增殖。考慮到這些蛋白質(zhì)對(duì)腺病毒的增殖很重要，它們必須以反 式提供，優(yōu)選地通過(guò)用于包裝的細(xì)胞提供。適合此目的的細(xì)胞系為來(lái)自于人類胚胎腎細(xì)胞 的293細(xì)胞系(Graham等，1977，J. Gene. Virol. 36，59-72)，考慮到它在其基因組中包括 5型腺病毒的5’末端其能補(bǔ)充El功能，能補(bǔ)充腺病毒El和/或E4功能的W162細(xì)胞系 (Weinberg 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983,80 :5383-5386)，能補(bǔ)充 5 型腺病毒全部基 因組或El和E4功能的細(xì)胞系(W09^8152)，N52系，Perc系及其類似物。本發(fā)明的輔助性腺病毒載體可被視為包括所有前述功能的多核苷酸，或可替代 地，如果多核苷酸已通過(guò)在允許細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染生成或擴(kuò)增，它將引起整個(gè)腺病毒顆粒的生 成，該腺病毒顆粒能從包裝細(xì)胞中重新獲得，且代替多核苷酸作為輔助性載體。因此，在 另一方面，本發(fā)明涉及一包括本發(fā)明多核苷酸序列的腺病毒顆粒。在本發(fā)明的上下文中， 腺病毒顆粒應(yīng)被理解為一由構(gòu)成腺病毒基因組的雙鏈DNA分子構(gòu)成的顆粒，如已經(jīng)被描 述的那樣，例如，Shenk, T. (Adenoviridae :The viruses and their replication，1996， In Fields Virology. B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley, eds. (Lippincott-Raven， Philadelphia，PA)pp. 2111-2147)。
^mnmm十牛白_■誠(chéng)本發(fā)明輔助性載體可通過(guò)在允許的真核細(xì)胞(permissive eukaryotic cells)中 的連續(xù)復(fù)制循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及一腺病毒重組體的復(fù)制和包裝的 系統(tǒng)，其包括a) 一種本發(fā)明的多核苷酸，一個(gè)本發(fā)明的表達(dá)載體或一個(gè)本發(fā)明的腺病毒顆粒， 以及b) 一個(gè)真核細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是真核細(xì)胞中腺病毒的復(fù)制需要本發(fā)明多核苷酸編 碼的重組酶不能表達(dá)，鑒于如果重組酶表達(dá)，它將引起腺病毒基因組區(qū)域的切除，該區(qū)域兩 側(cè)為所述重組酶的靶位點(diǎn)，其將阻止新的輔助病毒的增殖。如果編碼重組酶的序列受四環(huán) 素操縱子的調(diào)控，后者具有較低的基礎(chǔ)表達(dá)水平。然而，如果進(jìn)行輔助性腺病毒增殖的細(xì)胞 表達(dá)四環(huán)素-依賴型阻遏物，則該基礎(chǔ)表達(dá)將被進(jìn)一步降低，其中四環(huán)素-依賴型阻遏物能 夠在缺乏強(qiáng)力霉素時(shí)阻止四環(huán)素操縱子3’末端基因的轉(zhuǎn)錄。因此，在一優(yōu)選實(shí)施例中，根 據(jù)本發(fā)明形成用于腺病毒復(fù)制系統(tǒng)的組分(b)的細(xì)胞包括調(diào)控位點(diǎn)特異性重組酶表達(dá)的 啟動(dòng)子特異性轉(zhuǎn)錄阻遏物。在一優(yōu)選實(shí)施例中，如果調(diào)控重組酶表達(dá)的啟動(dòng)子是由四環(huán)素 或其類似物(強(qiáng)力霉素)激活的啟動(dòng)子，那么表達(dá)包裝細(xì)胞的阻遏物是在缺乏所述配體時(shí) 被激活的阻遏物。因此，在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的包裝細(xì)胞包含一表達(dá)四環(huán)素-依賴型 阻遏物的多核苷酸，在缺乏四環(huán)素或強(qiáng)力霉素時(shí)，其與Tet操縱子結(jié)合，阻遏轉(zhuǎn)錄。Tet操縱 子特異性阻遏物優(yōu)選為rtTS阻遏物。在一更優(yōu)選實(shí)施例中，rtTS阻遏物由組成型啟動(dòng)子 操控。調(diào)控rtTS表達(dá)的啟動(dòng)子優(yōu)選為真核延伸因子EFla啟動(dòng)子。圖3的左圖示出了缺乏強(qiáng)力霉素時(shí)編碼重組酶的基因表達(dá)的抑制機(jī)制。另外，如果重組酶包括可激活核定位序列，輔助性腺病毒的增殖一定在缺乏能激 活所述核定位序列的配體時(shí)發(fā)生，這樣，即使由于所述基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄而存在最低數(shù)量的 重組酶，其仍然在細(xì)胞質(zhì)中且不能對(duì)腺病毒基因組發(fā)揮其重組酶活性。本發(fā)明的輔助性載體和其包裝系統(tǒng)可用于擴(kuò)增所述載體。因此，在另一方面，本發(fā) 明涉及一種獲得輔助性重組腺病毒的方法(下文中本發(fā)明的第一種方法)，其包括(i)在適合的條件下使細(xì)胞與本發(fā)明的一種多核苷酸、一個(gè)表達(dá)載體或一個(gè)腺病 毒顆粒及可選擇地一個(gè)或多個(gè)編碼對(duì)于細(xì)胞中腺病毒包裝或復(fù)制必要的腺病毒蛋白質(zhì)的 多核苷酸接觸，以使腺病毒基因組或包括所述基因組的多核苷酸進(jìn)入細(xì)胞，(ii)將該細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)臈l件下，允許細(xì)胞中腺病毒的包裝和復(fù)制，并阻止位 點(diǎn)特異性重組酶的表達(dá)，和(iii)從培養(yǎng)基中重新獲得腺病毒。本發(fā)明第一種方法的步驟(i)包括將所述腺病毒的基因組引入到細(xì)胞中。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)該理解的是步驟(i)的不同實(shí)施依賴于所述腺病毒基因組的不同形式。如果所 述基因組是一多核苷酸，步驟(i)包括將所述多核苷酸在允許其進(jìn)入細(xì)胞的條件下與細(xì)胞 接觸?？赏ㄟ^(guò)包括多核苷酸的組分的微注射進(jìn)行轉(zhuǎn)染，或可替代地，在磷酸鈣或氯化鈣存在 的條件下通過(guò)共沉淀進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)由DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，電穿孔法及基 于前述技術(shù)的一系列商用的轉(zhuǎn)染試劑盒。轉(zhuǎn)染效率取決于一系列因素，包括細(xì)胞類型、代 數(shù)、融合狀態(tài)及轉(zhuǎn)染條件(時(shí)間、脂質(zhì)體或沉淀物的制備形式等)。所有這些參數(shù)可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定和調(diào)整。如果腺病毒載體是根據(jù)本發(fā)明的腺病毒顆粒，將腺病毒與細(xì)胞接觸已足以使腺病 毒自然地感染細(xì)胞。優(yōu)選地在許多的病毒顆粒/細(xì)胞比率(感染復(fù)數(shù)或Μ0Ι)下將病毒與 細(xì)胞接觸，該比率至少約為1、2、10、20、30、50、100、200、2000或其他合適的MOI值，以使培 養(yǎng)基中所有細(xì)胞都基本上被感染。如果輔助性腺病毒載體缺少任何編碼對(duì)于其復(fù)制和/或包裝重要的組分的序列， 則有必要提供反式的所述組分。優(yōu)選地，該組分由多核苷酸的表達(dá)提供，多核苷酸構(gòu)成用 作包裝的細(xì)胞的基因組的部分。因此，在腺病毒載體的基因組缺少El和/或E4區(qū)域時(shí)， 本發(fā)明方法的步驟(i)中使用的細(xì)胞是，屬于四3的細(xì)胞系(Graham等，1977，J. Gene. Virol. 36,59-72)和 W162 細(xì)胞系(Weinberg 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，1983，80 5383-5386)，及前述的W09^8152所述的細(xì)胞系。在步驟(ii)中，本發(fā)明的第一種方法考慮到了將已包含步驟(i)中腺病毒基因組 的細(xì)胞保持在合適的條件下，以允許細(xì)胞中腺病毒的包裝和復(fù)制，并阻止位點(diǎn)特異性重組 酶的表達(dá)。考慮到重組酶由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的操控，在理想條件下所述啟動(dòng)子不能激活轉(zhuǎn)錄， 除非存在激活劑。然而，所有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子都有一定的基礎(chǔ)活性，在存在輔助性載體時(shí)，其 能引起重要序列的切除(優(yōu)選包裝序列Ψ)，從而使腺病毒基因組不能被衣殼化，降低該過(guò) 程的產(chǎn)量。因此，在一優(yōu)選實(shí)施例中，衣殼化過(guò)程在表達(dá)轉(zhuǎn)錄阻遏物的細(xì)胞中進(jìn)行，該阻遏 物與調(diào)控重組酶表達(dá)的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，基于后者阻遏轉(zhuǎn)錄。所述轉(zhuǎn)錄阻遏物在缺乏激活 所述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的配體時(shí)優(yōu)選為有活性的。在特定情況下，啟動(dòng)子被rtTA四環(huán)素-依賴型 激活物激活，在缺乏強(qiáng)力霉素時(shí)轉(zhuǎn)錄阻遏物與四環(huán)素操縱子特異性結(jié)合，從而阻斷重組酶 基因的表達(dá)。步驟(ii)在必要時(shí)進(jìn)行以使病毒顆粒的濃度足夠高，其由標(biāo)準(zhǔn)方法確定，如 Shabram 等(Hum. Gene Ther. 1997,8 :453-465)所述的基于 HPLC 的 Resource Q 方法，或間 接地由對(duì)細(xì)胞中細(xì)胞病理效應(yīng)的目測(cè)確定。細(xì)胞培養(yǎng)可選擇地包括新鮮培養(yǎng)基的添加。在第三步驟中，步驟(ii)過(guò)程中產(chǎn)生的腺病毒從細(xì)胞培養(yǎng)物中重新獲得。為此， 有必要通過(guò)任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(胰酶消化或機(jī)械刮，及離心或過(guò)濾)將細(xì)胞 從培養(yǎng)基中分離，使細(xì)胞在惰性溶液中破裂(冷凍/解凍循環(huán)，均化作用，超聲降解，空化作 用，洗滌劑等的使用)，及通過(guò)已知方法純化腺病毒顆粒，如氯化銫梯度超速離心法，或通過(guò) 不同類型的色譜法，如離子交換色譜和金屬螯合物親和色譜的組合(Huyghe等，1996,Human Gene Therapy, 6 :1403-1416)，離子交換色譜和凝膠分層色譜的組合(W007059473)，二乙基 氨基乙基(DEAE)纖維素色譜(Haruna等，1961，Virology 13，264-267)，羥基磷灰石色譜 (US2002/0064860)，及在其它樹脂中的色譜，如軟凝膠(瓊脂糖)，基于合成聚合物的大孔 聚合物，包括許可色譜(permission chromatography) (fractogel)和基于硬膠囊中軟凝膠 的材料(例如，Ceramica HyperD F) (Rodrigues, 1997, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl 699 :47-61)。在另一方面，本發(fā)明考慮了根據(jù)本發(fā)明第一種方法獲得的輔助性腺病毒。目的基因的腺病毒的系統(tǒng)禾Π方法本發(fā)明的輔助性腺病毒客體可用于包括目的基因的高容量腺病毒復(fù)制和包裝的 系統(tǒng)和過(guò)程。因此，本發(fā)明的一方面涉及本發(fā)明多核苷酸或本發(fā)明載體或根據(jù)本發(fā)明的腺病毒顆粒在高容量腺病毒生產(chǎn)和包裝中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)高容量重組腺病毒的系統(tǒng)，其包括(a)本發(fā)明的一個(gè)多核苷酸，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)表達(dá)載體或根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)腺 病毒顆粒；(b) 一個(gè)腺病毒，其基因組包括目的基因，且該腺病毒缺少編碼至少一個(gè)對(duì)于復(fù)制 重要的蛋白或至少一個(gè)對(duì)于所述腺病毒包裝重要的蛋白的序列或包括所述腺病毒基因組 的多核苷酸，以及(C) 一個(gè)真核細(xì)胞。在所述系統(tǒng)中，輔助性腺病毒的擴(kuò)增系統(tǒng)中實(shí)質(zhì)上描述的第一組分包括一多核苷 酸，其包括至少部分輔助性腺病毒基因組，能為高容量腺病毒的復(fù)制和包裝完全或部分地 提供必要組分。第二組分包括高容量腺病毒或包括所述病毒基因組的多核苷酸，其中所述基因組 缺少編碼至少一個(gè)對(duì)于所述腺病毒的復(fù)制重要的蛋白或至少一個(gè)對(duì)于所述腺病毒的包裝 重要的蛋白的序列，且使用本發(fā)明系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明，“高容量腺病毒”應(yīng)被理解 為被稱為輔助病毒依賴型腺病毒或無(wú)腸腺病毒的重組腺病毒類型，其特征在于，除了 5'和 3' ITR區(qū)域及包裝區(qū)域Ψ腺病毒基因組的所有基因都被切除，例如，如Alb等所述(Gene Therapy, 2005,12 :S18_S27)。鑒于缺乏腺病毒基因組的特征序列，這些腺病毒允許高達(dá) 36kD的異源序列。根據(jù)本發(fā)明的方法外源基因可整合到無(wú)腸載體，所述外源基因包括編碼促紅細(xì)胞 生成素(EPO)、瘦素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)、促性腺 激素釋放激素(&iRH)、促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、催乳素釋放激素(PRH)、褪黑激素釋 放激素(MRH)、催乳素抑制激素(PIH)、生長(zhǎng)激素抑制素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、生長(zhǎng)激 素或(GH)、促黃體激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH或促甲狀腺腺素)、 泌乳刺激素、催產(chǎn)素、抗利尿激素(ADH或加壓素)、褪黑激素、MUllerian抑制因子、降鈣素、 甲狀旁腺素、胃泌激素、縮膽囊素(CCK)、分泌素、I型胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)、11型胰島 素樣生長(zhǎng)因子(IGF-II)、心房利鈉肽(ANP)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、胰島素、胰高血糖 素、生長(zhǎng)激素抑制素、胰多肽(PP)、瘦素、神經(jīng)肽Y、腎素、血管緊縮素I、血管緊縮素II、因子 VIII、因子IX、組織因子、因子VII、因子X、凝血酵素、因子V、因子XI、因子XIII、白細(xì)胞間 介素1 (IL-I)、白細(xì)胞間介素2 (IL-2)、腫瘤壞死因子-α (TNF- α )、白細(xì)胞間介素6 (IL_6)、 白細(xì)胞間介素8 (IL-8和趨化因子)、白細(xì)胞間介素12 (IL-12)、白細(xì)胞間介素16 (IL-16)、白 細(xì)胞間介素 15(IL-15)、白細(xì)胞間介素 24(IL-24)、干擾素-α、β、γ、CD3、ICAM-1、LFA-1、 LFA-3、包括RANTES 1 α、MIP-I α、MIP-I β的趨化因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板衍生 生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-beta)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(FGF和GF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF和類似物)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、粒細(xì)胞集落 刺激因子(G-CSF)、膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、α -抗胰 蛋白酶、腫瘤壞死因子、粒細(xì)胞和噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、心肌營(yíng)養(yǎng)素I(CT-I)、制 瘤素M(OSM)、雙調(diào)蛋白(AR)、環(huán)孢霉素、纖維蛋白原、乳鐵傳遞蛋白、組織型纖溶酶原激活 物(tPA)、糜蛋白酶、免疫球蛋白、水蛭素、超氧化物歧化酶、伊米苷酶、β-葡糖腦苷脂酶、 α-L-糖苷酶-α、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸酯-2-硫酸酯酶、加硫酶、人α -半乳糖苷酶Α、α-1蛋白酶抑制因子、乳糖酶、胰腺酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)、腺甙脫氨酶、 免疫球蛋白、白蛋白、A型和B型肉毒桿菌素、膠原酶、人類脫氧核糖核酸酶I、透明質(zhì)酸酶、 L-天門冬酰胺酶、重組水蛭素、溶栓酶、β細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子(TGF-β)抑制劑多肽的基因，如 W00331155、W0200519244和W00393^3中所述，其內(nèi)容在這里通過(guò)參考文獻(xiàn)引入，對(duì)干擾 RNA分子轉(zhuǎn)錄合適的表達(dá)框(shRNA、siRNA、miRNA、改性Ul核蛋白R(shí)NA)。除了所述外源基因，用于本發(fā)明的無(wú)腸腺病毒可包括填充區(qū)域，如Parks等所述 來(lái)源于λ噬菌體基因組的填充序列(J.Virol.，1999，73 :8027-8034)，或Sandig等所述出 現(xiàn)在 PSTK120 的填充 DNA(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :1002-7)。如 Parks 等所描述，這 些區(qū)域通常包含存在于人類基因組的序列，且能夠提高關(guān)于控制腺病毒外源基因的表達(dá)， 控制腺病毒代替所述人類填充DNA，其包括λ噬菌體的221Λ片段(J.Virol.，1999，73: 8027-8034)。人類填充DNA的總長(zhǎng)度是可變化的，但其在20-301Λ范圍內(nèi)，優(yōu)選為20-251Λ，或 更優(yōu)選為21-231Λ，例如，221Λ。所述填充DNA中順式作用序列的數(shù)量可在2、3、4或更多中 變化，且包括無(wú)限制的16. 2kb白斑樣的重復(fù)區(qū)域(Smith J G等，1995，Mol. Cell. Biol.， 15 =5165-72)；基質(zhì)附著區(qū)域(MAR)，例如包含了 6型腺病毒6左端或2個(gè)免疫球蛋白κ基 質(zhì)附著區(qū)域的4. 2kb的片段(Betz A G等，1994，Cell, 77 =239-248)；肝細(xì)胞控制區(qū)域，如 包括所述HCR的1. 2kb片段(如Miao等所述，Molecular Therapy, 1 :522-32)；或其他基 質(zhì)附著區(qū)域，如雞溶菌酶的2. 8kb區(qū)域(如Phi-Van L等所述，1990，Mol. Cell. Biol. 10 2302-2307)，干擾素β的5'區(qū)域的基質(zhì)附著區(qū)域(如Bode J等所述，1992，kience，10 195-197)，或其他非編碼的人類序列，如端粒序列或著絲粒序列。最后，根據(jù)本發(fā)明用于產(chǎn)生高容量重組腺病毒的系統(tǒng)還包括一個(gè)真核細(xì)胞，所述 腺病毒的擴(kuò)增過(guò)程在該細(xì)胞中進(jìn)行。適合用于所述系統(tǒng)的真核細(xì)胞包括能被腺病毒自發(fā)地 感染的所有細(xì)胞系(如果腺病毒構(gòu)成系統(tǒng)的組分(a)和(b))，或那些易于被包含高容量腺 病毒和輔助性腺病毒基因組的多核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。另外，如果輔助性腺病毒的基因組 不包括編碼能夠激活重組酶表達(dá)的反式作用因子的序列，構(gòu)成組分(c)的細(xì)胞必須表達(dá)所 述反式作用因子，優(yōu)選地在一穩(wěn)定的方式下且優(yōu)選地受組成型啟動(dòng)子的調(diào)控。這有利于加 速包含于輔助性腺病毒中的重組酶的表達(dá)動(dòng)力學(xué)，從而促進(jìn)其包裝序列的切除。在一優(yōu)選 實(shí)施例中，有可能使用細(xì)胞表達(dá)重組酶，其靶位點(diǎn)位于輔助性腺病毒基因組重要區(qū)域的兩 側(cè)，因此，除了由實(shí)際的輔助性腺病毒產(chǎn)生的重組酶，還有由實(shí)際的細(xì)胞產(chǎn)生的重組酶，以 使在輔助性腺病毒所有復(fù)制基因組的去除中獲得更高的效率。本發(fā)明優(yōu)選地考慮了以穩(wěn)定 方式表達(dá)Cre重組酶的新建細(xì)胞系如293Cre系的應(yīng)用(Parks等，supra.)。表達(dá)細(xì)胞的重 組酶可受組成型啟動(dòng)子的調(diào)控或受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控，其可以與用于調(diào)控由輔助性腺病 毒編碼的重組酶表達(dá)的啟動(dòng)子相同或不同。用于調(diào)控被細(xì)胞編碼的重組酶表達(dá)的組成型和 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與上面提到的那些相同。另一方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)表達(dá)目的基因的高容量輔助腺病毒載體的方 法(下文中的本發(fā)明的第二種方法)，其包括以下步驟(i)在適合條件下將一個(gè)細(xì)胞與一個(gè)腺病毒或一個(gè)包括所述腺病毒基因組的多核 苷酸接觸，所述腺病毒基因組包括目的基因，且缺少編碼至少一個(gè)對(duì)所述腺病毒復(fù)制或包 裝重要的蛋白的序列，以使所述腺病毒基因組或包含所述基因組的多核苷酸進(jìn)入該細(xì)胞，
(ii)在適合條件下將所述細(xì)胞與選自下組中的第二組分接觸，(a) 一種多核苷酸，包括1.編碼位點(diǎn)特異性重組酶的區(qū)域，其中所述區(qū)域由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控，以及2. 一個(gè)腺病毒包裝信號(hào)Ψ，其兩側(cè)為序列a)編碼的重組酶的特異性識(shí)別序列，其 中所述識(shí)別序列被定向，以使存在所述重組酶時(shí)，切除包裝信號(hào)Ψ，(b)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒載體，和(c)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒顆粒以使所述多核苷酸、所述腺病毒載體或所述腺病毒顆粒的基因組進(jìn)入該細(xì)胞中，(iii)將該細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)臈l件下，用于兩種病毒基因組編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)， 兩種腺病毒基因組的復(fù)制和步驟(ii)中使用的多核苷酸、載體或腺病毒編碼的重組酶的 表達(dá)。(iv)從細(xì)胞培養(yǎng)中重新獲得高容量腺病毒。本發(fā)明的第二種方法的步驟(i)與本發(fā)明的第一種方法的第一個(gè)步驟類似，因?yàn)?其包括將一個(gè)細(xì)胞與腺病毒基因組接觸的環(huán)節(jié)，其中所述腺病毒基因組可以是裸多聚腺苷 酸的形式或者構(gòu)成腺病毒顆粒的部分。在第一種情況下，該方法的步驟(i)包括使用已知 的方法使得多腺苷酸如前所述進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。在第二種情況下，將腺病毒顆粒與細(xì)胞接觸 已經(jīng)足夠，如果該表達(dá)的表面分子作為腺病毒受體起作用，則后者將自發(fā)地將其基因組融 入到細(xì)胞中。在一優(yōu)選實(shí)施例中，用于步驟(i)的腺病毒為高容量腺病毒或無(wú)腸腺病毒。本發(fā)明第二種方法的步驟(ii)可以與步驟(i)同時(shí)進(jìn)行，或在步驟(i)之前或之 后進(jìn)行，盡管其應(yīng)該在步驟(i)之后進(jìn)行以阻止腺病毒的結(jié)構(gòu)和調(diào)控蛋白表達(dá)引起的細(xì)胞 病變作用阻止包括目的基因的腺病毒的基因組的有效復(fù)制。如果所述基因組是裸多腺苷 酸，那么輔助性腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞可以采取已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如果所述基因組以腺病 毒顆粒的形式提供，那么可以采取自然感染路線使輔助性腺病毒的基因組進(jìn)入細(xì)胞。本發(fā)明第二種方法的步驟(iii)包括將細(xì)胞保持在合適的條件下，以允許通過(guò)由 輔助性腺病毒的基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯機(jī)制進(jìn)行表達(dá)，其中輔助性腺病 毒在步驟(ii)中引入，并且以允許包括目的基因的腺病毒的基因組進(jìn)行復(fù)制。在該步驟 中，保證由輔助性腺病毒編碼的重組酶在細(xì)胞中的表達(dá)與活性很重要，以使所述基因組中 對(duì)于其復(fù)制和/或殼體化重要的區(qū)域切除，形成的包括輔助腺病毒基因組的腺病毒顆粒最 大程度的減少。在一優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(iii)在存在一調(diào)控位點(diǎn)特異性重組酶表達(dá)的啟 動(dòng)子的特定反式作用因子誘導(dǎo)物時(shí)進(jìn)行。所述反式作用因子可由實(shí)際的細(xì)胞提供，其中如 果編碼其的多核苷酸以穩(wěn)定的方式整合到所述細(xì)胞中的基因組中或，可代替地，在一優(yōu)選 實(shí)施例中，其是編碼所述反式作用因子的輔助性腺病毒的實(shí)際的基因組，則開始進(jìn)行包裝。 在一更優(yōu)選的實(shí)施例中，反式作用因子由輔助性腺病毒和包裝細(xì)胞的基因組進(jìn)行表達(dá)。在 一更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述反式作用因子要求存在一配體，以實(shí)施其反式激活的活性，在這 種情況下，本方法的步驟(iii)在存在所述配體的情況下進(jìn)行，以確保重組酶最大化表達(dá)。 在一更優(yōu)選的實(shí)施例中，反式作用因子為rtTA-M2反式作用因子，其由與單純皰疹病毒的 VP16蛋白結(jié)合的四環(huán)素阻遏物形成，在這種情況下，本發(fā)明的步驟(iii)在存在四環(huán)素類 色物時(shí)進(jìn)行，優(yōu)選為強(qiáng)力霉素。圖3中的右圖示出了在強(qiáng)力霉素存在時(shí)，重組酶的表達(dá)和活化機(jī)制。
如前所述，任何重組酶基本上適用于在輔助病毒中切除包裝信號(hào)，所述包裝信號(hào) 兩側(cè)為適當(dāng)方向的所述重組酶的目標(biāo)位點(diǎn)，其導(dǎo)致包含在兩個(gè)信號(hào)之間的序列的切除。在 一優(yōu)選實(shí)施例中，由輔助性腺病毒編碼的重組酶是Cre重組酶或者包括所述重組酶的融合 蛋白。當(dāng)重組酶不用于目的腺病毒的包裝過(guò)程中時(shí)，另一個(gè)確保重組酶失活的方式是使用 重組酶，該重組酶移位到核內(nèi)，是依賴于可外源性添加的配體的存在，在缺乏特異性配體 時(shí)，該重組酶與阻止其發(fā)揮功能的細(xì)胞蛋白結(jié)合。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，考慮使 用由Cre重組酶和至少一個(gè)雌激素蛋白受體的配體結(jié)合區(qū)域形成的融合蛋白。融合蛋白的 這些類型默認(rèn)地位于細(xì)胞質(zhì)中，并與特定的細(xì)胞蛋白結(jié)合，因此他們不能發(fā)揮其重組酶的 功能。然而，存在雌激素或衍生物(例如他莫西芬)時(shí)，融合蛋白從所結(jié)合的所述細(xì)胞蛋白 中釋放，并移動(dòng)到核內(nèi)行使其重組酶功能。在一更優(yōu)選的實(shí)施例中，由重組腺病毒編碼的重 組酶是MerCreMer重組酶，其由Cre重組酶和一在氮端和碳端的突變的雌激素蛋白受體配 體結(jié)合區(qū)域形成。圖6圖解地示出了在強(qiáng)力霉素和他莫西芬存在時(shí)，重組酶的表達(dá)和活化機(jī)制。本發(fā)明第二種方法的步驟(iv)包括在步驟(iii)中形成的無(wú)腸腺病毒的純化，其 實(shí)質(zhì)上采用了與本發(fā)明第一種方法的步驟(iii)中純化輔助性腺病毒相同的方法，其細(xì)節(jié) 如上所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，根據(jù)本發(fā)明的第二種方法純化的包含目的基因的腺 病毒可以通過(guò)將所述腺病毒再次與細(xì)胞接觸用于連續(xù)幾輪的增殖，然后將所述細(xì)胞與通過(guò) 本發(fā)明第一種方法獲得的另一劑量的輔助性腺病毒接觸。從而本發(fā)明的這個(gè)過(guò)程可以連續(xù) 重復(fù)幾次，以使在每個(gè)循環(huán)中獲得更多數(shù)量的腺病毒顆粒。以下將基于所提供的具體實(shí)施例以說(shuō)明性和非限制性的方式對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn) 行說(shuō)明。
具體實(shí)施例實(shí)施例1AdTetCre病毒的構(gòu)建.誘導(dǎo)型MerCreMer表達(dá)框的構(gòu)建誘導(dǎo)系統(tǒng)由兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元組成。其中之一在一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控下 編碼重組酶，并且另一個(gè)在組成型啟動(dòng)子(小鼠PGK基因的啟動(dòng)子)的調(diào)控下編碼反式作 用因子。為了獲得第一單元，用前述PO7Pal-Iuc質(zhì)粒(Zabala等，2004，Cancer Res. 64 2799-2804)作為開始。該質(zhì)粒包括7個(gè)反式作用因子的結(jié)合位點(diǎn)和位于小鼠白蛋白啟動(dòng)子 5'末端的用于調(diào)控?zé)晒馑孛富虻?96bp區(qū)域，以及一個(gè)來(lái)自SV40病毒的多聚腺苷酸化 言自 PANMerCreMerM半立(Dr. M. Reth，Max_Pl￡mck Institute for Immunobiology, Freiburg,Germany) (Verrou et al. , 1999,Biol Chem. 380 :1435-8)中用于編碼MerCreMer 融合蛋白的序列引入到該質(zhì)粒中。使用PANMerCreMer質(zhì)粒的HindIII限制性酶切位點(diǎn)和 PO7Pal-Iuc質(zhì)粒的HindIII和XbaI位點(diǎn)來(lái)構(gòu)造克隆體，形成palbMerCreMer質(zhì)粒。小鼠磷 酸甘油酸酯激酶(PGK)基因的啟動(dòng)子用于獲得調(diào)控rtTA2S-M2反式作用因子(Zabala等， 2004，supra.)表達(dá)的第二單元，和一基于鼠β球蛋白基因(Levitt等，1989，Genes Dev. 3 1019-25)的合成多聚腺苷酸信號(hào)。所獲得的質(zhì)粒被稱為pGKrtTA。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元都通過(guò)將palbMerCreMer質(zhì)粒的BioI-SalI片段亞克隆到pGKrtTA質(zhì)粒被融合到一個(gè)單獨(dú)的稱作 prtTAMerCre的質(zhì)粒中。-AdTetCre載體基因組的構(gòu)建首先，通過(guò)PCR獲得包括左側(cè)腺病毒ITR和兩側(cè)具有LoxP位點(diǎn)的包裝信號(hào)的序 列。用含有輔助性腺病毒(E.Ayuso，Doctoral Thesis. School of Veterinary Medicine. Universidad Autonoma de Barcelona. CBATEG. 2006)基因組的 pGS102 質(zhì)粒作為 PCR 的模 板，所使用的寡核苷酸為寡核苷酸 序列序列號(hào)5Ad5St TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTG1AdpTGC-IO TGACTAGTATAAGCGGCCGCAGCAGATACGGGATATC 2該片段引入到pShuttle質(zhì)粒(He等，1998)以構(gòu)成pShut_VH質(zhì)粒。然后包含在 該質(zhì)粒中的細(xì)菌序列的定向(對(duì)卡那霉素的抗性和復(fù)制起點(diǎn))通過(guò)I^acI酶消化改變，并將 片段重新連接。所獲得的質(zhì)粒被稱為pShutLoxP。然后在質(zhì)粒的NotI和MlI之間包括了 一個(gè)單獨(dú)的用于SwaI酶的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。至此，通過(guò)寡核苷酸的雜交構(gòu)建了一個(gè)表達(dá) 框。寡核苷酸 序列序列號(hào)5SwaBCTGACTGAGCGGCCGCATTTAAATGTCGACACTTCAC 33SwaBGTGAAGTGTCGACATTTAAATGCGGCCGCTCAGTCAG 4用NotI和MlI酶進(jìn)行消化，并連入到pSmtLoxP質(zhì)粒中。所獲得的質(zhì)粒被稱為 PShutSwa0然后用該質(zhì)粒作為模板擴(kuò)增含有腺病毒基因組左側(cè)部分(包括兩側(cè)具有LoxP 位點(diǎn)的殼體化序列和SwaI識(shí)別位點(diǎn))的片段。所使用的寡核苷酸為寡核苷酸 序列序列號(hào)5ClaITR ACTGACATCGATTTAATTAACATCATCAATAATATACC 53ClaLoxP TAGATTATCGATTCTTAACCACGCCCAGATC6將該片段引入至IjpAdEasyl 質(zhì)粒的 ClaI 位點(diǎn)(He 等，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95:2509-14)。由此獲得了含有第一代腺病毒載體基因組(El與E3區(qū)域缺失)的 pAdLoxP2質(zhì)粒，其中第一代腺病毒載體的殼體化信號(hào)兩側(cè)具有LoxP位點(diǎn)。使用唯一的 SwaI位點(diǎn)，將來(lái)自prtTAMerCre質(zhì)粒的prtTAMerCre蛋白的可誘導(dǎo)的表達(dá)框引入該質(zhì)粒。 這個(gè)新的質(zhì)粒(pAdLoxPMerCre)應(yīng)該包括新的自失活輔助性腺病毒的序列，但是觀察到的 是當(dāng)該質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，很可能由于MerCreMer重組酶的表達(dá)而使殼體化序 列自動(dòng)切除。為了解決這個(gè)問題，使用了基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的同源性重組策略。為了達(dá)到 此目的，將含有誘導(dǎo)型表達(dá)框，但是具有編碼MerCreMer去尾序列的prtTAMerCre質(zhì)粒的 SnaBI-SapI片段引入pSiutSwa質(zhì)粒。由此，LoxP位點(diǎn)的共同存在和表達(dá)重組酶活性的能 力在同一質(zhì)粒中被阻止了。所獲得的質(zhì)粒被稱為pShutMer。為了產(chǎn)生新的輔助病毒，在 293tTS細(xì)胞株中進(jìn)行PAdLoxPMerCre和pShutMer質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染。這些質(zhì)粒具有足夠的同 源區(qū)域，以使能產(chǎn)生功能性病毒基因組的重組順利進(jìn)行(圖7)。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到 明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)(大約在轉(zhuǎn)然后的10-15天)，細(xì)胞破裂并通過(guò)PCR和對(duì)最重要區(qū)域 的測(cè)序驗(yàn)證病毒的結(jié)構(gòu)。在四3 3細(xì)胞株中通過(guò)有限的稀釋獲得單個(gè)克隆。新的自失活 輔助性腺病毒被稱為AdTetCre。
病毒的擴(kuò)增、純化和定量在四3 5細(xì)胞株中擴(kuò)增AdTetCre病毒。一旦在大多數(shù)細(xì)胞中觀察到細(xì)胞病變效 應(yīng)，則與培養(yǎng)基一起收集并離心。棄上清，將細(xì)胞于PH 8.1的IOmM較小體積的Tris中再 次重懸。然后通過(guò)3次凍融循環(huán)使細(xì)胞破裂，通過(guò)雙氯化銫梯度對(duì)已釋放的病毒進(jìn)行純化。 收集對(duì)應(yīng)于病毒的帶，通過(guò)尺寸排阻柱(Sephadex)去除鹽。用市售的AdenoX快速滴度試 劑盒(BD Biosciences)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書，對(duì)病毒的無(wú)效單元進(jìn)行定量。MerCreMer蛋白的表汰將四3 5細(xì)胞接種到6-孔多孔板(7. 5 χ IO5細(xì)胞/孔)中。M小時(shí)后，用他 莫西芬(0. 8 μ Μ) and強(qiáng)力霉素(lOOng/mL)進(jìn)行預(yù)處理，或者不進(jìn)行處理。在48小時(shí)時(shí)，用 AdTetCre病毒以2病毒/細(xì)胞的MOI進(jìn)行感染，在感染過(guò)程中，維持用他莫西芬和強(qiáng)力霉 素進(jìn)行處理。48小時(shí)后收集細(xì)胞。對(duì)于293細(xì)胞的對(duì)照組，它們?cè)?-孔多孔板進(jìn)行培養(yǎng) 并在先感染48小時(shí)后同時(shí)進(jìn)行收集。對(duì)于四3 Cre4細(xì)胞的對(duì)照做相同的事情。為了研究 MerCreMer蛋白的表達(dá)動(dòng)力學(xué)，用同樣的方式處理細(xì)胞并在不同的時(shí)間(6小時(shí)、12小時(shí)、36 小時(shí)和48小時(shí))進(jìn)行收集。為了獲得MerCreMer蛋白的陽(yáng)性對(duì)照，用pANMerCreMer質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染^3tTS細(xì)胞。用20 μ L脂質(zhì)體2000和15 μ g的非消化質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在48小時(shí)處 收集細(xì)胞。在所有情況下，用補(bǔ)充添加意格倍(Ig印al)的TNE緩沖液(50mM Tris pH 7. 5,5mM EDTA, IOOmM NaCl)和蛋白酶抑制劑混合組成的溶液，在冰上15分鐘進(jìn)行細(xì)胞裂 解，并隨后使細(xì)胞經(jīng)聲波處理并在4°C下15，OOOg離心45分鐘。通過(guò)Bradford方法測(cè)定蛋 白質(zhì)的量，通過(guò)8%的SDS-PAGE，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，其中加載的每個(gè)樣品為20yg蛋 白質(zhì)。通過(guò)使用特異性抗Cre (Novagen)的初級(jí)抗體的1 10. 000倍稀釋液和與過(guò)氧化酶 (BioRad)結(jié)合的次級(jí)山羊抗-兔抗體的1 5. 000的稀釋液，進(jìn)行免疫印跡以檢測(cè)Cre或 MerCreMer蛋白。它們通過(guò)蛋白印跡化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行(Perkin Elmer)。用強(qiáng)力g素禾口他‘！！西芬控泡丨病毒產(chǎn)牛將不同的細(xì)胞(四3，四3 5或四3(儀4)接種于每孔具有虹104個(gè)細(xì)胞的12-孔 板中，在補(bǔ)充添加有10%胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對(duì)小 時(shí)后，用他莫西芬(0. 8 μ M)、強(qiáng)力霉素(lOOng/mL)或同時(shí)進(jìn)行預(yù)處理，或者不進(jìn)行處理。M 小時(shí)后，用具有2病毒/細(xì)胞MOI的AdTetCre病毒或AdLC8cluc感染，48小時(shí)后收集細(xì)胞。 用AdenoX快速滴度試劑盒(BD Biosciences)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書，對(duì)無(wú)效病毒的量進(jìn)行 定量。HC-Ad生產(chǎn)過(guò)程用Riiel限制性內(nèi)切酶消化含有HC_Ad KCZ基因組的pKCZ質(zhì)粒，為了使其線性化 并消除其抗生素抗性。然后通過(guò)加入醋酸鈉(300mM)和2. 5倍體積的無(wú)水乙醇使其沉淀。 樣品在_20°C保持至少1小時(shí)，然后在4°C下11，OOOg離心30分鐘。用70%的乙醇洗滌沉 淀并空氣干燥。在水中進(jìn)行重懸，用15 μ g去轉(zhuǎn)染60mm板中的IxlO6 293Cre4細(xì)胞，其已 經(jīng)用他莫西芬和強(qiáng)力霉素預(yù)處理M小時(shí)。使用20 μ L的脂質(zhì)體2000 (Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn) 染。在6小時(shí)的時(shí)候更換培養(yǎng)基，添加具有2% FBS的DMEN培養(yǎng)基和1病毒/細(xì)胞的MOI 的AdTetCre病毒。該MOI值由之前的實(shí)驗(yàn)測(cè)定，其中分析了在感染48小時(shí)處產(chǎn)生90%細(xì) 胞病變效應(yīng)必要的病毒數(shù)量。進(jìn)行感染48小時(shí)，然后在200 μ L ρΗ8. 1的IOmM Tris中收集 細(xì)胞。該轉(zhuǎn)染-感染步驟被稱為代0。在該階段產(chǎn)生的病毒通過(guò)3次凍融循環(huán)從細(xì)胞中釋放，用150 μ L溶菌液去感染具有MOIl的AdTetCre輔助病毒的^3Cre4細(xì)胞的新的板。如 前所述，細(xì)胞用強(qiáng)力霉素和他莫西芬預(yù)處理M小時(shí)。由此進(jìn)行所謂的代1-3。在代4中，2 個(gè)150mm的板均用1 xlO7 293Cre4細(xì)胞感染，在代5中，所使用的為8個(gè)150mm板，在中規(guī) 模生產(chǎn)的最后的代使用30個(gè)150mm的板。通過(guò)雙氯化銫梯度對(duì)產(chǎn)生的病毒進(jìn)行純化，通過(guò) 尺寸排阻柱(S印hadex)去除鹽。用市售的AdenoX快速滴度試劑盒(BD Biosciences)，根 據(jù)制造商的說(shuō)明書，對(duì)每代中AdTetCre的量進(jìn)行定量。通過(guò)使用X_gal染色對(duì)HC-Ad KCZ 進(jìn)行定量。用相同的方法產(chǎn)生293細(xì)胞株，直到代4。在不用強(qiáng)力霉素和他莫西芬處理的 293Cre4細(xì)胞中生產(chǎn)AdLC8cluc輔助病毒，直到代6。實(shí)施例2力聽輛碰膽T，介Λ午Cre ■汰白備_充白_聿為了調(diào)控Cre的表達(dá)，使用之前被優(yōu)化的“tet-on”型誘導(dǎo)系統(tǒng)(Zabala等，2004， supra.)。該系統(tǒng)是基于反式作用因子(rtTA-M2)的組成型表達(dá)，其在外部添加強(qiáng)力霉素 時(shí)，進(jìn)行二聚化，形成一個(gè)能夠與含有“tet”結(jié)合序列的啟動(dòng)子結(jié)合的活性構(gòu)象(圖2)。由 此達(dá)到了在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(具有“tet”位點(diǎn))調(diào)控下的基因僅在存在強(qiáng)力霉素的條件下進(jìn) 行表達(dá)，并且以劑量依賴型的方式進(jìn)行表達(dá)。在這種情況下，質(zhì)粒被構(gòu)建，其中rtTA-M2反 式作用因子在組成型啟動(dòng)子(磷酸激酶，PGK)的調(diào)控下，以確保其在任何HC-AD包裝細(xì)胞 中具有活性。此外，Cre受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控，該啟動(dòng)子由幾個(gè)與最小啟動(dòng)子(在這種情況 下是白蛋白啟動(dòng)子)結(jié)合的“tet”位點(diǎn)構(gòu)成。然后這兩種構(gòu)建體融合從而獲得具有Cre完 整誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒(圖2)。為了確保Cre的基礎(chǔ)表達(dá)不妨礙新的輔助病毒的產(chǎn)生，進(jìn)行了兩個(gè)補(bǔ)充策略。一方面，生成組成型表達(dá)tTS阻遏物的細(xì)胞。在缺乏強(qiáng)力霉素時(shí)，tTS蛋白能夠 結(jié)合誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。當(dāng)添加強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)物時(shí)，tTS改變構(gòu)象并不再屬于啟動(dòng)子，留給 rtTA-M2反式作用因子一開放路徑使其結(jié)合并激活Cre的表達(dá)(圖3)。因此，該方法基于 兩種類型的包裝細(xì)胞表達(dá)tTS用于生產(chǎn)輔助性腺病毒的293細(xì)胞，和用于生產(chǎn)HC-Ad的 293細(xì)胞(具有或不具有Cre和/或rtTA-M2的組成型表達(dá))。獲得了一個(gè)商用質(zhì)粒，其中 編碼tTS的基因在CMV病毒啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)?？紤]到該啟動(dòng)子經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的沉默，其被 EFla啟動(dòng)子代替，以獲得在穩(wěn)定系中的一個(gè)更持久的表達(dá)。圖4示出了 RT-PCR的結(jié)果，其 用來(lái)檢測(cè)在293細(xì)胞株中篩選克隆后的引入的基因表達(dá)。此外，獲得了一個(gè)編碼融合蛋白的序列，該融合蛋白由Cre重組酶組成，其融合蛋 白羧基末端和羥基末端分別為突變雌激素受體。該蛋白(稱為MerCreMer)已經(jīng)被公開僅 在存在他莫西芬時(shí)，表現(xiàn)Cre重組酶活性(Verrou等，1999，Biol Chem. 380 :1435-8)。因 此，在缺乏強(qiáng)力霉素時(shí)，如果誘導(dǎo)型tet-on系統(tǒng)不能獲得Cre表達(dá)的有效調(diào)控，則該酶失活 并且允許輔助病毒產(chǎn)生。相反，當(dāng)生產(chǎn)Hc-Ad時(shí)，將他莫西芬添加到無(wú)強(qiáng)力霉素處理的tTS 的細(xì)胞中，以使系統(tǒng)的活化達(dá)到最大化。—旦整合了 Cre或MerCreMer重組酶調(diào)控系統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建完成，驗(yàn)證誘導(dǎo)系統(tǒng)的 運(yùn)行。圖5示出了在293細(xì)胞中Cre表達(dá)調(diào)控的實(shí)施例。當(dāng)用于編碼反式作用因子和具有 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的Cre的單獨(dú)的質(zhì)粒被共轉(zhuǎn)染時(shí)，獲得了存在強(qiáng)力霉素時(shí)的重組酶的表達(dá)， 然而兩種質(zhì)粒并不分別表達(dá)。含有完整系統(tǒng)的質(zhì)粒也產(chǎn)生Cre，盡管數(shù)量少些。圖5B示出了當(dāng)用強(qiáng)力霉素處理細(xì)胞時(shí)，后者質(zhì)粒如何僅表達(dá)出一定數(shù)量的Cre。實(shí)施例3由強(qiáng)力霉素和他莫西芬調(diào)控的表汰Cre的輔助件腺病毒載體然后開始通過(guò)將不同成分整合到一個(gè)質(zhì)粒中以構(gòu)建承載有MerCreMer重組酶的 自失活載體的過(guò)程，其中該質(zhì)粒包括第一代腺病毒載體基因組。圖6示出了該載體的基因 組結(jié)構(gòu)，并伴隨有預(yù)期的操作模式。然而，在一個(gè)質(zhì)粒中是不能獲得完整系統(tǒng)的，因?yàn)橛^察 到兩側(cè)具有LoxP位點(diǎn)的包裝序列在大腸桿菌的質(zhì)粒中進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)會(huì)被切除。為了達(dá)到這 個(gè)目的，要進(jìn)行最后步驟獲得新的載體，即兩個(gè)質(zhì)粒在^3tTS細(xì)胞株中共轉(zhuǎn)染，其在細(xì)胞 中發(fā)生同源重組后儲(chǔ)存了整個(gè)基因組(圖7)。在^3tTS細(xì)胞中擴(kuò)增病毒并且根據(jù)任何其 他用于第一代腺病毒載體的方法進(jìn)行純化。一旦獲得病毒，則通過(guò)免疫印跡進(jìn)行檢測(cè)，其能夠表達(dá)由強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)MerCreMer 蛋白(圖8)。然后研究了在不同類型細(xì)胞中存在強(qiáng)力霉素和他莫西芬時(shí)的情況。為此，在 存在或缺乏上述處理的情況下，組成型表達(dá)Cre重組酶的^3tTS或293細(xì)胞被感染(Parks 等，1996，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 :13565-70)。感染48小時(shí)后，每種情況下產(chǎn)生的感 染性病毒的數(shù)量被定量。如圖9所示，在四3 3細(xì)胞中，僅在存在強(qiáng)力霉素和他莫西芬時(shí)， 病毒產(chǎn)物銳減，這與由于其殼體序列的切除而導(dǎo)致的病毒殼體化的預(yù)期抑制相符。在細(xì)胞 株293中，其中MerCreMer的基礎(chǔ)表達(dá)水平更高些，單獨(dú)加入強(qiáng)力霉素或他莫西芬引起病毒 產(chǎn)量相對(duì)減少，盡管再次組合處理產(chǎn)生了更為顯著地減少。當(dāng)使用^3Cre4細(xì)胞時(shí)，如預(yù)期 所料，病毒的產(chǎn)量并不獨(dú)立于與誘導(dǎo)系統(tǒng)的活化。為了證明該系統(tǒng)的特異性，進(jìn)行了一個(gè)類 似的研究，這次用標(biāo)準(zhǔn)輔助病毒(AdLC8cluc)與AdTetCre病毒進(jìn)行比較，所述AdTetCre具 有兩側(cè)有LoxP位點(diǎn)的殼體化信號(hào)，但是其并不表達(dá)任何重組酶(Parks等，1996，supra.)。 如圖10所示，用他莫西芬和強(qiáng)力霉素處理并不引起病毒生產(chǎn)水平的顯著變化。僅當(dāng)使用 293Cre4細(xì)胞時(shí)，病毒的包裝減少。相反地，在AdTetCre情況下，證實(shí)了病毒的大幅度減少， 其病毒水平甚至比在293Cre4中使用AdLCScluc時(shí)觀察到的更低。為了證明該減少是由于 包裝序列的切除引起的，通過(guò)PCR對(duì)經(jīng)強(qiáng)力霉素和他莫西芬處理的在293細(xì)胞株中呈現(xiàn)的 AdTetCre病毒的原始區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。如圖IlA所示，擴(kuò)增的片段比與非改性的基因組相應(yīng) 的片段小，并且其大小與完全丟失的包裝序列相符合。通過(guò)測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。圖IlB示 出了當(dāng)感染^3Cre4細(xì)胞時(shí)，包裝序列是怎樣在標(biāo)準(zhǔn)輔助病毒(AdLCScluc)中丟失的。它 還可進(jìn)一步看到，該切除并不完整，與AdTetCre病毒相反。實(shí)施例4通過(guò)使用自失活輔助性腺病毒生產(chǎn)無(wú)腸腺病毒—旦檢測(cè)到AdTetCre病毒以誘導(dǎo)型方式失活(自失活)，則對(duì)其在HC-Ad生產(chǎn)過(guò) 程中作為輔助病毒的功能進(jìn)行研究。為此，進(jìn)行了編碼HC-Ad的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程(該 過(guò)程中，KCZ表達(dá)LacZ基因)，并隨后用輔助病毒進(jìn)行感染。在連續(xù)的擴(kuò)增步驟之后，使用 之前步驟產(chǎn)生的HC-Ad感染細(xì)胞的新板，并伴隨添加新的輔助病毒。板的尺寸與數(shù)量逐漸 增加。該過(guò)程在以AdTetCre病毒為輔助病毒的293細(xì)胞和^3Cre4細(xì)胞中同時(shí)進(jìn)行。與 標(biāo)準(zhǔn)的方法相比，應(yīng)用的相同方法在^3Cre4細(xì)胞中使用AdLCScLuc輔助病毒。在每一步 驟中，對(duì)對(duì)應(yīng)于HC-Ad和輔助病毒的無(wú)效單元的量進(jìn)行定量。如圖12A所示，在四3&^4細(xì) 胞中進(jìn)行的連續(xù)步驟中，使用AdTetCre病毒生產(chǎn)的HC-Ad逐漸增加，然而具有輔助性腺病毒的污染物總是很好的維持在那里。在該實(shí)施例進(jìn)行的最后一代(代6)中，1.2x10"總IU 的高容量腺病毒具有輔助腺病毒污染物的量少于0. 05%。對(duì)于HC-Ad的中型生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，該 產(chǎn)量和純度被認(rèn)為是可以接受的。相反，當(dāng)使用AdLCScluc病毒時(shí)，具有該病毒污染的程度 在整個(gè)步驟中增加，最終超過(guò)高容量載體的量(圖12C)。盡管其它的情況下，該污染較少， 并且可用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)生產(chǎn)HC-Ad，輔助性腺病毒的過(guò)度積累被頻繁地描述并表明了該方法 的致命缺陷。關(guān)于用AdTetCre病毒在293細(xì)胞中的生產(chǎn)，其污染程度同樣過(guò)高(圖12B)。 這表明由包裝細(xì)胞表達(dá)的Cre重組酶與由病毒表達(dá)的MerCreMer重組酶合作以完成最佳效 果?？赡艿氖沁@種組成型表達(dá)對(duì)于用輔助病毒感染后的初始時(shí)刻，確保重組酶的存在是十 分重要的。到目前為止進(jìn)行的一些連續(xù)的試驗(yàn)中，當(dāng)使用293Cre4細(xì)胞時(shí)，AdTetCre病毒 的量始終保持在高容量病毒的量之下，這說(shuō)明與基于傳統(tǒng)輔助性腺病毒的技術(shù)相比，該生 產(chǎn)方法具有更高的可靠性。實(shí)施例5通過(guò)使用自失活輔助腺病毒牛產(chǎn)攜帶治療轉(zhuǎn)基因的無(wú)腸腺病毒一旦檢測(cè)到AdTetCre以誘導(dǎo)型方式失活(自失活)并在生產(chǎn)HC-Ad過(guò)程中作為 輔助病毒起作用，則對(duì)其能夠生產(chǎn)攜帶有治療基因的HC-Ad的能力進(jìn)行研究。例如，GL-Ad/ RUmIL-12病毒(也稱為HC-Ad-mIL_12)在米非司酮-活化的肝臟特異性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào) 控下表達(dá)小鼠白細(xì)胞介素12(mIL-U)細(xì)胞因子。該載體在一些動(dòng)物肝癌模型中已經(jīng)顯示 出了具有抗腫瘤作用(Wang等，(Gastroenterology 2004,126 =278-289) 如前所述生產(chǎn)含 有 GL-Ad/RUmIL-12 的基因組的 pGLAd-RUmIL-12 質(zhì)粒(Wang，L.，等，2004Gastroenterology 126 :278-89),其用限制性內(nèi)切酶RiieI進(jìn)行消化，以使其線性化并消除抗生素抗性。隨后 通過(guò)加入醋酸鈉(300mM)和2. 5倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。樣品保持在_20°C至少一個(gè) 小時(shí)，然后4°C下，11，OOOg離心30分鐘，用70%乙醇清洗沉淀物并在空氣中干燥。在水中 進(jìn)行重懸，在用60mm板中，IxlO6 293Cre4細(xì)胞轉(zhuǎn)染15 μ g樣品，其中60mm板在此之前用他 莫西芬和強(qiáng)力霉素處理M小時(shí)。用20 μ L脂質(zhì)體2000 (Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。6小時(shí)后 更換培養(yǎng)基，加入具有2% FBS和具有1病毒/細(xì)胞MOI的AdTetCre病毒的DMEN培養(yǎng)基。 該MOI值由之前的實(shí)驗(yàn)測(cè)定，其中分析了在感染48小時(shí)處產(chǎn)生90%細(xì)胞病變效應(yīng)必要的病 毒數(shù)量。進(jìn)行感染48小時(shí)，然后在200 μ L ρΗ8. 1的IOmM Tris中收集細(xì)胞。該轉(zhuǎn)染-感 染步驟被稱為代0。在該階段產(chǎn)生的病毒通過(guò)3次凍融循環(huán)從細(xì)胞中釋放，用150 μ L溶菌 液去感染具有AdTetCre輔助病毒MOIl的^3Cre4細(xì)胞的新的板。如前所述，細(xì)胞用強(qiáng)力 霉素和他莫西芬預(yù)處理M小時(shí)。以此方式進(jìn)行所謂的代1-3。在代4中，2個(gè)150mm的板 均用1 XlO7 293Cre4細(xì)胞感染，在代5中，所使用的為8個(gè)150mm板，在中規(guī)模生產(chǎn)的最后 的代使用30個(gè)150mm的板，其具有相當(dāng)于4個(gè)150mm板的裂解液。通過(guò)雙氯化銫梯度對(duì) 產(chǎn)生的病毒進(jìn)行純化，通過(guò)尺寸排阻柱(S^hadex)去除鹽。用市售的AdenoX快速滴度試 劑盒(BD Biosciences)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書，對(duì)每代中AdTetCre的量進(jìn)行定量。GL-Ad/ RumIL-12的產(chǎn)量達(dá)到了 1. 5xl012個(gè)病毒顆粒(vp)，而具有的AdTetCre輔助腺病毒污染少 于 2. 6xl06iu?？紤]到該載體并不表達(dá)任何報(bào)告基因，通過(guò)測(cè)定感染細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因(mIL-12)的 產(chǎn)生對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。圖14A示出了在存在米非司酮誘導(dǎo)物時(shí)，用不同量的高容量腺病 毒載體GL-Ad/RUmIL-12感染HuH_7細(xì)胞(源于人類肝癌細(xì)胞)后的mIL_12水平。隨后，在體內(nèi)對(duì)載體的功能進(jìn)行驗(yàn)證。為此，將該載體內(nèi)源性地注射到小鼠體內(nèi)，測(cè)定了在腹腔使 用米非司酮誘導(dǎo)物后，在血清中出現(xiàn)的mIL-12的量。mIL-12的誘導(dǎo)與測(cè)量在注射載體后的 第7、48和62天進(jìn)行，并檢測(cè)到小鼠穩(wěn)定表達(dá)大量的轉(zhuǎn)基因(圖14B)。這些數(shù)據(jù)顯示出新 型的方法用于生產(chǎn)臨床有益的載體是有效的。
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，其包括a)編碼位點(diǎn)特異性重組酶的區(qū)域，其中所述區(qū)域由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控，以及b)對(duì)于腺病毒基因組的復(fù)制和/或包裝必不可少的區(qū)域，其兩側(cè)為對(duì)由序列a)編碼的 重組酶有特異性的識(shí)別序列，其中所述識(shí)別序列被定向，以使存在所述重組酶時(shí)，切除所述 重要區(qū)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中用于包裝和復(fù)制腺病毒基因組的重要的區(qū)域 b)是包裝信號(hào)Ψ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸，還包括編碼轉(zhuǎn)錄激活物的序列，所述轉(zhuǎn)錄激活 物在存在所述轉(zhuǎn)錄激活物配體的情況下，能夠特異性激活調(diào)控由序列(a)編碼的重組酶表 達(dá)的啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)錄激活物是四環(huán)素類似物依賴型反式 作用因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)錄激活物是rtTA-M2反式作用因子。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多核苷酸，其中重組酶是Cre或者包括Cre重組酶 序列的融合蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多核苷酸，其中重組酶還包括一激素結(jié)合域或一可激活的核 定位序列，優(yōu)選雌激素受體蛋白的激素結(jié)合域。
8.一種包括根據(jù)權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其中所述載體是腺病毒載體。
10.一種包括據(jù)權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的多核苷酸序列的腺病毒顆粒。
11.一種用于自失活輔助性腺病毒復(fù)制和包裝的系統(tǒng)，其包括a)根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、或根據(jù)權(quán)利要求8到9中任一項(xiàng)所 述的表達(dá)載體，或根據(jù)權(quán)利要求10所述的腺病毒顆粒；和b)一真核細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中細(xì)胞形成組分(b)包括一啟動(dòng)子特異性轉(zhuǎn)錄阻 遏物，其調(diào)控位點(diǎn)特異性重組酶的表達(dá)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)，其中所述特異性轉(zhuǎn)錄阻遏物在缺乏能夠促進(jìn)位點(diǎn)特 異性重組酶表達(dá)的配體時(shí)具有活性。
14.一種用于獲得自失活輔助性腺病毒的方法，其包括(i)在適合的條件下使細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、或根據(jù)權(quán) 利要求8到9中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，或根據(jù)權(quán)利要求10所述的腺病毒顆粒，和可選擇 地與細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)編碼對(duì)于細(xì)胞中腺病毒包裝或復(fù)制必要的腺病毒蛋白質(zhì)的多核 苷酸接觸，以使腺病毒基因組或包括所述基因組的多核苷酸進(jìn)入細(xì)胞，( )將該細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)臈l件下，允許細(xì)胞中腺病毒的包裝和復(fù)制，并阻止位點(diǎn)特 異性重組酶的表達(dá)，和(iii)從培養(yǎng)基中重新獲得腺病毒。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞包括一調(diào)控位點(diǎn)特異性重組酶表達(dá)的 啟動(dòng)子特異性轉(zhuǎn)錄阻遏物，其中所述阻遏物在缺乏能夠促進(jìn)位點(diǎn)特異性重組酶表達(dá)的配體 的類似物時(shí)具有活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述阻遏物是強(qiáng)力霉素依賴型tTS阻遏物。
17.一根據(jù)權(quán)利要求16所述方法獲得的輔助性腺病毒。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、或根據(jù)權(quán)利要求8到9中任一項(xiàng)所 述的表達(dá)載體，或根據(jù)權(quán)利要求10所述的腺病毒顆粒的應(yīng)用，其包括用于生產(chǎn)和包裝高容 量腺病毒的多核苷酸。
19.一種用于高容量重組腺病毒生產(chǎn)的系統(tǒng)，其包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、或根據(jù)權(quán)利要求8到9中任一項(xiàng)所 述的表達(dá)載體，或根據(jù)權(quán)利要求10所述的腺病毒顆粒；和(b)一個(gè)腺病毒，其基因組包括目的基因，且該腺病毒缺少編碼至少一個(gè)復(fù)制所需的重 要蛋白質(zhì)的序列，或缺少編碼至少一個(gè)對(duì)所述腺病毒包裝重要的蛋白質(zhì)的序列，或包含所 述腺病毒基因組的多核苷酸，和(c)一個(gè)真核細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其中真核細(xì)胞包括一多核苷酸，其表達(dá)由系統(tǒng)組分 (a)編碼的位點(diǎn)特異性重組酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中編碼位點(diǎn)特異性重組酶的區(qū)域由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 調(diào)控。
22.—種產(chǎn)生表達(dá)目的基因的高容量腺病毒的方法，包括以下步驟(i)在適合條件下將一個(gè)細(xì)胞與一個(gè)腺病毒接觸，以使所述腺病毒基因組或包含所述 基因組的多核苷酸進(jìn)入該細(xì)胞，( )在適合條件下將所述細(xì)胞與選自下組中的第二組分接觸，(a)一種多核苷酸，包括1.編碼位點(diǎn)特異性重組酶的區(qū)域，其中所述區(qū)域由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控，以及2.一個(gè)腺病毒包裝信號(hào)Ψ，其兩側(cè)具有序列a)編碼的重組酶的特異性識(shí)別序列，其中 所述識(shí)別序列被定向，以使存在所述重組酶時(shí)，切除包裝信號(hào)Ψ，(b)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒載體，和(c)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒顆粒以使所述多核苷酸、所述腺病毒載體或所述腺病毒顆粒的基因組進(jìn)入該細(xì)胞中，(iii)將該細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)臈l件下，用于兩種病毒基因組編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，兩種 腺病毒基因組的復(fù)制和步驟(ii)中使用的多核苷酸、載體或腺病毒編碼的重組酶的表達(dá)。(iv)從細(xì)胞培養(yǎng)基中重新獲得高容量腺病毒。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中在(a)中限定的多核苷酸和/或細(xì)胞還包括一 編碼調(diào)控位點(diǎn)特異性重組酶表達(dá)的啟動(dòng)子的特異性反式作用因子的序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟(i)和/或(ii)在存在能夠結(jié)合或激活調(diào) 控位點(diǎn)特異性重組酶表達(dá)的啟動(dòng)子的特異性反式作用因子的配體時(shí)進(jìn)行。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述反式作用因子是rtTA-M2并且其中所述配 體是強(qiáng)力霉素。
26.根據(jù)權(quán)利要求22到25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞包括一編碼位點(diǎn)特異性 重組酶的序列，其中所述重組酶與被在(a)中限定的多核苷酸編碼的一樣。
27.根據(jù)權(quán)利要求22到26中任一項(xiàng)所述的方法，其中位點(diǎn)特異性重組酶是Cre或者包括Cre重組酶序列的融合蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述重組酶是merCremer。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中步驟(i)和/或(ii)在存在三苯氧胺時(shí)進(jìn)行。
30.根據(jù)權(quán)利要求22到29中任一項(xiàng)所述的方法，包括至少重復(fù)一次步驟(i)到(iv)， 每個(gè)循環(huán)的步驟(i)都由上一循環(huán)的步驟(iv)獲得，而且有選擇地在每個(gè)循環(huán)的步驟(i) 中加入新的劑量的輔助性腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)自失活輔助性腺病毒的試劑和方法，所述自失活輔助性腺病毒允許發(fā)展用于生產(chǎn)通過(guò)輔助腺病毒而減少污染的高容量重組腺病毒的細(xì)胞系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C12N15/861GK102099481SQ200980128059
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者曼努埃拉·岡薩拉斯阿帕里西奧, 米倫伊莎索·毛萊翁馬約拉, 魯本·埃爾南德斯阿爾科塞瓦 申請(qǐng)人:西馬生物醫(yī)學(xué)計(jì)劃公司