專利名稱：形成非免疫原性疏水蛋白納米顆粒的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及形成納米顆粒的方法，且具體涉及由基于不溶于水的疏水蛋白的聚合 物形成納米顆粒以產(chǎn)生用于藥物、治療和診斷應(yīng)用中的非免疫原性遞送系統(tǒng)的方法。背景本文中討論的參考文獻(xiàn)僅僅是為了描述與本發(fā)明有關(guān)的領(lǐng)域而提供的。本文中沒(méi) 有內(nèi)容應(yīng)被解釋為承認(rèn)發(fā)明人沒(méi)有資格通過(guò)現(xiàn)有發(fā)明來(lái)預(yù)測(cè)公開(kāi)內(nèi)容。玉米醇溶蛋白(zein)是從玉米或玉蜀黍(maize)分離的植物蛋白且屬于醇溶谷 蛋白類(lèi)，醇溶谷蛋白類(lèi)包括大量的疏水性氨基酸，諸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。玉米 醇溶蛋白是澄清的、無(wú)味的、無(wú)毒的、可生物降解的和不溶于水的。玉米醇溶蛋白已經(jīng)被研 究且在藥品、醫(yī)療、食品、化妝品、粘合劑和包裝行業(yè)中用作聚合物。在食品和藥品行業(yè)，玉米醇溶蛋白已經(jīng)用于如膜涂覆材料且用于形成顆粒體系， 諸如微?；蚣{米顆粒[1-5]。已經(jīng)提出了形成玉米醇溶蛋白顆粒的多種方法。例如，美國(guó)專 利5，330，778討論了使用玉米醇溶蛋白來(lái)制備微粒的方法，并采用pH調(diào)節(jié)來(lái)形成玉米醇溶 蛋白微粒W]，該專利的內(nèi)容并入本文。然而，美國(guó)專利5，330，778中描述的方法產(chǎn)生了具 有較大的微米尺寸且具有寬的粒度分布的玉米醇溶蛋白顆粒，這于例如體內(nèi)應(yīng)用具有顯著 的缺陷。重要的是確保用于人類(lèi)或動(dòng)物應(yīng)用的生物材料是安全的和非免疫原性的。一般而 言，當(dāng)體內(nèi)施用(如，引入體內(nèi))顆粒時(shí)，血液和組織內(nèi)的負(fù)責(zé)免疫識(shí)別和去除外來(lái)顆粒的 吞噬細(xì)胞可以根據(jù)顆粒的物理化學(xué)特性來(lái)引發(fā)免疫應(yīng)答。吞噬細(xì)胞的攝取取決于外來(lái)顆粒 的粒度和表面疏水性。一般而言，直徑尺寸范圍大于約500nm的顆粒是易于吞噬的。具有 疏水性表面的顆粒易于被吞噬細(xì)胞識(shí)別[7]。例如，Lopez和Murdan [8]最近報(bào)道了直徑為 1.36士0. 036 μ m的玉米醇溶蛋白微球是免疫原性的，且因此不適于作為藥物、疫苗或其他 治療載體。發(fā)明概述在本公開(kāi)內(nèi)容的一個(gè)方面，本發(fā)明通常涉及一種用于產(chǎn)生非常小的顆?；蚣{米顆 粒的方法。該顆?？梢杂刹蝗苡谒氖杷鞍仔纬?，包括例如玉米醇溶蛋白。在本公開(kāi)內(nèi)容的另一個(gè)方面，方法用于產(chǎn)生減少或基本上克服了在使用大尺寸納 米顆?；蛭⒘?，包括由例如不溶于水的疏水蛋白形成的那些顆粒時(shí)經(jīng)歷的免疫原性的納米 顆粒。通過(guò)控制由本方法形成的顆粒的尺寸以及粒度范圍實(shí)現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明的方法制備的 納米顆粒的非免疫原性效應(yīng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施中，顆粒直徑尺寸的范圍小于約400nm。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí) 施中，顆粒直徑尺寸的范圍小于約300nm，且在一些另外的實(shí)施中，顆粒直徑尺寸的范圍是 約IOOnm至約300nm。雖然此公開(kāi)內(nèi)容中是就直徑來(lái)討論尺寸的，但是這不應(yīng)該被解釋為意 味著本文中所討論的納米顆粒優(yōu)選是球形形狀，雖然可以獲得球形形狀的納米顆粒。應(yīng)該 理解，本文所公開(kāi)的尺寸可以簡(jiǎn)單地在顆粒的相對(duì)側(cè)之間進(jìn)行測(cè)量，或橫跨顆粒的相對(duì)側(cè) 的最大尺寸。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以使用可由包括植物、動(dòng)物或合成來(lái)源的多種來(lái)源獲得 的不溶于水的疏水蛋白來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。在多個(gè)方面，可以用醇溶谷蛋白類(lèi)來(lái)實(shí)施本 方法，醇溶谷蛋白類(lèi)包括大量的疏水性氨基酸，諸如脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。這些疏 水性氨基酸使蛋白是不溶于水的。醇溶谷蛋白可以存在于各種谷物中，諸如玉米、小麥、大 麥、稻米、高粱以及其他植物和動(dòng)物來(lái)源中。合適的醇溶谷蛋白的一些示例是玉米醇溶蛋 白、麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白和高粱醇溶蛋白，雖然本方法的應(yīng)用不必不限于這些示例。 為了此描述的目的，且僅僅作為本發(fā)明的一種示例性的闡釋，本文中使用玉米醇溶蛋白僅 通過(guò)示例的方式描述本方法。在本方法的多個(gè)實(shí)施中，白玉米醇溶蛋白用于產(chǎn)生在約IOOnm至約400nm的期望 的直徑尺寸范圍內(nèi)的納米顆粒。還發(fā)現(xiàn)使用黃玉米醇溶蛋白可以產(chǎn)生具有相對(duì)較大的直徑 尺寸的顆粒，且還可以產(chǎn)生具有較寬的顆粒直徑尺寸分布的顆粒。認(rèn)為，黃玉米醇溶蛋白中 的色素可以影響黃玉米醇溶蛋白的溶解度和使用黃玉米醇溶蛋白的納米顆粒形成。本發(fā)明的方法比其他可能的方式產(chǎn)生具有大體上更小的直徑尺寸和更窄的直徑 尺寸范圍的納米顆粒。通過(guò)使用一種或多種特定級(jí)的基礎(chǔ)蛋白(base protein)諸如玉米 醇溶蛋白來(lái)實(shí)施PH控制的納米沉淀(nanoprecipitation)過(guò)程以及通過(guò)使用被選擇以獲 得為納米顆粒提供非免疫原性的納米尺寸和直徑的緩沖液、表面活性劑和磷脂的不同組合 獲得了這些較小的納米顆粒。本公開(kāi)內(nèi)容的方法進(jìn)一步適合于制備具有變化的物理化學(xué)性質(zhì)的多種分子、顆粒 或試劑的納米顆粒，以形成具有納米顆粒的包封的、吸收的、復(fù)合的或結(jié)合的材料。例如，該 方法可以用于捕獲小的親水性分子、小的疏水性分子和大分子。在這些實(shí)例的每一個(gè)中，可 以獲得約60%至約80%的包封效率。根據(jù)本發(fā)明形成的納米顆粒可以能夠在體外或體內(nèi) 環(huán)境中提供高達(dá)一周或可能更長(zhǎng)的包封分子(encapsulated molecule)的持續(xù)遞送。在本發(fā)明的一個(gè)方面，方法用于產(chǎn)生治療性和/或診斷性的納米顆粒，如包含抗 癌劑的納米顆粒。這樣的納米顆?？梢蕴峁┗钚詣┑陌邢蜻f送和釋放的時(shí)間控制，活性劑 通常是治療劑，諸如小分子藥物、核酸、蛋白、疫苗、抗體、化學(xué)試劑或其他試劑或物質(zhì)。除了 所描述的治療方法外，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生具有診斷部分的納米顆粒的方法，所述診斷 部分如成像劑、探針以及類(lèi)似物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于根據(jù)本發(fā)明的方法制備納米顆粒的試劑 盒。該試劑盒包含選定量的水溶蛋白、至少一種緩沖劑和至少一種表面活性劑。該試劑盒 還可以包括水醇溶劑(hydroalcoholic solvent)。該試劑盒還可以包括至少一種磷脂，可 以選擇磷脂的量以提供磷脂與表面活性劑的選定比率。附圖簡(jiǎn)述

圖1通過(guò)流程示了根據(jù)本發(fā)明的方法形成空白的(blank)玉米醇溶蛋白納米 顆粒的一般步驟。圖2通過(guò)流程示了根據(jù)本發(fā)明形成負(fù)載6，7_羥基香豆素的納米顆粒的步驟。圖3描繪了玉米醇溶蛋白納米顆粒的不同的電子顯微鏡的顯微照片。圖3(a)是 空白的玉米醇溶蛋白納米顆粒的掃描電子顯微照片。顆粒顯示為是球形的且具有光滑的表 面。(比例尺代表Imm = 1. 76μπι。)圖3 (b)是空白的玉米醇溶蛋白納米顆粒的透射電子 顯微照片。(比例尺代表Imm = 8. 038nm。)圖3 (c)是負(fù)載香豆素的玉米醇溶蛋白納米顆粒的掃描電子顯微照片。(比例尺代表Imm = 0.87 μ m。)圖3 (d)是負(fù)載6，7_羥基香豆素 的玉米醇溶蛋白納米顆粒的透射電子顯微照片。(比例尺代表Imm = 8. 04nm。)圖4描繪了根據(jù)本發(fā)明的方法的在空氣中以輕敲模式(tapping mode)產(chǎn)生的空 白的玉米醇溶蛋白納米顆粒的原子力顯微鏡(AFM)圖像。從左到右是代表性樣品的高度、 幅度和相的圖像，且分別是14. 19nm的ζ刻度、22. 2V和45°。掃描尺寸(scan size)是 1. 14X1. 14 μ m。以AFM測(cè)得50個(gè)顆粒的平均粒度是185nm。圖5是圖示了在凍干之前和之后，緩沖液類(lèi)型對(duì)根據(jù)本發(fā)明的方法制備的負(fù)載香 豆素的玉米醇溶蛋白納米顆粒的粒度的影響的圖。與使用磷酸鹽緩沖液相比，在本發(fā)明的 沉淀法中使用檸檬酸鹽緩沖液在凍干之后總是產(chǎn)生較小尺寸的納米顆粒。Cp <0.05)。圖 上的每一個(gè)點(diǎn)表示平均士SD(n = 3)。檸檬酸鹽緩沖液包括去離子水中的檸檬酸(0. 0153g/ L)和檸檬酸鈉(2. 91g/L)。磷酸鹽緩沖液包括去離子水中的磷酸氫二鈉(1. 44g/L)、磷酸二 氫鉀(0.25g/L)和氯化鈉(10g/L)。根據(jù)本發(fā)明，兩種緩沖液都用于將第二水相維持在pH 7. 4。圖6通過(guò)流程示了本發(fā)明的用于制備負(fù)載阿霉素的納米顆粒的方法的一般步驟。圖7圖示了由磷酸鹽緩沖的鹽水(pH 7. 4)中的負(fù)載6，7_羥基香豆素的玉米醇溶 蛋白納米顆粒的體外釋放曲線。將由本發(fā)明的方法制備的負(fù)載香豆素的玉米醇溶蛋白納米 顆粒(10mg/ml)置于透析膜(Spectrapor ，5000道爾頓分子量)內(nèi)且在胰蛋白酶(IOmg/ ml)不存在(非酶促)或存在(酶促)下孵育在由磷酸鹽緩沖的鹽水(pH 7.4)中。向介 質(zhì)中添加乙醇(20% ν/ν)以維持沉降條件，且疊氮化鈉(0.005%W/V)用作抗菌劑。使溶 液在50rpm的水平振蕩器水浴內(nèi)保持在37°C。在7天內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)去除等份(Iml)的 透析液并用新鮮介質(zhì)替換以保持沉降條件。使用熒光分光光度術(shù)(λ徽=490nm ； λ S|i = 520nm)來(lái)分析透析液中的從玉米醇溶蛋白納米顆粒釋放的香豆素。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次實(shí) 驗(yàn)的平均值(士SD)。在所有時(shí)間點(diǎn)處，酶促釋放都比非酶促釋放高(ρ < 0. 05)。圖8圖示了阿霉素自由磷酸鹽緩沖的鹽水(pH 7.4)中的玉米醇溶蛋白納米顆粒 的體外釋放曲線。由本發(fā)明的納米沉淀方法制備的負(fù)載阿霉素的玉米醇溶蛋白納米顆粒 (10mg/ml)被孵育在離心管內(nèi)Iml的由磷酸鹽緩沖的鹽水(pH 7.4)中且使溶液在50rpm 的水平振蕩器水浴內(nèi)保持在37°C。以10，OOOrpm離心樣品10分鐘且使用HPLC來(lái)分析上 清液中的從納米顆粒釋放的阿霉素。使用A C-18柱且流動(dòng)相(流速lml/min)是0.1%的 TFA 乙腈(使用至SO %的乙腈梯度)。熒光檢測(cè)器U激發(fā)=505nm ； λ發(fā)射=550nm) 用于檢測(cè)阿霉素。釋放研究進(jìn)行至多4天。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次實(shí)驗(yàn)的平均值(士SD)。圖9通過(guò)流程示了用于制備負(fù)載葡聚糖-FITC(氟代異硫氰酸酯)的納米顆 粒的本發(fā)明方法的一般步驟。葡聚糖的分子量是4000道爾頓。圖10圖示了葡聚糖-FITC自由磷酸鹽緩沖的鹽水(pH 7. 4)中的玉米醇溶蛋白納 米顆粒的體外釋放曲線。由本發(fā)明的方法制備的負(fù)載葡聚糖-FITC的玉米醇溶蛋白納米顆 粒(10mg/ml)被孵育在離心管內(nèi)Iml的由磷酸鹽緩沖的鹽水(pH 7.4)中且在50rpm的水 平振蕩器水浴內(nèi)保持在37°C。以10，OOOrpm離心樣品10分鐘且使用熒光分光光度術(shù)(λ 職=490nm ； λ 520nm)來(lái)分析上清液中的從納米顆粒釋放的葡聚糖-FITC。研究進(jìn)行 8天。每一個(gè)點(diǎn)表示平均值士 SD(n = 3)。
圖11通過(guò)流程示了本發(fā)明的用于制備負(fù)載質(zhì)粒DNA的納米顆粒的方法的一 般步驟。使用生長(zhǎng)在LB培養(yǎng)基中的大腸桿菌的DH5 α菌株來(lái)擴(kuò)增在本研究中使用的編碼綠 色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒DNA(pDNA)。使用Qiagen的“無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(EndoFree Plasmid Mega Kit) ”來(lái)分離質(zhì)粒。使用UV分光光度計(jì)，通過(guò)計(jì)算^0nm/280nm的UV吸光 度的比率來(lái)表征純化的pDNA且還通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)表征純化的pDNA。圖12圖示了粒度對(duì)豬多形核細(xì)胞吸收玉米醇溶蛋白納米顆粒的影響。該圖顯 示了在玉米醇溶蛋白顆粒存在下魯米那化學(xué)發(fā)光(Iuminalchemiluminescence)(超過(guò)90 分鐘)和陽(yáng)性對(duì)照酵母聚糖的曲線下的面積百分比。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)是四次實(shí)驗(yàn)的平均值 (士SEM)。與其他組相比，吸收在較小粒度時(shí)是顯著低的(ρ < 0. 05)。圖13圖示了分別在玉米醇溶蛋白顆粒的初次和追加皮下注射的第三周和第五周 之后所測(cè)得的抗玉米醇溶蛋白抗體(光密度)。每一個(gè)值表示平均值士SEM(n = 4)。與鹽 水組相比，初次和追加滴定度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著(P > 0. 05)。鹽水中的粗玉米醇溶蛋白 懸浮液或玉米醇溶蛋白顆粒(等同于100μ g/δθμ 1)被皮下注射在雌性Balb/c小鼠內(nèi)。從 眼血管叢抽取血液并使用小鼠ELISA試劑盒來(lái)測(cè)量稀釋的血清(1/16)中的抗玉米醇溶蛋 白抗體的水平。圖14是圖示了黃玉米醇溶蛋白⑴和白玉米醇溶蛋白(W)對(duì)在使用二甲基噻 唑-2-基-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)測(cè)定的處理4小時(shí)后，由線粒體脫氫酶的相對(duì)活 性表達(dá)的豬的腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)(20，000細(xì)胞/孔)的細(xì)胞存活率的影響的圖。 未經(jīng)任何處理的板用作對(duì)照且被認(rèn)為是100%存活的。將玉米醇溶蛋白粉末溶解在55% ν/ ν乙醇中且隨后由不含血清的培養(yǎng)基中的5mg/ml的原料進(jìn)行稀釋。在所有濃度下，黃玉米 醇溶蛋白和白玉米醇溶蛋白與未經(jīng)處理的對(duì)照沒(méi)有顯著不同(P < 0. 05)。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是 三次實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。圖15圖示了根據(jù)本發(fā)明制備的阿霉素溶液和阿霉素-玉米醇溶蛋白納米顆粒在 0VACAR-3細(xì)胞(人類(lèi)卵巢癌細(xì)胞)內(nèi)的體外細(xì)胞毒性曲線。細(xì)胞被暴露于0.0001 μΜ至 10 μ M濃度的阿霉素溶液和負(fù)載阿霉素的納米顆粒M小時(shí)。M小時(shí)后去除藥物處理并用 空白培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞(每48小時(shí)更換培養(yǎng)基)5天，并在第5天通過(guò)MTT測(cè)定測(cè)量細(xì)胞存 活率。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是四次實(shí)驗(yàn)的平均值。阿霉素溶液和阿霉素-玉米醇溶蛋白的IC5tl分 別是3. InM和0. 20nM。(Dox =阿霉素溶液；Dox-NP =阿霉素納米顆粒)。圖16圖示了根據(jù)本發(fā)明制備的阿霉素溶液和阿霉素-玉米醇溶蛋白納米顆粒在 抗阿霉素人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞(NCI/ADR-RES細(xì)胞)內(nèi)的體外細(xì)胞毒性曲線。細(xì)胞被暴露于 0. 0001 μ M至10 μ M濃度的阿霉素溶液和負(fù)載阿霉素的納米顆粒M小時(shí)。M小時(shí)后去除 藥物處理并用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞(每48小時(shí)更換培養(yǎng)基)5天，并在第5天通過(guò)MTT測(cè) 定測(cè)量細(xì)胞存活率。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是四次實(shí)驗(yàn)的平均值。阿霉素溶液和負(fù)載阿霉素的納米 顆粒的IC50分別是81. 73ηΜ和6. 41nM。(Dox =阿霉素溶液；Dox-NP =負(fù)載阿霉素的納米 顆粒)。圖17通過(guò)流程示了本發(fā)明的用于制備交聯(lián)的空白的玉米醇溶蛋白納米顆粒 的方法。圖18是表明M小時(shí)內(nèi)玉米醇溶蛋白納米顆粒的交聯(lián)度(extent ofcross-linking)作為交聯(lián)劑函數(shù)的圖。采用TNBS測(cè)定來(lái)確定交聯(lián)度。所使用的交聯(lián)劑
7是GTA-戊二醛(500 μ 1的25% w/v的儲(chǔ)備溶液)、EDC 1-乙基_3-[3_ 二甲基氨基丙基] 碳二亞胺(0. 6% w/v)和NHS :N-羥基琥珀酰亞胺(0. 6% w/v)。所使用的京尼平(genipin) 的濃度是0.05% w/v。“空白”表示不含任何交聯(lián)劑的玉米醇溶蛋白納米顆粒。數(shù)據(jù)是兩次 實(shí)驗(yàn)的平均值。圖19通過(guò)流程示了本發(fā)明的用于制備負(fù)載若丹明-123的交聯(lián)的玉米醇溶蛋 白納米顆粒的方法。圖20圖示了在pH 7. 4的由磷酸鹽緩沖的鹽水(0. 1M)中若丹明-123自玉米醇 溶蛋白納米顆粒的體外釋放曲線。結(jié)果表示平均值士SEM(n = 4)。NCS=非交聯(lián)的顆 粒；CS =交聯(lián)的顆粒。從交聯(lián)的納米顆粒的藥物釋放顯著低于非交聯(lián)的納米顆粒(P > 0. 05)。將由本發(fā)明的方法制備的負(fù)載若丹明的玉米醇溶蛋白納米顆粒OOmg)置于透析膜 (SpectrapOrTM，10，000道爾頓分子量)內(nèi)并孵育在5ml的由磷酸鹽緩沖的鹽水(pH 7.4) 中。使溶液在IOOrpm的水平振蕩器水浴內(nèi)保持在37°C。在48小時(shí)內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)去除 等份(Iml)的透析液并用新鮮介質(zhì)替換以保持沉降條件。使用熒光分光光度術(shù)(λ職= 485nm ； λ S|i= 530nm)來(lái)分析透析液中的從玉米醇溶蛋白納米顆粒釋放的若丹明。圖21圖示了在胰蛋白酶存在下，在pH 7.4時(shí)，若丹明-123自玉米醇溶蛋白納 米顆粒的體外釋放曲線。結(jié)果表示平均值士SEM(n = 4)。ENCS=非交聯(lián)的顆粒；ECS = 交聯(lián)的顆粒。從交聯(lián)的納米顆粒的藥物釋放顯著地低于非交聯(lián)的納米顆粒(P > 0. 05)。 將由本發(fā)明的方法制備的負(fù)載若丹明-123的玉米醇溶蛋白納米顆粒OOmg)置于透析膜 (Spectrapor , 10，000道爾頓分子量)內(nèi)并孵育在5ml的包含205 μ g/ml的胰蛋白酶的由 磷酸鹽緩沖的鹽水(0. ΙΜ,ρΗ 7.4)中。使溶液在IOOrpm的水平振蕩器水浴內(nèi)保持在37°C。 在48小時(shí)內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)去除等份(Iml)的透析液并用新鮮介質(zhì)替換以保持沉降條件。使 用熒光分光光度術(shù)(λ職=485nm ； λ S|i= 530nm)來(lái)分析透析液中的從玉米醇溶蛋白納米 顆粒釋放的若丹明-123。圖22以流程示了用于制備空白的聚乙二醇化(PEGylated)玉米醇溶蛋白納 米顆粒的一般方法。圖23是圖示了聚乙二醇化納米顆粒的加權(quán)尺寸分布的強(qiáng)度的圖。聚乙二醇化玉 米醇溶蛋白納米顆粒的粒度是131 士 lnm，且多分散度指數(shù)(PDI)是0^82 士 0.01。數(shù)據(jù)還 顯示了用PEG表面改性玉米醇溶蛋白納米顆粒并不會(huì)增大粒度且顯示了納米顆粒在用于 藥物遞送應(yīng)用的期望的尺寸范圍內(nèi)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述正如本文中使用的，已知術(shù)語(yǔ)“納米顆?！蓖ǔＶ冈谥辽僖粋€(gè)維度不大于IOOOnm 的顆粒。然而，由本發(fā)明的方法形成的納米顆粒將具有如本文定義的規(guī)定值的直徑。而且， 術(shù)語(yǔ)“納米顆?！钡氖褂眠€意在在屬類(lèi)上指空白的納米顆粒和用分子負(fù)載且由本發(fā)明的方 法形成的納米顆粒。正如本文中使用的，除非另外定義(即，圖18)，否則“空白的納米顆?！敝盖乙庵?根據(jù)本發(fā)明的方法形成的不具有與其一起形成或與其結(jié)合的選定顆粒、分子或材料的納米 顆粒。正如本文中使用的，當(dāng)在納米顆粒尺寸上下文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“直徑”指用于穿過(guò) 顆粒的質(zhì)量中心的線的顆粒的平均線性尺寸?？梢蕴峁┓乔蛐晤w粒的直徑的可接受的近似
8值，如，通過(guò)沿坐標(biāo)系的三個(gè)正交軸且其中一個(gè)軸與顆粒的最長(zhǎng)尺寸對(duì)齊，取顆粒厚度的平 均值。正如本文中使用的，當(dāng)在納米顆粒的治療和診斷用途的上下文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“施 用(administered) ”或“施用(administration) ”指并包括為了例如將治療劑遞送至靶向 部位的目的將選定量的納米顆粒引入體內(nèi)或體外環(huán)境中。正如本文中使用的，“體內(nèi)”意指受試者的身體或身體內(nèi)，諸如患者的身體或身體 內(nèi)，且包括通過(guò)多種方式施用納米顆粒，這些方式包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、胃腸 外、皮下、局部、眼部和鼻的施用途徑。正如本文中使用的，“體外”意指或指受試者或患者的身體的外部的環(huán)境。正如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”或“患者”指或意指?jìng)€(gè)體的復(fù)雜的生物體，如人 類(lèi)或非人類(lèi)的動(dòng)物。正如本文中使用的，“玉米醇溶蛋白的等級(jí)”指多種類(lèi)型或形式的玉米醇溶蛋白， 包括來(lái)源于各種方式的白玉米醇溶蛋白和黃玉米醇溶蛋白，諸如美國(guó)專利第5，254，673號(hào) 中公開(kāi)的，該專利的內(nèi)容并入本文[9]。正如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“治療劑”和指治療或醫(yī)療功能的類(lèi)似術(shù)語(yǔ)意指所指的分 子、大分子、藥物或其他物質(zhì)可以有益地影響受試者的疾病或疾患的引發(fā)、過(guò)程和/或一種 或多種癥狀且可以與納米顆粒一起用于制備治療疾病或其他疾患的藥物。正如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“生物相容的”意指當(dāng)由本發(fā)明所公開(kāi)的方法產(chǎn)生的納米 顆粒在體內(nèi)施用至受試者時(shí)，不導(dǎo)致或誘發(fā)顯著的副作用?？赡艿母弊饔玫氖纠ǖ?限于過(guò)度的炎癥和/或過(guò)度的或不利的免疫應(yīng)答，以及毒性。正如本文和所附權(quán)利要求中使用的，除非上下文中另外清楚地表示，否則單數(shù)形 式，如“一(a)”、“一(an)”和“一(the)”包括復(fù)數(shù)。例如，提及“納米顆?！睍r(shí)包括多個(gè)這 樣的納米顆粒，且提及“分子”時(shí)是指多個(gè)分子及其等同物。正如本文中使用的，“約”或“近似”意指合理地接近或略大于或略小于所述的數(shù)或量。正如本文中使用的，“包括(comprising)”、“包括(including) ”、“具有(having) ”、 “包含(containing)”、“特征為(characterized by) ”及其語(yǔ)法上的等同物是包括式的或 開(kāi)放式的術(shù)語(yǔ)，它們不排除額外的、未引述的要素或方法步驟，還包括限制性更強(qiáng)的術(shù)語(yǔ) “由......組成”和“基本上由......組成”。本發(fā)明涉及通過(guò)將納米顆粒的粒度控制在約IOOnm至400nm的尺寸范圍內(nèi)，且最 優(yōu)選在約IOOnm至約300nm的尺寸范圍內(nèi)來(lái)從不溶于水的疏水蛋白產(chǎn)生非免疫原性納米顆 粒的方法。圖1通過(guò)流程示了由本發(fā)明的方法制備非免疫原性納米顆粒的一般步驟。在本方法的初始步驟或階段中，將不溶于水的蛋白(0. 4至1. 25% w/v)溶解在可 以包含乙醇和去離子水的水醇溶劑中。溶劑的組成可以是，如90 10% ν/ν或92 8% ν/ν0對(duì)其中選定的分子被包封在納米顆粒中的方法來(lái)說(shuō)，將待包封的分子(0.03至0.3% w/v)添加到此第一水相的溶液中。待包封的分子是蛋白聚合物的約5至50% w/v。可以通過(guò)添加0. OlN NaOH或0. OlN HCl改變?nèi)芤旱膒H以使溶液的pH在約pH 6 至約PH 7之間。如果在添加諸如香豆素的酸性分子或堿性分子之后，水的pH改變，那么可 以將PH調(diào)節(jié)到pH 6至7。第一相的溶液可以被探針式超聲(probe sonication)處理以有助于蛋白的溶解。在本方法隨后的步驟中，在超聲剪切下，將初始步驟或階段的水性溶液添加到緩 沖劑中。特別優(yōu)選檸檬酸鹽緩沖液。用于第二水相的緩沖劑的選擇被認(rèn)為對(duì)在納米顆粒形 成期間保持PH是重要的，且還對(duì)隨后凍干所形成的納米顆粒是重要的，正如下文在此公開(kāi) 內(nèi)容中所描述的。如果不使用緩沖液，或如果使用例如0. IN HCl調(diào)節(jié)第二水相溶液的pH， 那么所產(chǎn)生的顆粒趨于比那些用檸檬酸鹽緩沖液產(chǎn)生的大，且顆粒趨于表現(xiàn)較寬的尺寸范 圍。使用檸檬酸鹽緩沖液產(chǎn)生了一些最小的顆粒直徑尺寸，諸如約lOOnm。使用其他緩沖液 可以產(chǎn)生約IOOnm至約300nm的相同或類(lèi)似的直徑尺寸范圍內(nèi)的顆粒，但在凍干步驟之后， 使用其他緩沖劑形成的納米顆粒的尺寸趨于增大2至3倍。顯著地，第二水相溶液的pH優(yōu)選在約pH 6. 8至約pH 7. 4之間以獲得納米顆粒的 期望的尺寸。如果PH在此范圍之外，那么粒度趨于變大，且所產(chǎn)生的顆粒的多分散度指數(shù) (PDI)更高。PDI是顆粒在不同尺寸范圍內(nèi)的分布的量度。因而，該方法可以利用諸如玉米 醇溶蛋白的蛋白在水醇溶液和具有約6. 8至約7. 4的接近玉米醇溶蛋白的等電點(diǎn)的選定pH 的水性溶液中的溶解度差異。而且，向第二水相溶液中添加緩沖劑可以在高超聲剪切下或在高壓均化下，或超 聲剪切和高壓均化的組合下進(jìn)行。超聲能和超聲剪切的時(shí)長(zhǎng)對(duì)形成在期望的直徑尺寸范圍 內(nèi)的顆粒可能是特別重要的。超聲剪切能可以從0. 6kff/h至1. 39kff/h進(jìn)行，持續(xù)約2至10 分鐘的時(shí)長(zhǎng)且用有5至10秒鐘作用時(shí)間和1至5秒鐘間隔時(shí)間的脈沖。超聲處理對(duì)產(chǎn)生 在期望的尺寸范圍內(nèi)的顆?？赡苁侵匾摹．?dāng)采用高壓均化時(shí)，該過(guò)程可以使用0. Imm至 0. 25mm之間的孔徑，且在5000至40，OOOpsi的壓力下持續(xù)5至10分鐘的時(shí)間段來(lái)進(jìn)行。第二相的緩沖劑還可以優(yōu)選包含以選定比率的表面活性劑和磷脂。表面活性劑對(duì) 磷脂的比率可以是約2 1%W/V，該比率可以被認(rèn)為產(chǎn)生最期望的結(jié)果。該比率還可以是 1 0.5% /^或1 或1 2%表顯著地，表面活性劑與磷脂的組合的使用 是高度期望的以使所產(chǎn)生的顆粒穩(wěn)定并有助于防止顆粒的聚集(aggregation)。僅通過(guò)舉 例，表面活性劑可以是泊洛沙姆，諸如Pluronie F68，且磷脂可以是卵磷脂?？梢栽诒痉椒?中使用的其他表面活性劑包括其他非離子型表面活性劑，諸如泊洛沙姆(Pluronic )、聚氧 乙烯烷基酯(Brij)、脫水山梨醇酯(Span)、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯(Tween)以及離 子型表面活性劑，諸如琥珀酸二辛酯磺酸鈉(sodium dioctyl sulfosuccinate)、十二烷基 硫酸鈉、苯扎氯銨、十六烷基三甲基溴化銨、正十二烷基三甲基溴化銨，以及聚合物，諸如聚 乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。可以在本方法中使用的其他磷脂包括非離子型和帶電的脂質(zhì)或 磷脂，諸如蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、1，2_ 二油?；?3-三甲基 銨丙烷。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以選定比率(如，0.9% w/w 0.45% w/w)的泊洛沙姆和卵磷脂的組合 產(chǎn)生在約IOOnm至約300nm的期望的直徑尺寸范圍內(nèi)的納米顆粒。已經(jīng)通常發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用 表面活性劑或磷脂導(dǎo)致在該期望的直徑尺寸范圍之外的較大的粒度。然而，根據(jù)本文所公 開(kāi)的方法使用表面活性劑或磷脂將會(huì)導(dǎo)致具有對(duì)于非免疫原性來(lái)說(shuō)期望的尺寸的納米顆 粒。在向第二相的溶液應(yīng)用超聲剪切和/或高壓均化之后，可以攪拌混合物以蒸發(fā)乙 醇或其他溶劑以形成納米顆粒。攪拌可以通過(guò)機(jī)械攪拌器來(lái)進(jìn)行，且可以在室溫下以約300rpm至約500rpm的速率進(jìn)行約三個(gè)小時(shí)。然后，納米顆?？梢詢?yōu)選為了將納米顆粒與殘余物質(zhì)分離的目的經(jīng)受超離心過(guò) 濾。可以使用截留分子量約5000道爾頓的離心過(guò)濾器(或其他合適的具有高于或低于5000 道爾頓的截留分子量的過(guò)濾器)來(lái)進(jìn)行超離心，且以2000g至40000g之間，取決于包封的 分子或藥物，或取決于納米顆粒的特定處理，諸如聚乙二醇化。超離心的時(shí)間可以在20分 鐘至50分鐘之間變化。然后，可以向納米顆粒中添加低溫防護(hù)劑。例如，可以添加2% w/v的海藻糖作為 低溫防護(hù)劑。還可以使用其他低溫防護(hù)劑或凍干防護(hù)劑，諸如糖，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、 聚蔗糖、甜菜堿或甘露醇，或多元醇，諸如甘露醇、山梨糖醇可以用作凍干防護(hù)劑。納米顆粒 可以保持在-80°C以形成固體餅，固體餅隨后被凍干，諸如通過(guò)在高真空下干燥冷凍態(tài)的納 米顆粒。可以改變超聲能的時(shí)長(zhǎng)、表面活性劑的類(lèi)型、表面活性劑的濃度以及緩沖液。以示例的方式，具有約IOOnm至約400nm的尺寸范圍分布的納米顆粒按照下述來(lái) 制備實(shí)施例I在第一水相中，將0. 0135g的白玉米醇溶蛋白溶解在3ml乙醇與0. 25ml水的混合 物中。所使用的玉米醇溶蛋白的濃度或溶劑的組合是任選的；然而，通過(guò)改變玉米醇溶蛋白 的濃度或溶劑的組成可以產(chǎn)生期望的不同尺寸范圍的納米顆粒。通過(guò)應(yīng)用探針式超聲處理 約20秒鐘輔助玉米醇溶蛋白溶解。然后，將第一水相的所得到的溶液逐滴添加到pH為7. 4 的檸檬酸鹽緩沖液和卵磷脂(0. 45% w/v)與Pluronie F68 (0. 9% w/v)的組合的15ml溶液 中，施加恒定的超聲能(1. 39kW/h，37%振幅)作用10分鐘，用10秒鐘的作用時(shí)間和1秒鐘 的間隔時(shí)間的脈沖。在超聲剪切過(guò)程期間，將分散液保持在冰浴中以維持在約10°C的溫度。 接著，將分散液在室溫下置于300至500rpm的磁力攪拌器上，直到乙醇完全蒸發(fā)。在乙醇 完全蒸發(fā)之后，純化納米顆粒以去除任何殘余材料和/或表面活性劑。通過(guò)用去離子的PH 7. 4的檸檬酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌并使用截留分子量為5000道爾頓的離心過(guò)濾器以3590g超 離心50分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)純化。向所得到的玉米醇溶蛋白納米顆粒的水性懸浮液(pH 7. 4的檸 檬酸鹽緩沖液)中添加2% w/v海藻糖作為低溫防護(hù)劑并將納米顆粒保持在-80°C下以形 成固體餅。隨后，在_47°C和60毫托真空下凍干該材料12至14小時(shí)。然后，將納米顆粒儲(chǔ) 存在干燥器中的10°C的冷藏室內(nèi)。在本發(fā)明的可選擇的方法中，可以通過(guò)高壓均化器，使分散液在高壓作用下穿過(guò) 狹窄的孔以便減小粒度來(lái)補(bǔ)充或替代第二相溶液的超聲剪切。當(dāng)使用高濃度的玉米醇溶蛋 白時(shí)，這對(duì)產(chǎn)生較小尺寸范圍的納米顆粒是特別有用的。而且，高壓均化可以用作用于制備 玉米醇溶蛋白納米顆粒的放大方法。下面描述該方法的一個(gè)實(shí)施例。實(shí)施例II將0. 65% w/v的白玉米醇溶蛋白溶解在6ml乙醇與0. 50ml水的混合物中。改變 所得到的第一水相的溶液的組成以獲得約PH 6至約pH 7的期望pH。通過(guò)應(yīng)用探針式超聲 處理約20秒鐘輔助玉米醇溶蛋白溶解。然后，將所得到的第一水相的溶液逐滴添加到pH為 7. 4的檸檬酸鹽緩沖液和卵磷脂(0. 45% w/v)與Pluronic F68(0. 9% w/v)的組合的30ml 溶液中，恒定地施加超聲能(1. 39kW/h，37%振幅)作用2分鐘，用10秒鐘作用時(shí)間和1秒 鐘間隔時(shí)間的脈沖。在超聲剪切過(guò)程期間，將分散液保持在冰浴中以維持在約10°C的溫度。
11接著，使所得到的粗懸浮液在20，OOOpsi下通過(guò)具有0. Imm至0. 25mm之間的孔徑的高壓均 化器(NanoDebee ，USA)5分鐘。在高壓均化過(guò)程期間，通過(guò)在高壓均化器內(nèi)使用冷卻器 來(lái)循環(huán)水使其溫度保持在約10°C。隨后，將分散液保持在300r.p.m至500r.p.m的磁力攪 拌器上且在室溫下，直到乙醇完全蒸發(fā)。在完全蒸發(fā)之后，純化納米顆粒以去除任何殘余材 料或表面活性劑。通過(guò)用PH 7. 4的檸檬酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌并使用截留分子量為5000道 爾頓的離心過(guò)濾器以3590g超離心50分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)純化。將納米顆粒的4毫升的水性懸浮 液(PH 7. 4的檸檬酸鹽緩沖液)與35mg的2% w/v海藻糖混合，并將其保持在_80°C下以 形成固體餅。隨后，在_47°C和60毫托真空下凍干該餅12至14小時(shí)。實(shí)施例I和II中所描述的本發(fā)明的方法可以適合形成其中諸如治療藥物的選定 分子被包封在納米顆粒內(nèi)(圖2)的納米顆粒。本發(fā)明的用于形成包封分子的納米顆粒的 方法的實(shí)施例如下實(shí)施例III將0. 0135g的量的白玉米醇溶蛋白溶解在:3ml乙醇與0. 25ml的0. OlNNaOH的混 合物中以將PH調(diào)節(jié)在6至7之間。向溶液中添加0. 0066g的6，7-羥基香豆素并使混合物 經(jīng)受探針式超聲處理20秒鐘以確保溶解。用10秒鐘作用時(shí)間和1秒鐘間隔時(shí)間的脈沖， 以1. 39kW/h和37%振幅的恒定超聲能作用10分鐘，將所得到的溶液逐滴添加到15ml的包 含0.0675g卵磷脂和0. 135gPlUronic F68的檸檬酸鹽緩沖液(pH 7.4)中。在超聲處理 過(guò)程期間，將溶液保持在冰浴中以維持在約10°C的溫度。接著，將分散液置于300r.p.m至 500r. p. m的磁力攪拌器上且在室溫下，直到乙醇完全蒸發(fā)。在醇完全蒸發(fā)之后，純化納米顆 粒以去除任何過(guò)量的藥物和/或表面活性劑。通過(guò)用PH 7. 4的檸檬酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌 并使用截留分子量為5000道爾頓的離心過(guò)濾器以3590g超離心50分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)純化。向負(fù) 載香豆素的納米顆粒的4毫升水性懸浮液(pH 7. 4的檸檬酸鹽緩沖液)中添加35mg海藻 糖并將其保持在-80°C下以形成固體餅。隨后，在_47°C和60毫托真空下凍干該固體餅12 至14小時(shí)。已經(jīng)顯示出白玉米醇溶蛋白可以合適地用在本發(fā)明的方法中作為基礎(chǔ)蛋白。白玉 米醇溶蛋白得到了可重復(fù)的在約IOOnm至約400nm的期望的窄尺寸范圍內(nèi)的納米顆粒，而 黃玉米醇溶蛋白得到了具有較寬粒度分布的較大的顆粒。此差異闡釋在下面的表1和表2 中。表1提供了根據(jù)上面的實(shí)施例I和實(shí)施例III的方法的由黃玉米醇溶蛋白制備的納米 顆粒的數(shù)據(jù)。顯示了空白的和負(fù)載香豆素的納米顆粒。可以看出，每一種的粒度分別是約 460nm和610nm。通過(guò)比較，如下面的表2所示，根據(jù)實(shí)施例I和實(shí)施例III的方法的由白 玉米醇溶蛋白制備的空白的和負(fù)載香豆素的納米顆粒是較小的。圖3和4顯示了空白的和 負(fù)載香豆素的玉米醇溶蛋白納米顆粒的電子顯微圖像和原子力圖像。表 1.
模型化合物粒度(nm)多分散度指數(shù)(PDI)ξ電勢(shì)(mV)包封效率(％)空白的玉米醇溶蛋白 納米顆粒460±630.46±0.06-10.28 士 2不適用6,7-羥基香豆素610±1230.62±0.08-16.28士398±1.5每一個(gè)值是三次實(shí)驗(yàn)的平均值且具有士 SD。表2.
1權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生非免疫原性納米顆粒的方法，包括 提供不溶于水的疏水蛋白；用水醇溶劑溶解所述蛋白以提供第一水相溶液；在表面活性劑和磷脂存在下，將緩沖劑添加到所述第一水相溶液中以產(chǎn)生具有在約PH 6. 8至約pH 7. 4之間的pH的第二水相溶液；處理所述第二水相溶液以實(shí)現(xiàn)所述溶液內(nèi)顆粒的直徑尺寸的減??； 蒸發(fā)任何殘余溶劑以產(chǎn)生具有小于約400nm的直徑尺寸的納米顆粒；以及 離心所述納米顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在離心之后，凍干所述納米顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，還包括在限制所述納米顆粒暴露于大氣壓的條件下儲(chǔ) 存所述納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基礎(chǔ)蛋白是選定級(jí)的玉米醇溶蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述選定級(jí)的玉米醇溶蛋白是白玉米醇溶蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述緩沖劑是檸檬酸鹽緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述表面活性劑是泊洛沙姆且所述磷脂是卵磷脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述表面活性劑與所述磷脂的比率是2 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述處理所述第二水相溶液以實(shí)現(xiàn)顆粒的直徑尺 寸的減小還包括使所述納米顆粒經(jīng)受超聲剪切、高壓均化或其組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在形成所述第一水相時(shí)向所述蛋白中添加被 選擇用于納米顆粒包封的分子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述分子是被選擇用于施用至受試者的治療物質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，還包括將所述納米顆粒施用至患者。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述蛋白被聚乙二醇化。
14.一種治療活性的非免疫原性納米顆粒，其是根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法形成的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求10所述的方法，還包括交聯(lián)所述納米顆粒。
16.一種治療組合物，其包含通過(guò)將治療分子包封在不溶于水的疏水蛋白中而形成的 非免疫原性納米顆粒，所述納米顆粒具有小于約400nm的尺寸直徑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的治療組合物，其中所述納米顆粒的所述直徑尺寸在約 IOOnm至約300nm之間。
18.包括藥理學(xué)上治療量的含有治療劑的非免疫原性納米顆粒的物質(zhì)在制備用于治療 罹患疾病或疾患或處于罹患疾病或疾患的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的疾病或疾患的藥物中的用途，所 述納米顆粒具有小于400nm的直徑尺寸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述納米顆粒具有約IOOnm至約300nm的直徑 尺寸。
20.根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求21所述的方法，其中所述納米顆粒的所述施用是通過(guò) 口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、局部、鼻或眼部施用途徑。
21.一種用于產(chǎn)生非免疫原性納米顆粒的試劑盒，包括選定量的不溶于水的蛋白； 水醇溶劑，其用于溶解所述蛋白； 至少一種緩沖劑；以及 選定的表面活性劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，還包括以提供與所述選定的表面活性劑組合的選 定比率的量的至少一種選定的磷脂。
全文摘要
描述了用于通過(guò)控制納米沉淀過(guò)程中的pH來(lái)從蛋白源產(chǎn)生非免疫原性納米顆粒的方法。由所公開(kāi)的方法產(chǎn)生的納米顆粒的直徑尺寸在約100nm至約400nm的范圍，且優(yōu)選的直徑尺寸是約100nm至約300nm，由此使顆粒為非免疫原性的。本發(fā)明還公開(kāi)了用于產(chǎn)生適于各種治療、診斷和其他用途的納米結(jié)合物的方法。
文檔編號(hào)C07K1/14GK102066399SQ200980123704
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者奧瑪贊努·P·佩魯馬爾, 拉迪赫·S·考?？? 薩思詩(shī)·K·伯達(dá)拉萊 申請(qǐng)人:南達(dá)科他州立大學(xué)