專利名稱：用于提高泛酸產(chǎn)量的微生物和方法
相關(guān)申請本申請要求遞交于2002年7月3日、名稱為“用于提高泛酸產(chǎn)量的微生物和方法”的美國臨時專利申請?zhí)朜o.60/393,826的優(yōu)先權(quán)。本申請與名稱為“用于提高泛酸產(chǎn)量的微生物和方法”、遞交于2002年1月18日(未決)的國際專利申請?zhí)朜o.PCT/US02/00925有關(guān)，該國際專利申請依次又要求名稱為“用于提高泛酸產(chǎn)量的微生物和方法”、遞交于2002年1月11日(未決)的在先臨時專利申請系列號No.60/347,638、遞交于2001年1月19日(屆滿)的在先臨時專利申請系列號No.60/263,053以及遞交于2001年1月19日(屆滿)的在先臨時專利申請系列號No.60/262,995的權(quán)益。本發(fā)明也與遞交于2000年9月21日(未決)的美國專利申請系列號No.09/667,569有關(guān)，該申請部分為遞交于1999年9月21日(放棄的)的美國專利申請系列號No.09/400,494的延續(xù)。美國專利申請系列號No.09/667,569也要求遞交于2000年6月7日(屆滿)的臨時專利申請系列號No.60/210,072、遞交于2000年7月28日(屆滿)的臨時專利申請系列號No.60/221,836、以及遞交于2000年8月24日(屆滿)的臨時專利申請系列號No.60/227,860的權(quán)益。特此將上文提及的每一個申請的全部內(nèi)容并入作為參考。
背景技術(shù)：
泛酸，也稱之為遍多酸或維生素B5，為維生素B復(fù)合物成員，并且是哺乳動物，包括家畜和人類的必需營養(yǎng)物(如來自食物來源，作為水溶性維生素補充物或作為飼料添加劑)。在細(xì)胞中，泛酸主要地用于輔酶A(CoA)和?；d體蛋白(ACP)的生物合成。這些輔酶在?；糠值拇x中發(fā)揮作用，其中?；c這些分子的4’-磷酸泛酰巰基乙胺部分的巰基形成硫酯。這些輔酶在所有細(xì)胞中都是必不可少的，參與100多種不同的細(xì)胞代謝中間反應(yīng)。
合成泛酸(尤其是生物活性D異構(gòu)體)的常規(guī)方法是從大量的化學(xué)制品進(jìn)行化學(xué)合成，該方法受過高底物耗費以及外消旋中間體旋光拆分需求的阻礙。因此，研究者們近來在尋找能產(chǎn)生在泛酸生物合成過程中有用的酶的細(xì)菌或微生物系統(tǒng)(因為細(xì)菌本身能夠合成泛酸)。尤其是，生物轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)被評價為泛酸優(yōu)選異構(gòu)體的有利制備方法。而且，直接微生物合成方法近來經(jīng)檢驗是利于D-泛酸制備的方法。
然而，仍然顯著需要改善的泛酸生產(chǎn)方法，尤其是，有必要優(yōu)化微生物方法以制備更高產(chǎn)量的期望產(chǎn)物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)泛酸的改進(jìn)方法(如微生物合成)。泛酸生產(chǎn)方法已在相關(guān)申請中描述，其公開了例如經(jīng)改造能過表達(dá)泛酸生物合成途徑和異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶(如參見

圖1)的微生物。改造后這些菌株在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生＞50g/L的泛酸(如參見國際出版物No.WO 01/21772和美國專利申請No.60/262,995)。特別是，增加panB、panC、panD和panE1基因以及ilvBNC和ilvD基因表達(dá)可以導(dǎo)致菌株將葡萄糖(丙酮酸)轉(zhuǎn)化成具有商業(yè)吸引力的量的泛酸。
為提高例如泛酸的生產(chǎn)水平，已經(jīng)在以上所描述方法基礎(chǔ)上發(fā)展了各種改進(jìn)措施。例如，美國專利申請系列No.09/667,569中描述了具有修飾的(例如，活性缺失或降低)泛酸激酶的生產(chǎn)菌株。在這些菌株中，通過減少泛酸在輔酶A(“CoA”)合成中的應(yīng)用而有效提高了泛酸水平。美國專利申請系列No.60/262,995進(jìn)一步描述了改進(jìn)的泛酸生產(chǎn)菌株，所述菌株經(jīng)過改造可使各種泛酸生物合成酶和/或異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶和/或它們各自的底物最少地被應(yīng)用于鑒定為[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的旁路產(chǎn)物的生產(chǎn)。
本發(fā)明詳述了通過調(diào)整生物合成途徑進(jìn)一步提高泛酸產(chǎn)量的方法，所述生物合成途徑提供用于泛酸生物合成途徑的底物，即亞甲基四氫葉酸(“MTF”)生物合成途徑。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過修飾MTF生物合成途徑提高M(jìn)TF的水平可導(dǎo)致泛酸生物合成途徑關(guān)鍵中間體(酮泛解酸)水平的提高。酮泛解酸水平的提高又可以在適宜的工程化菌株中導(dǎo)致泛酸生產(chǎn)水平的顯著提高。實質(zhì)上，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出在過表達(dá)如panB、panC、panD、panE1、ilvBNC和ilvD基因的工程化菌株中類泛酸化合物(panto-compounds)(如泛酸)生產(chǎn)的限制步驟，并在此描述了通過修飾MTF生物合成途徑用于克服此限制的方法。
本文至少描述了三種有效的改變MTF生物合成途徑的方法。一方面，已經(jīng)證實，增加產(chǎn)生泛酸的微生物的培養(yǎng)基中的絲氨酸水平可以導(dǎo)致類泛酸化合物產(chǎn)量的提高。也已證實，增加3-磷酸甘油酸脫氫酶(serA基因產(chǎn)物)的合成或活性或增加絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(glyA基因產(chǎn)物)的合成或活性，由此促進(jìn)在適宜的工程化微生物中絲氨酸和亞甲基四氫葉酸的生物合成，可以增加類泛酸化合物的生產(chǎn)。提高3-磷酸甘油酸脫氫酶(serA基因產(chǎn)物)的合成可以例如，通過利用適當(dāng)工程化的表達(dá)盒過表達(dá)serA來實現(xiàn)。提高絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(glyA基因產(chǎn)物)的合成可以例如通過利用適當(dāng)工程化的表達(dá)盒過表達(dá)glyA來實現(xiàn)。備選地，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(glyA基因產(chǎn)物)的水平可以通過改變對glyA基因的調(diào)控來提高。例如，glyA表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子(即，阻遏物)的編碼基因purR，其突變或缺失可有效提高glyA的表達(dá)。適用于提高類泛酸化合物生產(chǎn)微生物中的MTF水平的其它方法包括對負(fù)責(zé)將甘氨酸轉(zhuǎn)化為MTF的酶(如甘氨酸裂解酶)進(jìn)行去調(diào)節(jié)處理。
因此，在一方面，本發(fā)明涉及用于提高泛解酸和泛酸產(chǎn)量的方法，該方法包括在使泛酸產(chǎn)量得以提高的條件下培養(yǎng)具有修飾的泛酸生物合成酶活性以及具有修飾的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶活性的微生物。在另一方面，本發(fā)明涉及用于提高泛解酸和泛酸產(chǎn)量的方法，該方法包括在使泛酸產(chǎn)量得以提高的條件下培養(yǎng)具有修飾的泛酸生物合成酶活性、具有修飾的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶、以及具有修飾的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶活性的微生物。特別是，本發(fā)明描述了通過提高關(guān)鍵中間體酮泛解酸的水平(通過對其生物合成起作用的酶來提高)增加所需產(chǎn)物(如泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)量的方法。優(yōu)選的方法導(dǎo)致培養(yǎng)微生物36小時后泛酸的生產(chǎn)水平高于50、60、70g/L或更多，或培養(yǎng)微生物36小時后至少生成60、70、80、90、100、110、120g/L或更多的泛酸。本發(fā)明也描述了重組微生物和其培養(yǎng)條件。還描述了該微生物產(chǎn)生的組合物。
本發(fā)明的其他特點和優(yōu)勢將在以下詳細(xì)的描述和權(quán)利要求中彰顯。
附圖簡述圖1為泛酸和異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑的示意圖。泛酸生物合成酶以粗體標(biāo)出，其相應(yīng)基因以斜體顯示。異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶以粗斜體標(biāo)出，其相應(yīng)的基因以斜體顯示。
圖2為大腸桿菌中(及推測地枯草芽孢桿菌中)的亞甲基四氫葉酸(“MTF”)生物合成途徑的示意圖。
圖3為構(gòu)建質(zhì)粒pAN665的示意圖。
圖4為構(gòu)建質(zhì)粒pAN670的示意圖。
圖5為質(zhì)粒pAN004的示意圖。
圖6為質(zhì)粒pAN396的示意圖。
圖7為質(zhì)粒pAN393的示意圖。
圖8為枯草芽孢桿菌purR基因的克隆pAN835F的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖9為被設(shè)計以安裝斷裂的枯草芽孢桿菌purR基因的質(zhì)粒pAN838F的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖10為被設(shè)計以缺失部分serA基因、用于卡那霉素抗性選擇的質(zhì)粒pAN821的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖11為被設(shè)計在serA基因座整合不可擴(kuò)增的P26serA盒、用于Ser+選擇的質(zhì)粒pAN824的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖12為被設(shè)計在serA基因座整合并擴(kuò)增P26serA表達(dá)盒的中等拷貝質(zhì)粒pAN395的結(jié)構(gòu)示意圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生類泛酸化合物(如酮泛解酸、泛解酸和/或泛酸)的改進(jìn)的方法和應(yīng)用于該改進(jìn)方法中的工程化菌株。能夠產(chǎn)生＞50g/L泛酸的菌株可按照國際專利申請系列No.WO 01/21772和美國專利申請系列No.60/262,995中的教導(dǎo)進(jìn)行構(gòu)建。通過增加panB、panC、panD和panE1基因的表達(dá)以及通過增加ilvBNC和ilvD基因的表達(dá)，可設(shè)計出能將葡萄糖(丙酮酸)轉(zhuǎn)化成具有商業(yè)吸引力的量的泛酸的菌株(如，芽孢桿菌屬菌株)。
但是，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在表達(dá)高水平panB基因產(chǎn)物-酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的工程化菌株(如在美國專利申請系列No.09/667,569中描述的PA824和在美國專利申請系列No.60/262,995中描述的PA668-24)中，進(jìn)一步提高泛酸產(chǎn)量的限制步驟仍是α-酮異戊酸(α-KIV)向酮泛解酸的轉(zhuǎn)化。增加α-KIV合成的方法已在國際專利申請系列No.WO 01/21772和美國專利申請系列No.60/262,995中先期描述過。此處我們公開，可以通過改造類泛酸化合物的生產(chǎn)菌株使得MTF水平或MTF合成速率提高或增加，甚至進(jìn)一步地提高泛酸的產(chǎn)量。
因此，本發(fā)明涉及用于提高類泛酸化合物生產(chǎn)的方法，包括調(diào)節(jié)亞甲基四氫葉酸(“MTF”)生物合成途徑。具體地，在類泛酸化合物的生產(chǎn)微生物中提高M(jìn)TF水平是增進(jìn)酮泛解酸生產(chǎn)的一種有效手段，而這又可以導(dǎo)致適當(dāng)工程化的重組微生物中泛解酸和/或泛酸產(chǎn)量的提高。
酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化從α-酮異戊酸(“α-KIV”)和MTF產(chǎn)生酮泛解酸(參見，如圖1)。具體地，該酶催化羥甲基基團(tuán)由MTF轉(zhuǎn)移到α-KIV上生成酮泛解酸。α-KIV和MTF均為該反應(yīng)的底物，因此可增加它們的合成以提高酮泛解酸的產(chǎn)量。圖2中描述了大腸桿菌(以及枯草芽孢桿菌)中用于MTF生物合成的途徑。MTF由四氫葉酸和絲氨酸合成，該反應(yīng)由glyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化。為提高M(jìn)TF的合成，細(xì)胞需增加兩種底物和glyA基因產(chǎn)物的數(shù)量。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括在可使泛酸產(chǎn)量增加的條件下培養(yǎng)微生物，所述微生物具有(i)去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑(例如，具有一個、兩個、三個或四個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶)以及(ii)去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑(例如，具有至少一個或兩個去調(diào)節(jié)的MTF生物合成酶)。泛酸生物合成酶的示例包括酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、酮泛解酸還原酶、泛酸合成酶和門冬氨酸-α-脫羧酶。MTF生物合成酶的示例包括serA基因產(chǎn)物和glyA基因產(chǎn)物。
在另一實施方案，本發(fā)明涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括在可使泛酸產(chǎn)量提高的條件下培養(yǎng)微生物，所述微生物具有(i)去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑(例如，具有一個、兩個、三個或四個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶)，(ii)去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑(例如，具有一個、兩個或三個去調(diào)節(jié)的ilv生物合成酶)和(iii)去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑(例如，具有至少一個或兩個去調(diào)節(jié)的MTF生物合成酶)。ilv生物合成酶的示例包括乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶和二羥酸脫水酶。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的ilv生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑的微生物，從而致使在微生物培養(yǎng)36小時后泛酸的產(chǎn)量為至少50g/L，優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)36小時后泛酸的產(chǎn)量為至少60g/L，且更優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)36小時后泛酸的產(chǎn)量為至少70g/L，最優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)36小時之后產(chǎn)生至少80g/L的泛酸、至少90g/L的泛酸、至少100g/L的泛酸、至少110g/L的泛酸或者至少120g/L的泛酸(或者更多)。
在另一實施方案中，本發(fā)明公開了用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的ilv生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑的微生物，所述去調(diào)節(jié)致使在微生物培養(yǎng)48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為70g/L，優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為80g/L，且更優(yōu)選地致使在微生物培養(yǎng)48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為90g/L。
在一個例示性的實施方案中，MTF生物合成途徑的去調(diào)節(jié)是通過使類泛酸化合物生產(chǎn)菌株中serA基因產(chǎn)物去調(diào)節(jié)實現(xiàn)的，例如通過組成型表達(dá)serA基因，或者通過引入serA的抗反饋等位基因而實現(xiàn)。在另一個例示性的實施方案中，MTF生物合成途徑的去調(diào)節(jié)是通過使類泛酸化合物生產(chǎn)菌株中g(shù)lyA基因產(chǎn)物去調(diào)節(jié)而實現(xiàn)的，例如過表達(dá)glyA基因或通過突變或破壞purR基因產(chǎn)物來調(diào)節(jié)對glyA基因的阻遏作用。在其它例示性的實施方案中，MTF的生物合成通過增加培養(yǎng)基中的絲氨酸或者使甘氨酸裂解酶去調(diào)節(jié)來調(diào)控。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及如以上所描述的方法，其中通過調(diào)節(jié)泛酸激酶的活性(例如，降低泛酸激酶的活性)進(jìn)一步提高泛酸的產(chǎn)量。在一個實施方案中，將CoaA缺失且將CoaX下調(diào)。在另一實施方案中，將CoaX缺失且將CoaA下調(diào)。而在另一實施方案中，將CoaX和CoaA均下調(diào)。本發(fā)明還涉及如以上所描述的方法，其中微生物在絲氨酸過量的條件下培養(yǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如以上所描述的方法，其中微生物的泛酸生物合成途徑被去調(diào)節(jié)致使泛酸的生產(chǎn)不依賴于飼喂β-丙氨酸。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明方法合成的產(chǎn)物，以及包括根據(jù)該方法生產(chǎn)的泛酸的組合物。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明方法中的重組微生物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的重組微生物，所述重組微生物具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的重組微生物，該重組微生物具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的ilv途徑。微生物可進(jìn)一步具有降低的泛酸激酶活性。優(yōu)選的微生物屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，例如枯草芽孢桿菌。
如以上所描述，本發(fā)明的某些方面涉及用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法，所述方法包括培養(yǎng)具有至少去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑的微生物。術(shù)語“泛酸生物合成途徑”包括涉及泛酸形成或合成中利用的泛酸生物合成酶(如編碼生物合成酶的基因所編碼的多肽)、化合物(如底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等等的生物合成途徑。術(shù)語“泛酸生物合成途徑”包括在微生物中(如，在體內(nèi))引起泛酸合成的生物合成途徑和在體外引起泛酸合成的生物合成途徑。
如這里使用的，“具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)(如，過表達(dá))(兩個術(shù)語如這里定義)的泛酸生物合成酶以致使泛酸產(chǎn)量增加(如，與所述微生物在所述生物合成酶去調(diào)節(jié)之前的泛酸產(chǎn)量相比或與野生型微生物相比)的微生物。術(shù)語“泛酸(panthothenate)”包括游離酸形式的泛酸，也稱作“泛酸(pantothenicacid)”，以及其任何鹽(如，通過用陽離子，例如鈣、鈉、鉀、銨、鎂替代泛酸的酸性氫得到的鹽)，也稱作“泛酸鹽(panthothenate salt)”。術(shù)語“泛酸”也包括泛酸的醇衍生物。優(yōu)選的泛酸鹽是泛酸鈣或泛酸鈉。優(yōu)選的醇衍生物是羥泛酸。本發(fā)明的泛酸鹽和/或醇包括可以從這里描述的游離酸通過常規(guī)方法制備的鹽和/或醇。在另一個實施方案中，泛酸鹽由本發(fā)明的微生物直接合成。本發(fā)明的泛酸鹽也可以用常規(guī)方法轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x酸形式的泛酸。術(shù)語“泛酸”在本文中也縮寫為“pan”。
優(yōu)選，“具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)(如，過表達(dá))的泛酸生物合成酶以致使泛酸產(chǎn)量可以達(dá)1g/L或更高的微生物。更優(yōu)選，“具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)(如，過表達(dá))的泛酸生物合成酶以致使泛酸產(chǎn)量可以達(dá)2g/L或更高的微生物。更為優(yōu)選地，“具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)的(如，過表達(dá))泛酸生物合成酶以致使泛酸產(chǎn)量可以達(dá)10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L或更高的微生物。
術(shù)語“泛酸生物合成酶”包括在泛酸生物合成途徑的化合物(如，中間體或產(chǎn)物)的形成中利用的任何酶。例如，泛解酸從α-酮異戊酸(α-KIV)通過中間體酮泛解酸合成。酮泛解酸的形成由泛酸生物合成酶PanB或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(panB基因產(chǎn)物)催化。泛解酸的形成由泛酸生物合成酶PanE1或酮泛解酸還原酶(panE1基因產(chǎn)物)催化。從門冬氨酸合成β-丙氨酸由泛酸生物合成酶PanD或門冬氨酸-α-脫羧酶(panD基因產(chǎn)物)催化。從泛解酸和β-丙氨酸(如，縮合)形成泛酸由泛酸生物合成酶PanC或泛酸合成酶(panC基因產(chǎn)物)催化。泛酸生物合成酶也可以執(zhí)行旁路功能作為這里所述的HMBPA生物合成途徑中的酶。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括培養(yǎng)具有至少一個去調(diào)節(jié)(如，去調(diào)節(jié)以致使泛酸產(chǎn)量增加)的泛酸生物合成酶的微生物，所述酶選自例如PanB(或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或門冬氨酸-α-脫羧酶)、PanE1(或酮泛解酸還原酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括培養(yǎng)具有至少兩個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶的微生物，所述酶選自例如PanB(或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或門冬氨酸-α-脫羧酶)和PanE1(或酮泛解酸還原酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括培養(yǎng)具有至少三個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶的微生物，所述酶選自例如PanB(或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或門冬氨酸-α-脫羧酶)和PanE1(或酮泛解酸還原酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括培養(yǎng)具有至少四個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶的微生物，例如，具有去調(diào)節(jié)的PanB(或酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)、PanC(或泛酸合成酶)、PanD(或門冬氨酸-α-脫羧酶)和PanE1(或酮泛解酸還原酶)的微生物。
在另一個方面，本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑的微生物。術(shù)語“異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑”包括涉及在丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸或異亮氨酸的形成或合成過程中利用的異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶(如編碼生物合成酶的基因所編碼的多肽)、化合物(如底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等等的生物合成途徑。術(shù)語“異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑”包括在微生物中(如，在體內(nèi))引起纈氨酸或異亮氨酸合成的生物合成途徑和在體外引起纈氨酸或異亮氨酸合成的生物合成途徑。
如這里使用的，“具有去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑”的微生物包括具有至少一個去調(diào)節(jié)(如，過表達(dá))(兩個術(shù)語如這里定義)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶致使異亮氨酸和/或纈氨酸和/或纈氨酸前體(α-酮異戊酸(α-KIV))產(chǎn)量增加(如，與所述微生物在所述生物合成酶去調(diào)節(jié)之前的異亮氨酸和/或纈氨酸和/或α-KIV產(chǎn)量相比，或與野生型微生物相比)的微生物。圖1包括異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑的圖解表示。異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶以粗斜體描述，其相應(yīng)基因用斜體字表示。術(shù)語“異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶”包括在異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑的化合物(如，中間體或產(chǎn)物)的形成中利用的任何酶。根據(jù)圖1，從丙酮酸通過中間體(乙酰乳酸、α，β-二羥基異戊酸(α，β-DHIV)和α-酮異戊酸(α-KIV))合成纈氨酸。從丙酮酸形成乙酰乳酸由異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶乙酰羥酸合成酶(ilvBN基因產(chǎn)物，或alsS基因產(chǎn)物)催化。從乙酰乳酸形成α，β-DHIV由異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(ilvC基因產(chǎn)物)催化。從α，β-DHIV合成α-KIV由異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶二羥酸脫水酶(ilvD基因產(chǎn)物)催化。而且，通過支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，纈氨酸和異亮氨酸可與它們各自的α-酮化合物進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化。異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶也可以執(zhí)行旁路功能作為這里所述的HMBPA生物合成途徑中的酶。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括培養(yǎng)具有至少一個去調(diào)節(jié)(如，去調(diào)節(jié)以致使纈氨酸和/或異亮氨酸和/或α-KIV產(chǎn)量增加)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶的微生物，所述酶選自例如IlvBN、AlsS(或乙酰羥酸合成酶)、IlvC(或乙酰羥酸異構(gòu)還原酶)和IlvD(或二羥酸脫水酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括培養(yǎng)具有至少兩個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶的微生物，所述酶選自例如IlvBN、AlsS(或乙酰羥酸合成酶)、IlvC(或乙酰羥酸異構(gòu)還原酶)和IlvD(或二羥酸脫水酶)。在另一個實施方案中，本發(fā)明公開了用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括培養(yǎng)具有至少三個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶的微生物，例如，所述微生物具有去調(diào)節(jié)的IlvBN或AlsS(或乙酰羥酸合成酶)、IlvC(或乙酰羥酸異構(gòu)還原酶)和IlvD(或二羥酸脫水酶)。
如本文所提到的，已發(fā)現(xiàn)泛酸生物合成途徑和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑的酶在[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)的合成或[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途徑中具有旁路活性。術(shù)語“[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(“HMBPA”)生物合成途徑”包括涉及傳統(tǒng)上與泛酸生物合成途徑和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑相關(guān)的、HMBPA形成或合成中所用的生物合成酶和化合物(如底物等)的旁路生物合成途徑。術(shù)語“HMBPA生物合成途徑”包括導(dǎo)致微生物(如體內(nèi))合成HMBPA的生物合成途徑以及導(dǎo)致體外合成HMBPA的生物合成途徑。
術(shù)語“HMBPA生物合成酶”包括在HMBPA生物合成途徑的化合物(如，中間體或產(chǎn)物)的形成中利用的任何酶。例如，從α-酮異戊酸(α-KIV)合成2-羥基異戊酸(α-HIV)由panE1或panE2基因產(chǎn)物(PanE1這里可替換稱作酮泛解酸還原酶)和/或由ilvC基因產(chǎn)物(這里可替換稱作乙酰羥酸異構(gòu)還原酶)催化。從β-丙氨酸和α-HIV形成HMBPA由panC基因產(chǎn)物(這里可替換稱作泛酸合成酶)催化。
術(shù)語“[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionic acid)(“HMBPA”)”包括游離酸形式的HMBPA，也稱作“[R]-3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(propionate)”，及其任何鹽(如，通過用陽離子，例如，鈣、鈉、鉀、銨、鎂替代3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸的酸性氫得到的鹽)，也稱作“3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸鹽(propionic acid salt)”或“HMBPA鹽”。優(yōu)選的HMBPA鹽是HMBPA鈣或HMBPA鈉。本發(fā)明的HMBPA鹽包括可以通過常規(guī)方法從這里所述的游離酸制備的鹽。本發(fā)明的HMBPA鹽也可以通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x酸形式的3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明公開了用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法，包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物。術(shù)語“亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑”指涉及到在PanB底物(MTF)的形成或合成中應(yīng)用的MTF生物合成酶(如由編碼生物合成酶的基因編碼的多肽)、化合物(如底物、中間體或產(chǎn)物)、輔因子等的生物合成途徑。術(shù)語“亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑”指導(dǎo)致體內(nèi)合成MTF的生物合成途徑(如大腸桿菌中的途徑，如在圖2中所示)，以及導(dǎo)致體外合成MTF的生物合成途徑。術(shù)語“亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶”包括在亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的化合物(如中間體或產(chǎn)物)的形成中所應(yīng)用的任何酶。
本發(fā)明至少部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即，使某些MTF生物合成酶去調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致MTF產(chǎn)量的增加。去調(diào)節(jié)后可以導(dǎo)致MTF產(chǎn)量增加的MTF生物合成酶被稱作為“MTF生物合成增強酶”。“MTF生物合成增強酶”的示例為serA基因產(chǎn)物(3-磷酸甘油酸脫氫酶)和glyA基因產(chǎn)物(絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)?！熬哂腥フ{(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑”的微生物為這樣的微生物，其具有至少一個去調(diào)節(jié)的(如過表達(dá))MTF生物合成增強酶從而使得MTF的生產(chǎn)或生物合成提高(例如，與所述微生物在所述生物合成酶去調(diào)節(jié)之前的MTF產(chǎn)量相比或與野生型微生物中的MTF產(chǎn)量相比)。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法，包括培養(yǎng)如此處所定義的具有去調(diào)節(jié)的“亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑”的微生物。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法，包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的MTF生物合成增強酶的微生物。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于提高類泛酸化合物(如泛解酸和/或泛酸)生產(chǎn)的方法，所述方法包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的glyA基因產(chǎn)物(絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)和/或去調(diào)節(jié)的serA基因產(chǎn)物(3-磷酸甘油酸脫氫酶)的微生物。
而本發(fā)明的另一方面涉及用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括在挑選的利于泛酸產(chǎn)生的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物，例如，通過在培養(yǎng)基中使用過量絲氨酸(glyA底物)培養(yǎng)微生物。術(shù)語“過量絲氨酸”包括使絲氨酸水平增加或高于那些常規(guī)用于培養(yǎng)所涉及的微生物的水平。例如，本實施例中描述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在存在約0-2.5g/L絲氨酸的條件下進(jìn)行。相應(yīng)地，過量絲氨酸水平可包括大于2.5g/L的絲氨酸水平，例如，大約2.5至10g/L。過量絲氨酸水平可包括大于5g/L的絲氨酸水平，例如，大約5至10g/L。
而本發(fā)明的另一方面涉及在使泛酸產(chǎn)量進(jìn)一步增加的條件下對此處描述的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，例如，增加如此處所定義的泛酸和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑前體和/或中間體(例如在過量的β-丙氨酸、纈氨酸和/或α-KIV存在下培養(yǎng)微生物)，或備選地，進(jìn)一步修飾該微生物使其在缺乏β-丙氨酸飼喂的條件下能產(chǎn)生顯著水平的β-丙氨酸(即，β-丙氨酸非依賴性微生物，如在美國專利申請系列No.09/09/667,569中所描述的)。
而本發(fā)明的另一方面涉及進(jìn)一步對泛酸生產(chǎn)菌株中的泛酸激酶活性進(jìn)行調(diào)節(jié)以使泛酸產(chǎn)量提高。泛酸激酶為催化從泛酸生成輔酶A(CoA)的關(guān)鍵酶(參見如美國專利申請系列No.09/09/667,569)。調(diào)節(jié)泛酸激酶(如降低泛酸激酶的活性或水平)可以減少CoA的產(chǎn)生，從而利于泛酸的積聚。在一個實施方案中，泛酸激酶活性通過缺失CoaA和下調(diào)CoaX活性而降低(在某些微生物中CoaA和CoaX均可催化CoA生物合成的第一個步驟)。在另一實施方案中，泛酸激酶活性通過缺失CoaX和下調(diào)CoaA而降低。而在另外的實施方案中，泛酸激酶活性通過下調(diào)CoaA和CoaX的活性而降低。
本發(fā)明的各方面將在以下分部分中作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
I.靶向編碼各種泛酸和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)和/或亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶的基因在一個實施方案中，本發(fā)明涉及修飾或增加泛酸和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)和/或亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的各種生物合成酶的水平。特別是，本發(fā)明詳述了通過修飾或改變編碼所述生物合成酶的基因而修飾與所述途徑有關(guān)的各種酶的活性。
這里使用的術(shù)語“基因”包括在生物體中可以通過基因間DNA(即在生物的染色體DNA中天然位于基因側(cè)翼和/或分開基因的間插或間隔DNA)與另一個基因或其它基因分開的核酸分子(如，DNA分子或其片段)?；蛘?，一個基因可以些微重疊另一個基因(如，第一個基因的3’端與第二個基因的5’端重疊)，這些重疊基因通過基因間DNA與其它基因分開。基因可以指導(dǎo)酶或其它蛋白分子合成(如，可以包含編碼序列，例如，編碼蛋白的連續(xù)開放閱讀框架(ORF))或本身可以在生物體中起作用。生物體中的基因可以簇集在操縱子(見本文中的定義)中，所述操縱子通過基因間DNA與其它基因和/或操縱子分開。這里使用的“分離的基因”包括基本不含有在該基因所來源的生物體的染色體DNA中天然位于該基因側(cè)翼的序列(即，不含編碼第二個或不同蛋白的相鄰編碼序列或相鄰結(jié)構(gòu)序列等)的基因，但該基因可以任選包括5’和3’調(diào)節(jié)序列，例如啟動子序列和/或終止序列。在一個實施方案中，分離的基因主要包括蛋白質(zhì)的編碼序列(如，編碼芽孢桿菌蛋白的序列)。在另一個實施方案中，分離的基因包括編碼蛋白的序列(如，編碼芽孢桿菌蛋白的序列)和來自該基因的來源生物體的染色體DNA的相鄰5’和/或3’調(diào)節(jié)序列(如，相鄰5’和/或3’芽孢桿菌調(diào)節(jié)序列)。優(yōu)選，分離的基因含有少于大約10kb，5kb，2kb，1kb，0.5kb，0.2kb，0.1kb，50bp，25bp或10bp的在該基因的來源生物體的染色體DNA中天然位于該基因側(cè)翼的核苷酸序列。
術(shù)語“操縱子”包括至少兩個相鄰基因或ORF，它們?nèi)芜x在至少一個基因或ORF的5’或3’端在序列上重疊。術(shù)語“操縱子”包括含有與一個或多個相鄰基因或ORF(如，編碼酶，例如，生物合成酶的結(jié)構(gòu)基因)相連的啟動子和可能的調(diào)節(jié)元件的基因表達(dá)協(xié)同單位。例如，可以通過與調(diào)節(jié)元件結(jié)合的調(diào)控蛋白或通過抗轉(zhuǎn)錄終止協(xié)同調(diào)節(jié)這些基因(如結(jié)構(gòu)基因)的表達(dá)。操縱子的基因(如結(jié)構(gòu)基因)可轉(zhuǎn)錄為編碼所有蛋白的單一mRNA。
這里使用的“具有突變的基因”或“突變基因”包括具有包含至少一個改變(如置換、插入、缺失)的核苷酸序列的基因，其中所述改變致使由所述突變體編碼的多肽或蛋白顯示出與野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白不同的活性。在一個實施方案中，具有突變的基因或突變基因編碼的多肽或蛋白與野生型基因編碼的多肽或蛋白相比，當(dāng)在例如相似條件下測定(如，在相同溫度下培養(yǎng)的微生物中測定)時，具有增加的活性。這里使用的“活性增加”或“酶活性增加”是指比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高5％的活性，優(yōu)選至少高5-10％，更優(yōu)選至少高10-25％，甚至更優(yōu)選比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高25-50％，50-75％或75-100％，介于上面引用的值中間的范圍，如75-85％，85-90％，90-95％，也旨在包括在本發(fā)明中。這里使用的“活性增加”或“酶活性增加”也可以包括比野生型基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高1.25倍的活性，優(yōu)選至少高1.5倍，更優(yōu)選至少高2倍，甚至更優(yōu)選比野生型基因編碼的多肽或蛋白的活性至少高3倍，4倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍。
在另一個實施方案中，例如，當(dāng)在相似條件下測定時(如，在相同溫度下培養(yǎng)的微生物中測定時)，具有突變的基因或突變基因編碼與野生型基因編碼的多肽或蛋白相比活性降低的多肽或蛋白。突變基因也可不編碼多肽或編碼產(chǎn)量水平降低的野生型多肽。這里使用的“活性降低”或“酶活性降低”是指比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少低5％的活性，優(yōu)選至少低5-10％，更優(yōu)選至少低10-25％，甚至更優(yōu)選比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性至少低25-50％，50-75％或75-100％。介于上面引用的值中間的范圍，如75-85％，85-90％，90-95％，也旨在包括在本發(fā)明中。這里使用的“活性降低”或“酶活性降低”也可以包括活性被消除或“剔除”(如，比野生型核酸分子或基因編碼的多肽或蛋白的活性低大約100％的活性)。
可以根據(jù)任何被很好接受用于測定感興趣的特定蛋白的活性的試驗來確定活性。可以直接測定或檢測活性，例如，測定粗細(xì)胞提取物中的蛋白的活性或從細(xì)胞或微生物分離或純化的蛋白的活性?？晒┻x擇地，可在細(xì)胞或微生物內(nèi)或細(xì)胞外介質(zhì)內(nèi)測定或檢測活性。例如，可以通過使突變基因在微生物例如，具有溫度敏感性酶的突變微生物中表達(dá)，然后檢測突變基因彌補溫度敏感性(Ts)突變體的酶活性的能力，對突變基因(例如，所述編碼降低的酶活性的突變體)進(jìn)行檢測。編碼“增加的酶活性”的突變基因可以是能比例如相應(yīng)野生型基因更有效地彌補Ts突變體的基因。編碼“降低的酶活性”的突變基因是在彌補Ts突變體方面不如例如相應(yīng)野生型基因有效的基因。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，與相應(yīng)野生型多肽或蛋白相比，核酸或基因序列中甚至單一置換(如，在相應(yīng)氨基酸序列中編碼氨基酸改變的堿基置換)也可能急劇地影響所編碼多肽或蛋白的活性。這里定義的突變基因(如，編碼突變多肽或蛋白)可容易地與編碼蛋白同系物(homologue)的核酸或基因區(qū)別，因為突變基因編碼活性改變的蛋白或多肽，并且任選地導(dǎo)致在表達(dá)所述突變基因或產(chǎn)生所述突變蛋白或多肽的微生物(即，突變微生物)中可觀察到與表達(dá)野生型基因的相應(yīng)微生物不同或明顯不同的表型。相反地，蛋白同系物可具有等同或基本相似的活性，任選地導(dǎo)致當(dāng)在微生物中產(chǎn)生時與表達(dá)野生型基因的相應(yīng)微生物相比無可區(qū)別的表型。因此，不是由例如核酸分子、基因、蛋白或多肽間的序列等同程度來區(qū)分同系物和突變體，而是由所編碼的蛋白或多肽的活性來區(qū)分同系物和突變體同系物可以具有例如低序列等同性(如，30-50％序列等同性)然而具有基本等同的功能活性，而突變體可以例如享有99％序列等同性然而具有大大不同或改變的功能活性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也將領(lǐng)會到用于本發(fā)明的核酸分子，基因，蛋白或多肽可來自具有MTF生物合成途徑、ilv生物合成途徑或泛酸生物合成途徑的任何微生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用已知技術(shù)如同源性篩選，序列比較等等鑒定這種核酸分子，基因，蛋白或多肽，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對這些核酸分子，基因，蛋白或多肽進(jìn)行修飾以使其能在重組微生物中表達(dá)或產(chǎn)生(如，通過使用適當(dāng)啟動子、核糖體結(jié)合位點、表達(dá)或整合載體，修飾基因序列使轉(zhuǎn)錄增加(考慮優(yōu)選密碼子使用)等，根據(jù)這里所述的技術(shù)和本領(lǐng)域已知的那些技術(shù)來實現(xiàn))。
在一個實施方案中，本發(fā)明的基因來自革蘭氏陽性微生物生物體(如，由于生物體外圍繞存在革蘭氏陽性壁而保持堿性染色，例如，結(jié)晶紫的微生物)。術(shù)語“來自”(如“來自”革蘭氏陽性微生物)是指在此微生物中天然存在的基因(如革蘭氏陽性微生物的天然基因)。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的基因來自屬于選自芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Cornyebacterium)(如谷氨酸棒桿菌(Cornyebacterium glutamicum))、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(lactococci)和鏈霉菌屬(Streptomyces)屬的屬的微生物。在更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的基因來自芽孢桿菌屬的微生物。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明基因來自選自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、緩病芽孢桿菌(Bacillus lentimorbus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)、泛酸芽孢桿菌(Bacilluspantothenticus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、蘇云金芽孢桿菌(Baciilus thuringiensis)、耐芽孢桿菌(Bacillus halodurans)和其它1組芽孢桿菌種(例如，以16S rRNA型表征的種)的微生物。在另一個優(yōu)選實施方案中，基因來自短芽孢桿菌(Bacillus brevis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的基因來自選自地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的微生物。在特別優(yōu)選的實施方案中，基因來自枯草芽孢桿菌(如，是枯草芽孢桿菌來源的)。術(shù)語“來自枯草芽孢桿菌”或“枯草芽孢桿菌來源的”包括在枯草芽孢桿菌微生物中天然發(fā)現(xiàn)的基因。在本發(fā)明范圍內(nèi)包括芽孢桿菌來源的基因(如，枯草芽孢桿菌來源的基因)，例如，芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌purR基因，serA基因，glyA基因，coaX基因，coaA基因，pan基因和/或ilv基因。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的基因來自革蘭氏陰性(排除堿性染色)微生物。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的基因來自屬于選自沙門氏菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))，埃希氏菌屬(Escherichia)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，沙雷氏菌屬(Serratia)和變形桿菌屬(Proteus)的屬的微生物。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的基因來自埃希氏菌屬的微生物。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的基因來自大腸桿菌(Escherichia coli)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的基因來自酵母屬(Saccharomyces)(如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。
II.重組核酸分子和載體本發(fā)明還涉及包括這里所述的基因(如分離的基因)的重組核酸分子(如重組DNA分子)，所述基因優(yōu)選芽孢桿菌基因，更優(yōu)選枯草芽孢桿菌基因，甚至更優(yōu)選枯草芽孢桿菌泛酸生物合成基因和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成基因和/或亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成基因。術(shù)語“重組核酸分子”包括經(jīng)改變，修飾或工程化(如一個或多個核苷酸插入、缺失或置換)在核苷酸序列方面不同于其所來源的天然或自然核酸分子的核酸分子(如，DNA分子)。優(yōu)選，重組核酸分子(如，重組DNA分子)包括可操作連接調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明的分離基因。短語“可操作連接調(diào)節(jié)序列”意思是感興趣的基因的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許基因進(jìn)行表達(dá)(如，增強的，增加的，組成的，基礎(chǔ)的，衰減的，減少的或阻礙的表達(dá))的方式，優(yōu)選以允許該基因編碼的基因產(chǎn)物表達(dá)(如，當(dāng)將重組核酸分子包括在如這里定義的重組載體中并導(dǎo)入微生物中時)的方式連接。
術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括影響(如，調(diào)制或調(diào)節(jié))其它核酸序列(即基因)表達(dá)的核酸序列。在一個實施方案中，調(diào)節(jié)序列被包括在重組核酸分子中，其相對于感興趣的特定基因的位置和方向與兩者在天然情況下顯示的位置和/或方向相似或等同，如為天然位置和/或方向。例如，感興趣基因可包括在重組核酸分子中與如下調(diào)節(jié)序列可操作連接，所述調(diào)節(jié)序列在天然生物中伴隨或鄰近此感興趣基因(如，可操作連接“天然”調(diào)節(jié)序列(如，連接“天然”啟動子))?？晒┻x擇地，感興趣基因可包括在重組核酸分子中與如下調(diào)節(jié)序列可操作連接，該調(diào)節(jié)序列在天然生物中伴隨或鄰近其它(如，不同的)基因?？晒┻x擇地，感興趣基因可包括在重組核酸分子中與來自另一生物的調(diào)節(jié)序列可操作連接。例如，可以使來自其它微生物的調(diào)節(jié)序列(如，其它細(xì)菌調(diào)節(jié)序列，噬菌體調(diào)節(jié)序列等等)與特定感興趣基因可操作連接。
在一個實施方案中，調(diào)節(jié)序列是非自然或非天然存在的序列(如，已經(jīng)被修飾，突變，置換，衍化，缺失的序列，包括化學(xué)合成的序列)。優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括啟動子、增強子、終止信號、抗終止信號和其它表達(dá)控制元件(如，阻遏物或誘導(dǎo)物結(jié)合的序列和/或，例如，在轉(zhuǎn)錄的mRNA中，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點)。例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版.，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989中描述了這種調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)核苷酸序列在微生物中組成型表達(dá)的那些序列(如，組成型啟動子和強組成型啟動子)，指導(dǎo)核苷酸序列在微生物中可誘導(dǎo)表達(dá)的那些序列(如，誘導(dǎo)型啟動子，例如，木糖誘導(dǎo)型啟動子)和衰減或阻遏核苷酸序列在微生物中的表達(dá)的那些序列(如，衰減信號或阻遏物結(jié)合序列如，PurR結(jié)合位點)。通過去除或缺失調(diào)節(jié)序列來調(diào)節(jié)感興趣基因的表達(dá)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可去除參與轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)的序列以使感興趣基因表達(dá)增強。
在一個實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括可操作地連接啟動子或啟動子序列的編碼至少一個細(xì)菌基因產(chǎn)物(如，泛酸生物合成酶，異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶和/或亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶)的核酸序列或基因。本發(fā)明優(yōu)選的啟動子包括芽孢桿菌啟動子和/或噬菌體啟動子(如，感染芽孢桿菌的噬菌體)。在一個實施方案中，啟動子是芽孢桿菌啟動子，優(yōu)選強芽孢桿菌啟動子(如，芽孢桿菌中與生物化學(xué)管家基因關(guān)聯(lián)的啟動子或芽孢桿菌中與糖酵解途徑基因關(guān)聯(lián)的啟動子)。在另一個實施方案中，啟動子是噬菌體啟動子。在優(yōu)選實施方案中，啟動子來自噬菌體SP01。在尤其優(yōu)選實施方案中，啟動子選自P15，P26或Pveg，具有例如下列各序列GCTATTGACGACAGCTATGGTTCACTGTCCACCAACCAAAACTGTGCTCAGTACCGCCAATATTTCTCCCTTGAGGGGTACAAAGAGGTGTCCCTAGAAGAGATCCACGCTGTGTAAAAATTTTACAAAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTAATTACAGGCGGGGGCAACCCCGCCTGT(SEQ ID NO1)，GCCTACCTAGCTTCCAAGAAAGATATCCTAACAGCACAAGAGCGGAAAGATGTTTTGTTCTACATCCAGAACAACCTCTGCTAAAATTCCTGAAAAATTTTGCAAAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGTATAATAATCTTAACAACAGCAGGACGC(SEQ ID NO2)，和GAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAACGTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTGAGGTGGATGCAATG(SEQ IDNO3)。其它優(yōu)選的啟動子包括tef(翻譯延伸因子(TEF)啟動子)和pyc(丙酮酸羧化酶(PYC)啟動子)，它們可以在芽孢桿菌(如枯草芽孢桿菌)中啟動高水平表達(dá)。其它優(yōu)選的啟動子，例如，當(dāng)用于革蘭氏陽性微生物時，包括但不限于amy和SPO2啟動子。其它優(yōu)選的啟動子，例如，當(dāng)用于革蘭氏陰性微生物時，包括但不限于cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIQ，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括一個或多個終止序列(如，轉(zhuǎn)錄終止序列)。術(shù)語“終止序列”包括起終止mRNA轉(zhuǎn)錄作用的調(diào)節(jié)序列。終止序列(或串聯(lián)轉(zhuǎn)錄終止子)可進(jìn)一步起穩(wěn)定mRNA(如，通過給mRNA添加結(jié)構(gòu))的作用，以例如，抗核酸酶。
在再一個實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括這樣的序列，該序列使得含有它的載體能得以檢測，即，可檢測和/或可選擇標(biāo)記，例如，編碼抗生素抗性序列或能克服營養(yǎng)缺陷突變的基因，例如，trpC，藥物標(biāo)記，熒光標(biāo)記，和/或比色標(biāo)記(如，lacZ/β-半乳糖苷酶)。在再一個實施方案中，本發(fā)明的重組核酸分子包括人工核糖體結(jié)合位點(RBS)或可轉(zhuǎn)錄為人工RBS的序列。術(shù)語“人工核糖體結(jié)合位點(RBS)”包括mRNA分子內(nèi)(如，DNA內(nèi)編碼的)與核糖體結(jié)合(如，以啟動翻譯)的位點，該位點與天然RBS(如，天然基因中發(fā)現(xiàn)的RBS)至少有一個核苷酸不同。優(yōu)選的人工RBS包括大約5-6，7-8，9-10，11-12，13-14，15-16，17-18，19-20，21-22，23-24，25-26，27-28，29-30或更多個核苷酸，其中大約l-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12，13-15或更多個核苷酸與天然RBS(如，感興趣基因的天然RBS，例如，天然panB RBS TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO4)或天然panD RBS ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG(SEQ ID NO5))不同。
優(yōu)選，對差異核苷酸進(jìn)行置換使它們等同于最佳比對進(jìn)行比較時理想RBS中的一個或多個核苷酸。理想RBS包括，但不限于，AGAAAGGAGGTGA(SEQ ID NO6)，TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG(SEQ ID NO7)，TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG(SEQID NO8)，AGAAAGGAGGTGANNNNNNNATG(SEQ ID NO9)，和AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG(SEQ ID NO10)。人工RBS可用于替代與特定基因關(guān)聯(lián)的天然存在的或天然的RBS。優(yōu)選人工RBS增強特定基因的翻譯。優(yōu)選的人工RBS(如，增加panB，例如，芽孢桿菌panB翻譯的RBS)包括CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG(SEQ IDNO11)和CCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG(SEQ ID NO12)。優(yōu)選的人工RBS(如，增加panD，例如，芽孢桿菌panD翻譯的RBS)包括TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG(SEQ ID NO13)，TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG(SEQ ID NO14)，TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG(SEQ ID NO15)，
TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG(SEQ ID NO16)，ATTCGAGAAAGGAGG TGAATATAATATG(SEQ ID NO17)，ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG(SEQ ID NO18)和ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG(SEQ ID NO19)。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了包括這里所述的核酸分子(如，基因或包含所述基因的重組核酸分子)的載體(如重組載體)。術(shù)語“重組載體”包括已經(jīng)被改變，修飾或工程化從而含有與此重組載體所來源的天然或自然核酸分子中所包含的序列相比較多，較少或不同的核酸序列的載體(如，質(zhì)粒、噬菌體、噬粒、病毒、粘?；蚱渌兓暮怂彷d體)。優(yōu)選，重組載體包括可操作地連接如這里定義的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子序列，終止序列和/或人工核糖體結(jié)合位點(RBS))的編碼生物合成酶的基因或包含所述基因的重組核酸分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明的重組載體包括可以增強在細(xì)菌中的復(fù)制的序列(如，增強復(fù)制的序列)。在一個實施方案中，增強復(fù)制的序列在大腸桿菌中起作用。在另一個實施方案中，增強復(fù)制的序列來自pBR322。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的重組載體包括抗生素抗性序列。術(shù)語“抗生素抗性序列”包括促進(jìn)或使宿主生物(如，芽孢桿菌)抵抗抗生素的序列。在一個實施方案中，抗生素抗性序列選自cat(氯霉素抗性)序列，tet(四環(huán)素抗性)序列，erm(紅霉素抗性)序列，neo(新霉素抗性)序列，kan(卡那霉素抗性)序列和spec(壯觀霉素抗性)序列。本發(fā)明的重組載體可進(jìn)一步包括同源重組序列(如，設(shè)計以允許感興趣基因重組到宿主生物的染色體中的序列)。例如，bpr，vpr，或amyE序列可用作同源靶標(biāo)以實現(xiàn)向宿主染色體中的重組。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將領(lǐng)會到載體的設(shè)計可根據(jù)如選擇的待被遺傳改造的微生物，期望的基因產(chǎn)物表達(dá)水平等等因素來進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整。
III.重組微生物本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括如這里所述的載體或基因(如，野生型和/或突變基因)的微生物，即重組微生物。這里使用的術(shù)語“重組微生物”包括已經(jīng)被遺傳改變、修飾或改造(如遺傳工程化)以致與它所來源的天然微生物相比顯示出改變、修飾或不同的基因型和/或表型(如，當(dāng)遺傳學(xué)修飾影響該微生物的編碼核酸序列時)的微生物(如，細(xì)菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞等)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的重組微生物是革蘭氏陽性生物(如，由于存在革蘭氏陽性壁圍繞生物體而保持堿性染色，例如，結(jié)晶紫的微生物)。在優(yōu)選實施方案中，重組微生物是屬于選自芽孢桿菌屬、棒桿菌屬(例如，谷氨酸棒桿菌(Cornyebacterium glutamicum)、乳桿菌屬、乳球菌屬和鏈霉菌屬的屬的微生物。在更優(yōu)選實施方案中，重組微生物是芽孢桿菌屬的微生物。在另一個優(yōu)選實施方案中，重組微生物選自枯草芽孢桿菌，緩病芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，堅強芽孢桿菌，泛酸芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，蠟狀芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，短小芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，耐芽孢桿菌和其它1組芽孢桿菌種(例如，以16S rRNA型表征的種)。在另一個優(yōu)選實施方案中，重組微生物來自短芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。在另一個優(yōu)選實施方案中，重組微生物選自地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。
在另一個實施方案中，重組微生物是革蘭氏陰性(不接受堿性染色)生物。在優(yōu)選實施方案中，重組微生物是選自沙門氏菌屬(例如，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))，埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬，沙雷氏菌屬和變形桿菌屬的屬的微生物。在更優(yōu)選實施方案中，重組微生物是埃希氏菌屬的微生物。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，重組微生物是大腸桿菌。在另一個實施方案中，重組微生物是酵母屬微生物(如，釀酒酵母)。
本發(fā)明優(yōu)選的“重組”微生物是具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑或酶、去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑或酶和/或修飾的或去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑或酶的微生物。術(shù)語“去調(diào)節(jié)的”或“去調(diào)節(jié)”包括改變或修飾微生物的至少一個編碼生物合成途徑中的酶的基因，使微生物中的該生物合成酶的水平或活性改變或變動。優(yōu)選，改變或修飾至少一個編碼生物合成途徑中的酶的基因使基因產(chǎn)物增多或增加。短語“去調(diào)節(jié)的途徑”包括這樣的生物合成途徑，在該途徑中一個以上編碼生物合成途徑中的酶的基因被改變或修飾，以致一個以上的生物合成酶的水平或活性發(fā)生改變或變動。使微生物的生物學(xué)途徑“去調(diào)節(jié)”的能力(如同時去調(diào)節(jié)給定生物合成途徑中的一個以上基因)在有些情況下源自微生物的一種特殊現(xiàn)象，即微生物中一個以上的酶(如，兩個或三個生物合成酶)可以由術(shù)語稱作“操縱子”(見這里的定義)的連續(xù)基因物質(zhì)上彼此鄰近存在的基因編碼。由于包括在操縱子中的基因被協(xié)同調(diào)節(jié)，單一啟動子和/或調(diào)節(jié)元件的改變或修飾即可導(dǎo)致該操縱子編碼的每個基因產(chǎn)物的表達(dá)都發(fā)生改變或變動。調(diào)節(jié)元件的改變或修飾可包括，但不限于，去除內(nèi)源性啟動子和/或調(diào)節(jié)元件，添加強啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或多個啟動子或去除調(diào)節(jié)序列使基因產(chǎn)物表達(dá)被改變，改變基因或操縱子在染色體中的位置，改變與基因或操縱子相鄰的或位于操縱子內(nèi)的核酸序列如核糖體結(jié)合位點，增加基因或操縱子的拷貝數(shù)量，修飾參與基因或操縱子轉(zhuǎn)錄和/或基因或操縱子的(一個或多個)基因產(chǎn)物翻譯的蛋白(如，調(diào)節(jié)蛋白、抑制因子、增強子、轉(zhuǎn)錄激活物等等)，或本領(lǐng)域中使基因表達(dá)去調(diào)節(jié)的任何其它常規(guī)方法(包括但不限于反義核酸分子的使用，例如，以阻斷阻抑蛋白的表達(dá))。去調(diào)節(jié)也可涉及改變一個或多個基因的編碼區(qū)，以得到例如可抵抗反饋作用或具有更高或更低的比活性的酶。
在另一個優(yōu)選實施方案中，設(shè)計或改造重組微生物使至少一個泛酸生物合成酶、至少一個異亮氨酸-纈氨酸生物合成酶和/或至少一個MTF生物合成酶過表達(dá)。術(shù)語“過表達(dá)的”或“過表達(dá)”包括基因產(chǎn)物(如生物合成酶)的表達(dá)水平比該微生物操作前的表達(dá)水平高或比未接受操作的可比較微生物中的表達(dá)水平高。在一個實施方案中，微生物可被遺傳設(shè)計或改造以過表達(dá)基因產(chǎn)物，從而使基因產(chǎn)物水平比沒有被改造的可比較微生物中的表達(dá)水平高。
遺傳學(xué)改造(工程化)可包括，但不限于，改變或修飾與特定基因表達(dá)關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)序列或位點(如，添加強啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或多個啟動子或去除調(diào)節(jié)序列使表達(dá)成為組成型的)，改變特定基因的染色體位置，改變與特定基因鄰近的核酸序列如核糖體結(jié)合位點，增加特定基因的拷貝數(shù)量，修飾參與特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的蛋白(如，調(diào)節(jié)蛋白、抑制因子、增強子、轉(zhuǎn)錄激活物等等)，或本領(lǐng)域中使特定基因表達(dá)去調(diào)節(jié)的其它任何常規(guī)方法(包括但不限于反義核酸分子的使用，例如，以阻斷阻抑蛋白的表達(dá))。遺傳學(xué)改造也可包括缺失基因，例如，以阻斷生物學(xué)途徑或去除阻遏物。
在另一個實施方案中，可從物理上或環(huán)境上操作微生物以過表達(dá)基因產(chǎn)物，使基因產(chǎn)物水平高于微生物操作前的表達(dá)水平或高于沒有被操作的可比較微生物中的表達(dá)水平。例如，可以在存在已知或猜測可以增加特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的試劑時培養(yǎng)微生物或用這些試劑處理微生物，使轉(zhuǎn)錄和/或翻譯增強或增加?？晒┻x擇地，可以在能增加特定基因轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物翻譯的選擇溫度下培養(yǎng)微生物，使轉(zhuǎn)錄和/或翻譯增強或增加。
IV.重組微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵術(shù)語“培養(yǎng)”包括使本發(fā)明的活微生物維持和/或生長(如，使培養(yǎng)物或菌株維持和/或生長)。在一個實施方案中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在另一個實施方案中，在固體或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。在優(yōu)選實施方案中，在包含對微生物的維持和/或生長而言必需或有益的營養(yǎng)物質(zhì)(如，碳源或碳底物，例如碳水化合物，碳?xì)浠衔铮?，脂，脂肪酸，有機酸和醇；氮源，例如，胨，酵母提取物，肉膏，麥芽汁，大豆粉，大豆面粉，大豆粗磨粉，尿素，硫酸銨，氯化銨，硝酸銨和磷酸銨；磷源，例如，磷酸，其鈉和鉀鹽；微量元素，例如，鎂，鐵，錳，鈣，銅，鋅，硼，鉬，和/或鈷鹽；以及生長因子如氨基酸，維生素，生長促進(jìn)劑等等)的培養(yǎng)基(如，無菌的液體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。
優(yōu)選，在受控pH下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語“受控pH”包括可以引起期望產(chǎn)物(如，泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生的任何pH。在一個實施方案中，在大約pH7培養(yǎng)微生物。在另一個實施方案中，在6.0和8.5之間的pH培養(yǎng)微生物。期望的pH可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法維持。
也優(yōu)選，在受控通氣下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語“受控通氣”包括足以導(dǎo)致期望產(chǎn)物(如，泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生的通氣(如，氧氣)。在一個實施方案中，通氣由調(diào)節(jié)培養(yǎng)物中的氧水平來控制，例如，由調(diào)節(jié)溶解在培養(yǎng)基中的氧量來控制。優(yōu)選，通過攪拌培養(yǎng)物來控制培養(yǎng)物的通氣。攪拌可以用螺旋槳或類似機械攪拌裝置，用旋轉(zhuǎn)或搖動培養(yǎng)容器(如，管或燒瓶)或用各種泵裝置來提供。還可以將無菌空氣或氧氣通入培養(yǎng)基(如，通入發(fā)酵混合物)控制通氣。也優(yōu)選，在沒有過量泡沫(如，通過添加消泡劑)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。
此外，可在受控溫度下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物。術(shù)語“受控溫度”包括可以引起期望產(chǎn)物(如，泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生的任何溫度。在一個實施方案中，受控溫度包括15℃和95℃之間的溫度。在另一個實施方案中，受控溫度包括15℃和70℃之間的溫度。優(yōu)選溫度是20℃至55℃，更優(yōu)選30℃至50℃。
可以在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(如維持和/或生長)微生物，優(yōu)選利用常規(guī)培養(yǎng)方法如固定培養(yǎng)、試管培養(yǎng)、搖動培養(yǎng)(如，旋轉(zhuǎn)搖動培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)等)、通風(fēng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或發(fā)酵，連續(xù)或間斷地培養(yǎng)。在優(yōu)選實施方案中，在搖瓶中培養(yǎng)微生物。在更優(yōu)選實施方案中，在發(fā)酵罐中(如，發(fā)酵方法)培養(yǎng)微生物。本發(fā)明的發(fā)酵方法包括但不限于分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵過程或方法。短語“分批方法”或“分批發(fā)酵”是指培養(yǎng)基、養(yǎng)料、補充添加劑等等的組成在發(fā)酵開始時設(shè)定并且在發(fā)酵過程中不進(jìn)行改變的系統(tǒng)，然而，可以嘗試控制如pH和氧氣濃度等因素以防止過度培養(yǎng)基酸化和/或微生物死亡。短語“補料分批方法”或“補料分批”發(fā)酵是指隨著發(fā)酵的進(jìn)行添加(如，遞增或連續(xù)添加)一種或多種底物或補充物的分批發(fā)酵。短語“連續(xù)方法”或“連續(xù)發(fā)酵”是指這樣的系統(tǒng)，其中將規(guī)定的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)添加到發(fā)酵罐中同時移去等量使用過的培養(yǎng)基或“條件”培養(yǎng)基，優(yōu)選用于回收期望產(chǎn)物(如泛解酸和/或泛酸)。已經(jīng)開發(fā)出多種此類方法，且它們是本領(lǐng)域熟知的。
短語“在使期望化合物產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)”包括在適宜或足以產(chǎn)生期望化合物或產(chǎn)生期望產(chǎn)量的特定化合物的條件下(如，溫度，壓力，pH，持續(xù)時間等)對微生物進(jìn)行維持和/或生長。例如，可以使培養(yǎng)持續(xù)足以產(chǎn)生期望量化合物(如，泛解酸和/或泛酸)的時間。優(yōu)選，培養(yǎng)持續(xù)足以基本達(dá)到適當(dāng)化合物產(chǎn)量的時間(如，足以達(dá)到適當(dāng)?shù)姆航馑岷?或泛酸濃度或適當(dāng)?shù)姆航馑岷?或泛酸HMBPA比率的時間)。在一個實施方案中，持續(xù)培養(yǎng)大約12至24小時。在另一個實施方案中，持續(xù)培養(yǎng)大約24至36小時，36至48小時，48至72小時，72至96小時，96至120小時，120至144小時，或超過144小時。在再一個實施方案中，在可導(dǎo)致大約36小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約5至10g/L化合物，大約48小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約10至20g/L化合物，或大約72小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約20至30g/L化合物的條件下培養(yǎng)微生物。在再一個實施方案中，在可導(dǎo)致大約36小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約5至20g/L化合物，大約48小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約20至30g/L化合物，大約72小時內(nèi)產(chǎn)生至少大約30至50或60g/L化合物的條件下培養(yǎng)微生物。而在另一實施方案中，在可導(dǎo)致于約36小時內(nèi)至少產(chǎn)生約40到60g/L化合物，或約48小時內(nèi)至少產(chǎn)生約60到90g/L化合物的條件下培養(yǎng)微生物。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將會理解，通過此處描述的方法也可獲得高于此處所引范圍的上限的數(shù)值，例如，在特定的發(fā)酵程序中或應(yīng)用特定的工程化菌株。
優(yōu)選地，本發(fā)明的生產(chǎn)方法導(dǎo)致泛酸的生產(chǎn)水平“與適當(dāng)?shù)膶φ障啾忍岣摺薄Ｐg(shù)語“適當(dāng)?shù)膶φ铡?，如此處所定義，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的適于確定加強的、增加的或提高的所需產(chǎn)物水平的任何對照。例如，當(dāng)方法涉及培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑的微生物且該微生物進(jìn)一步具有去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑(即，經(jīng)過改造使至少一個MTF生物合成酶去調(diào)節(jié)，例如，過表達(dá))時，適當(dāng)?shù)膶φ瞻ㄔ诓僮鱉TF酶或途徑之前的微生物或未進(jìn)行此操作的微生物的培養(yǎng)物(即僅具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑)。同樣，當(dāng)方法涉及培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的ilv生物合成途徑的微生物且該微生物進(jìn)一步具有去調(diào)節(jié)的MTF生物合成途徑(即經(jīng)過改造使至少一個MTF生物合成酶去調(diào)節(jié)，例如，過表達(dá))時，適當(dāng)?shù)膶φ瞻ㄔ诓僮鱉TF酶或途徑之前的微生物或未進(jìn)行此操作的微生物(即僅具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑和ilv生物合成途徑)的培養(yǎng)物。不必在根據(jù)本發(fā)明實踐的每一方法中均進(jìn)行比較。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過例如在相同或類似的條件下進(jìn)行一系列反應(yīng)(如試管培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、發(fā)酵)，根據(jù)經(jīng)驗確定適當(dāng)?shù)膶φ?。例如，在明了特定菌株的常?guī)生產(chǎn)水平的條件下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠識別較此水平增強的、增加的或提高的生產(chǎn)水平。換言之，與適當(dāng)對照的比較包括與預(yù)先確定的數(shù)值(如預(yù)先確定的對照)的比較。
這樣，在一個實施方案中，當(dāng)適宜的工程化菌株在36小時內(nèi)產(chǎn)生40g/L的泛酸時(在使泛酸產(chǎn)量提高的操作之前)，50、60、70g/L或更多的泛酸產(chǎn)量(操作后，例如，在使至少一個MTF生物合成酶過表達(dá)的操作之后)則為產(chǎn)量提高的示例。同樣，在一個實施方案中，當(dāng)適宜的工程化菌株在48小時內(nèi)產(chǎn)生50g/L泛酸(在使泛酸產(chǎn)量提高的操作之前)時，60、70、80、90g/L或更多的泛酸產(chǎn)量(操作后，例如，在使至少一個MTF生物合成酶過表達(dá)的操作之后)則為產(chǎn)量提高的示例。
本發(fā)明的方法還可以包括回收期望化合物(如，泛解酸和/或泛酸)的步驟。術(shù)語“回收”期望化合物包括從培養(yǎng)基中提取，收獲，分離或純化化合物?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)分離或純化方法回收化合物，這些方法包括但不限于用傳統(tǒng)樹脂處理(如，陰離子或陽離子交換樹脂，非離子吸附樹脂等)，用傳統(tǒng)吸附劑處理(如，活性炭，硅酸，硅膠，纖維素，礬土等)，改變pH，溶劑提取(如，用常規(guī)溶劑如醇、乙酸乙酯、己烷等等)，透析，過濾，濃縮，結(jié)晶，重結(jié)晶，pH調(diào)節(jié)，冷凍干燥等等。例如，從培養(yǎng)基中回收化合物可以通過首先從培養(yǎng)物中移出微生物來進(jìn)行。然后可以使培養(yǎng)基通過或加載于陽離子交換樹脂上以去除陽離子，然后通過或加至陰離子交換樹脂上以去除無機陰離子和比感興趣化合物具有更強酸性的有機酸。所得化合物可隨后轉(zhuǎn)化成如這里所述的鹽(如，鈣鹽)。
優(yōu)選，“提取”、“分離”或“純化”本發(fā)明的期望化合物使所得制品基本上不含其它培養(yǎng)基成分(如，不含培養(yǎng)基成分和/或發(fā)酵副產(chǎn)物)。短語“基本上不含其它培養(yǎng)基成分”包括其中期望化合物與產(chǎn)生它的培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物已相分離的期望化合物制品。在一個實施方案中，該制品中有多于大約80％的期望化合物(干重)(如，少于大約20％的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物)，更優(yōu)選多于大約90％的期望化合物(如，少于大約10％的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物)，再更優(yōu)選多于大約95％的期望化合物(如，少于大約5％的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物)，和最優(yōu)選多于大約98-99％的期望化合物(如，少于大約1-2％的其它培養(yǎng)基成分或發(fā)酵副產(chǎn)物)。當(dāng)期望化合物已經(jīng)衍生為鹽時，優(yōu)選該化合物進(jìn)一步不含與形成該鹽相關(guān)的化學(xué)污染物。當(dāng)期望化合物已經(jīng)衍生為醇時，優(yōu)選該化合物進(jìn)一步不含與醇形成相關(guān)的化學(xué)污染物。
在可供選擇的實施方案中，并不從微生物中純化期望化合物，例如，當(dāng)微生物在生物學(xué)上無危險性(如，安全)時。例如，可將全部培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)用作產(chǎn)物(如，粗產(chǎn)物)來源。在一個實施方案中，使用未經(jīng)修飾的培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)。在另一個實施方案中，濃縮培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)。在另一個實施方案中，干燥或冷凍干燥培養(yǎng)物(或培養(yǎng)上清)。
而在另一實施方案中，期望化合物被部分純化。術(shù)語“部分純化”包括已至少經(jīng)過一些加工，例如，用商用樹脂處理(如批處理)的培養(yǎng)基制品。在優(yōu)選的實施方案中，“部分純化的”制品含有大于約30％(干重)的期望化合物，優(yōu)選地大于約40％的期望化合物，更優(yōu)選地大于約50％的期望化合物，更優(yōu)選地大于約60％的期望化合物，且最優(yōu)選地大于約70％的期望化合物?！安糠旨兓摹敝破芬矁?yōu)選含有80％或少于80％(干重)的期望化合物(即純度小于此處所述的“提取的”、“分離的”或“純化的”制品)。
根據(jù)所操作的生物合成酶或生物合成酶的組合，為了產(chǎn)生期望化合物，可能期望或需要給本發(fā)明微生物提供(如，飼喂)至少一種生物合成前體。術(shù)語“生物合成前體”或“前體”包括這樣的試劑或化合物，當(dāng)提供、接觸微生物，或包括在微生物的培養(yǎng)基中時其起增強或增加期望產(chǎn)物的生物合成的作用。在一個實施方案中，生物合成前體或前體是門冬氨酸。在另一個實施方案中，生物合成前體或前體是β-丙氨酸。優(yōu)選門冬氨酸或β-丙氨酸的添加量可以導(dǎo)致培養(yǎng)基中的濃度足夠增加微生物的生產(chǎn)力(如，足以增加泛解酸和/或泛酸產(chǎn)量的濃度)。本發(fā)明的生物合成前體可以以濃縮溶液或懸浮液形式(如，在適宜溶劑，如水或緩沖液中)或固體形式(如，粉末形式)添加。此外，本發(fā)明的生物合成前體可以以單份額添加，連續(xù)或間斷給予給定的一段時間。術(shù)語“β-丙氨酸過量”包括使β-丙氨酸水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所涉及的微生物的水平。例如，本實施例中所述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0-0.01g/L β-丙氨酸存在下進(jìn)行。因此，過量β-丙氨酸水平可包括大約0.01-1，優(yōu)選大約1-20g/L的水平。
在另一個實施方案中，生物合成前體是纈氨酸。在另一個實施方案中，生物合成前體是α-酮異戊酸。優(yōu)選，纈氨酸或α-酮異戊酸的添加量可以導(dǎo)致培養(yǎng)基中的濃度足以引起期望化合物(如泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生。術(shù)語“α-KIV過量”包括使α-KIV水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所述微生物的水平。例如，本實施例中所述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0-0.01g/Lα-KIV存在下進(jìn)行。因此，過量α-KIV水平可包括大約0.01-1g/L，優(yōu)選大約1-20g/Lα-KIV。術(shù)語“纈氨酸過量”包括使纈氨酸水平增加或高于常規(guī)用于培養(yǎng)所涉及的微生物的水平。例如，本實施例中所述的芽孢桿菌微生物的培養(yǎng)常規(guī)在大約0-0.5g/L纈氨酸存在下進(jìn)行。因此，過量纈氨酸水平可包括大約0.5-5g/L，優(yōu)選大約5-20g/L纈氨酸。
而在另一實施方案中，生物合成前體為絲氨酸。優(yōu)選地，絲氨酸以導(dǎo)致培養(yǎng)基中的濃度足以引起期望化合物(如泛解酸和/或泛酸)產(chǎn)生的量添加。也可根據(jù)此處描述的生產(chǎn)方法加入過量的絲氨酸(如此處所定義)，例如，用于提高泛酸的產(chǎn)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，極度過量的生物合成前體可能對微生物產(chǎn)生毒性。生物合成前體這里也稱作“補充的生物合成底物”。
本發(fā)明的另一個方面包括以這里所述的重組微生物為特征的生物轉(zhuǎn)化方法。術(shù)語“生物轉(zhuǎn)化方法”，這里也稱作“生物轉(zhuǎn)變方法”，包括導(dǎo)致適當(dāng)?shù)孜锖?或中間體化合物生成(如，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)變成)期望產(chǎn)物的生物學(xué)方法。
生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的微生物和/或酶以允許它們執(zhí)行預(yù)期功能(如，產(chǎn)生期望化合物)的形式存在。微生物可以是整個細(xì)胞，或可以僅僅是獲得期望的最終結(jié)果所需的那些細(xì)胞部分?？梢詫⑽⑸飸腋?如，在適當(dāng)溶液如緩沖溶液或培養(yǎng)基中)，洗滌(如，洗滌以除去培養(yǎng)微生物時的培養(yǎng)基)，丙酮干燥，固定(如，用聚丙烯酰胺凝膠或κ-角叉菜膠或在合成載體，例如，珠，基質(zhì)等等上)，固著，交聯(lián)或透化處理(如，透化處理膜和/或壁以便化合物，例如，底物、中間體或產(chǎn)物可更容易通過所述膜或壁)。
本發(fā)明進(jìn)一步由以下實施例作舉例說明，但所述實施例不應(yīng)視為本發(fā)明的限制。在此申請中的全部參考文獻(xiàn)、專利和出版的專利申請的內(nèi)容均在此引用作為本發(fā)明的參考。
實施例實施例I類泛酸化合物生產(chǎn)菌株在開發(fā)芽孢桿菌菌株用于泛酸生產(chǎn)時，對參與泛酸生物合成途徑和異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑(圖1)的基因和酶實施了多種遺傳操作，如在美國專利申請系列No.09/400,494和美國專利申請系列No.09/667,569中所描述的。例如，具有去調(diào)節(jié)的panBCD操縱子和/或具有去調(diào)節(jié)的panE1的菌株表現(xiàn)出增加的泛酸產(chǎn)量(當(dāng)在β-丙氨酸和α-酮異戊酸(α-KIV)存在的條件下培養(yǎng)時)。進(jìn)一步使ilvBNC和ilvD去調(diào)節(jié)的菌株在僅存在β-丙氨酸的條件下即表現(xiàn)出增加的泛酸產(chǎn)量。此外，可以通過進(jìn)一步去調(diào)節(jié)panD以實現(xiàn)不依賴于β-丙氨酸。
泛酸生產(chǎn)菌株的一個示例PA824為色氨酸原養(yǎng)型，Spec和Tet抗性，在panBCD座位有去調(diào)節(jié)的panBCD，在panE1座位有去調(diào)節(jié)的panE1(在枯草芽孢桿菌基因組中有兩個基因與大腸桿菌的panE同源，即，panE1和panE2，前者編碼參與泛酸生產(chǎn)的主要酮泛解酸還原酶，而panE2對泛酸合成無貢獻(xiàn)(美國專利申請系列No.09/400,494))，在ilvD座位有去調(diào)節(jié)的ilvD，在amyE座位過表達(dá)ilvBNC盒子且在bpr座位過表達(dá)panD。當(dāng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵方法在14L發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)48小時后，PA824常規(guī)產(chǎn)生約40-50g/L的泛酸(參見如，臨時專利申請系列No.60/263,053或臨時專利申請系列No.60/262,995，在此引用作為參考)。簡言之，在含痕量元素的分批培養(yǎng)基(4.5L)中接種PA824的搖瓶培養(yǎng)物?？刂瓢l(fā)酵的溫度(如，43℃)、溶解的O2和pH值，且按葡萄糖限制性分批補料方法進(jìn)行發(fā)酵。第一批葡萄糖消耗后，葡萄糖的濃度通過連續(xù)補給新鮮流加培養(yǎng)基(FEED medium)維持在約0到1g/L之間。pH值設(shè)定在7.2，并進(jìn)行監(jiān)控和通過加入NH3-或H3PO4-溶液進(jìn)行維持。溶解氧濃度[pO2]通過調(diào)節(jié)攪動和通氣速率維持在約10-30％。通過加入適當(dāng)?shù)南輨┛刂婆菽纬?。離心移除細(xì)胞后測定(通過HPLC分析)發(fā)酵肉湯中的泛酸滴度。
第二個示例菌株為PA668。PA668為PA824的衍生物，含額外拷貝的在vpr和/或panB座位擴(kuò)增的P26panB。PA668應(yīng)用panB表達(dá)載體(pAN636)構(gòu)建，這使得可以應(yīng)用氯霉素進(jìn)行多拷貝的篩選。簡言之，連接pAN636的NotI限制性片段(不含載體序列)，然后用于轉(zhuǎn)化PA824，用含5μg/ml氯霉素的平板進(jìn)行篩選。分離可以抗30μg/ml氯霉素的轉(zhuǎn)化體，并在48小時試管培養(yǎng)物中篩選泛酸的產(chǎn)量。此分離株產(chǎn)生比PA824約多10％的泛酸。在10-L的發(fā)酵物中，第一菌株P(guān)A668-2A與在類似的條件下培養(yǎng)的PA824產(chǎn)生數(shù)量相當(dāng)?shù)姆核?如在36小時時為～45-50g/L)。36小時后，當(dāng)PA824的泛酸產(chǎn)生例行開始減慢時，PA668-2A仍持續(xù)產(chǎn)生相當(dāng)高水平的泛酸(如在48小時時為～60-65g/L的泛酸)。第二菌株P(guān)A668-24產(chǎn)生泛酸的速率甚至更快，48小時后達(dá)到60-70g/L。
第三個生產(chǎn)菌株P(guān)A721B-39按如下所述改造以進(jìn)一步含有可擴(kuò)增的P26panBpanD盒子。首先，構(gòu)建一單獨的表達(dá)盒子，所述盒子能夠使panB和panD整合在bpr座位。兩個基因結(jié)合在一個表達(dá)盒子中通過消除抗生素抗性標(biāo)記簡化了所產(chǎn)生的菌株。構(gòu)建P26panBpanD表達(dá)盒子使其含有兩個不同的panD核糖體結(jié)合位點(RBS已先期在國際公開No.WO01/21772和美國專利申請No.60/262,995中合成并測試)。盒子進(jìn)一步包括合成的panB基因核糖體結(jié)合位點(RBS1)，但此設(shè)計允許將來通過簡單的寡核苷酸盒子替換來改變panB RBS。在構(gòu)建的第一步中，panB基因與兩個panD基因盒子連接，如圖3所示的pAN665的構(gòu)建。然后，將產(chǎn)生的panBpanD盒子轉(zhuǎn)移到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體pOTP61中，見圖4中所示。構(gòu)建的每一質(zhì)粒(pAN670和pAN674)的基本特征總結(jié)在表1中。
表1.含不同枯草芽孢桿菌panBpanD基因表達(dá)盒子的質(zhì)粒
這些新質(zhì)粒從單一載體上組合產(chǎn)生額外的PanB和PanD，且相對存在于PA668中的panB表達(dá)載體(pAN636)，預(yù)期其產(chǎn)生水平增高的PanB。在泛酸生產(chǎn)菌株中安裝P26panBpanD載體的策略利用了bpr和panE1間的遺傳連鎖。首先通過用分離自PA930(panE1∷cat)的染色體DNA轉(zhuǎn)化菌株并篩選氯霉素抗性，構(gòu)建PA824的衍生物，該衍生物的內(nèi)在panD表達(dá)盒子被除去。通過對四環(huán)素的敏感性篩選產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株，對兩株名為PA715的Tet敏感性分離株進(jìn)行保存。該菌株為測試P26 panBpanD載體的宿主菌株(參見以下)。為恢復(fù)PA715中的P26 panE1盒子，用每一載體首先轉(zhuǎn)化PA328菌株，該菌株含P26 panE1但不含整合在bpr座位的盒子。PA328確實含有P26 panBCD座位，但其未進(jìn)行過量產(chǎn)生α-KIV的改造。應(yīng)用來自這兩個載體的適當(dāng)NotI限制性片段獲得抗四環(huán)素的PA328轉(zhuǎn)化體，產(chǎn)生的菌株命名為PA710和PA714。
下一步是將此盒子轉(zhuǎn)入PA715，以使其可在PA824菌株背景中進(jìn)行評價。以上通過從菌株P(guān)A710和PA714中分離染色體DNA、應(yīng)用兩種DNA單獨轉(zhuǎn)化PA715并應(yīng)用四環(huán)素抗性篩選來實現(xiàn)。通過對氯霉素的敏感性來篩選四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)化體；這可鑒定出通過與bpr座位的P26 panBpanD盒子連鎖還從供體DNA獲得P26 panE1基因的期望轉(zhuǎn)化體。獲得了來自轉(zhuǎn)化反應(yīng)的氯霉素敏感分離株，此反應(yīng)中PA710或PA714染色體DNA用作供體。保存在試管培養(yǎng)試驗中產(chǎn)生最高泛酸滴度的分離株。這些菌株分別命名為PA717和PA721。重復(fù)兩次進(jìn)行新菌株以及PA824和PA715的試管培養(yǎng)，菌株生長在SVY+10g/L門冬氨酸中，43℃培養(yǎng)48小時后測試泛酸、HMBPA和β-丙氨酸。此外，對每一菌株的提取物進(jìn)行SDS-PAGE膠實驗。試管培養(yǎng)試驗的結(jié)果在表2中顯示。
表2.培養(yǎng)在加有10g/L門冬氨酸的SVY中的PA717和PA72l菌株的泛酸產(chǎn)量
如預(yù)期，每一新菌株產(chǎn)生的泛酸和β-丙氨酸均多于PA715。兩個菌株(PA717-24和PA721-39)與PA824產(chǎn)生的泛酸大約相同，而PA721-35產(chǎn)生的泛酸多于PA824。所有三個新菌株產(chǎn)生的HMBPA均少于PA824。蛋白質(zhì)凝膠分析顯示三個新菌株產(chǎn)生的PanB均多于任何一個對照菌株。
菌株P(guān)A717-24、PA721-35和PA721-39也在基于豆粉的培養(yǎng)基中在搖瓶培養(yǎng)中進(jìn)行了評價。如在表3中顯示，這些具有可擴(kuò)增的P26panBpanD盒子的菌株產(chǎn)生的泛酸和HMBPA的水平與同時含有獨立的可擴(kuò)增P26panB和P26panD盒子的PA668-2和PA668-24菌株中觀察到的水平類似。
表3.搖瓶實驗48小時
條件40ml培養(yǎng)基/200ml帶擋板的搖瓶、4X生物防護(hù)蓋(Bioshield covers)、300rpm、2.5％接種物(1.0ml)。
大豆培養(yǎng)基20g/l Cargill 200/20豆粉、8g/l(NH4)2SO4、5g/l谷氨酸鹽、1×PSTE、0.1M磷酸鹽pH 7.2和0.3M MOPS pH 7.2。60g/l葡萄糖或麥芽糖w/10mM鎂和1.4mM鈣。
重復(fù)兩次試驗的燒瓶的平均值。
除了產(chǎn)生泛酸(以及其他在圖1和本文中描述的類泛酸化合物)，已經(jīng)證明某些用于生產(chǎn)商用數(shù)量的期望類泛酸化合物的工程化菌株也產(chǎn)生鑒定為3-(2-羥基-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸(HMBPA)的副產(chǎn)物(此處也稱為“β-丙氨酸2-(R)-羥基異戊酸”、“β-丙氨酸2-羥基異戊酸”、“β-丙氨酰-α-羥基異戊酸”和/或“fantothenate”)。(術(shù)語“fantothenate”本文中也簡寫為“fan”。)。
HMBPA是[R]-α-羥基異戊酸(α-HIV)和β-丙氨酸的縮合產(chǎn)物，由PanC酶催化產(chǎn)生。α-HIV是α-KIV還原產(chǎn)生的，該反應(yīng)是由α-酮還原酶PanE(如，PanE1和/或PanE2)和/或IlvC催化的反應(yīng)。由此提出，在微生物中存在至少兩個途徑競爭α-KIV(生物合成酶PanB的底物)，這兩個途徑即泛酸生物合成途徑和HMBPA生物合成途徑。(競爭α-KIV的第三個和第四個途徑是導(dǎo)致從α-KIV產(chǎn)生纈氨酸或亮氨酸的途徑，如見圖1)。泛酸生物合成途徑和HMBPA生物合成途徑至少還產(chǎn)生競爭酶PanC的底物，即α-HIV和泛解酸。HMBPA的產(chǎn)生可能對泛酸的產(chǎn)生有顯著影響。例如，HMBPA途徑可以與泛酸途徑競爭前體(α-KIV和β-丙氨酸)和一些酶(PanC，PanD，PanE1和/或IlvC)。另外，因為HMBPA的結(jié)構(gòu)與泛酸的結(jié)構(gòu)相似，它可能具有負(fù)面調(diào)節(jié)泛酸途徑中的一個或多個步驟的不受歡迎的性能?；贖MBPA的鑒定，美國臨時專利申請系列No.60/262,995教導(dǎo)了，使泛酸生物合成過程與HMBPA生物合成過程相比能更有利地利用底物(α-KIV和β-丙氨酸)和/或酶(PanC，PanD，PanE1和/或IlvC)的任何方法均可改進(jìn)或優(yōu)化泛酸的制備。
實施例II通過增加絲氨酸利用度提高泛酸產(chǎn)量至少一種優(yōu)化泛酸生產(chǎn)的方法涉及調(diào)節(jié)微生物培養(yǎng)物中的絲氨酸的利用度。特別是，可以證實，增加絲氨酸的利用度可導(dǎo)致泛酸產(chǎn)量的提高(如相對于HMBPA的生產(chǎn))，而降低絲氨酸的利用度可導(dǎo)致泛酸的生產(chǎn)相對于HMBPA的生產(chǎn)有所降低。該方法基于這樣的理解，即源自絲氨酸的化合物一亞甲基四氫葉酸(MTF)在泛酸生物合成反應(yīng)中將其羥甲基基團(tuán)交給α-KIV以產(chǎn)生酮泛解酸(如參見圖1和2)。這樣，調(diào)節(jié)絲氨酸水平是調(diào)節(jié)酮泛解酸水平的一個有效方法，而這又可以調(diào)節(jié)在適宜的工程化微生物中泛解酸和/或泛酸的生產(chǎn)。為證實該調(diào)節(jié)作用，將PA824在試管培養(yǎng)基中43℃培養(yǎng)48小時，所述培養(yǎng)基為SVY葡萄糖外加5g/L的β-丙氨酸和±5g/L的絲氨酸。
表4加入或不加入絲氨酸時PA824的泛酸和HMBPA產(chǎn)量
如表4中顯示的數(shù)據(jù)所證實，絲氨酸的加入增加了泛酸的生產(chǎn)水平(而相反降低了HMBP的產(chǎn)量)。
實施例III.改造細(xì)菌細(xì)胞以增加絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(glyA基因產(chǎn)物)的量作為飼喂絲氨酸的備選方案，提高絲氨酸水平和/或絲氨酸利用水平(且相應(yīng)地，亞甲基四氫葉酸水平)以調(diào)節(jié)泛酸生產(chǎn)水平的另一方法是增加3-磷酸甘油酸脫氫酶或絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(分別為serA和glyA基因產(chǎn)物)的合成或活性，以由此增加在適宜的工程化微生物中的絲氨酸和亞甲基四氫葉酸的生物合成。
通過用含枯草芽孢桿菌glyA基因的表達(dá)盒子轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌細(xì)胞來增強glyA基因的表達(dá)，在盒子中所述基因克隆在強組成型啟動子的下游。為構(gòu)建此表達(dá)盒子，用在表5中描述的引物RY417和RY418通過PCR從分離自枯草芽孢桿菌PY79的染色體DNA中擴(kuò)增glyA基因。
表5用于擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的glyA和serA的引物
RY417含有的RBS2合成核糖體結(jié)合位點正好位于XbaI位點的下游。然后，用XbaI和BamHI切割擴(kuò)增的DNA并克隆在載體pAN004(圖5)的XbaI和BamHI位點之間，以生成質(zhì)粒pAN396(圖6；SEQ ID NO24)。pAN004載體在緊接XbaI克隆位點的上游含有噬菌體SP01 P26啟動子以驅(qū)動克隆的glyA基因的表達(dá)。恰在表達(dá)盒子的下游，pAN396含有可以在枯草芽孢桿菌中行使功能的cat基因。為轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，從pAN396中分離含P26glyA盒子和cat基因的N0tI DNA片段、使其自連接并轉(zhuǎn)化導(dǎo)入枯草芽孢桿菌PY79感受態(tài)細(xì)胞中。篩選出幾株氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體并命名為PA1007和PA1008。從每個菌株中分離染色體DNA并用于轉(zhuǎn)化PA721B-39和PA824感受態(tài)細(xì)胞以分別產(chǎn)生PA1011和PA1014菌株。對篩選的PA1011和PA1014分離株的細(xì)胞提取物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，證實這些菌株與其親本菌株P(guān)A721B-39(實施例I中描述)和PA824(在國際公布No.WO 01/21772中描述)相比含有數(shù)量增加的glyA基因產(chǎn)物。為試驗增強glyA表達(dá)對泛酸生產(chǎn)的影響，PA1011和PA1014在試管培養(yǎng)基(培養(yǎng)基為SVY葡萄糖外加5g/L的β-丙氨酸)中在43℃培養(yǎng)48小時。如表6中提供的數(shù)據(jù)所顯示，PA1014的泛酸產(chǎn)量(4.5g/L)多于其親本菌株P(guān)A824的產(chǎn)量(3.2g/L)。同樣，PA1011的平均泛酸產(chǎn)量(4.35g/L)也多于其親本菌株P(guān)A721B-39的產(chǎn)量(4.05g/L)。
表6.比較PA1011和PA1014與PA721B-39和PA824的泛酸和HMBPA產(chǎn)量.
實施例IV.改造細(xì)菌細(xì)胞以提高其3-磷酸甘油酸脫氫酶(serA基因產(chǎn)物)量。
serA基因產(chǎn)物3-磷酸甘油酸脫氫酶為絲氨酸生物合成途徑中第一個發(fā)揮作用的酶(參見圖2)。由于絲氨酸為MTF合成的底物之一，我們改造了serA基因使其過表達(dá)以增加細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸水平。與實施例III中描述的用于glyA基因的方法類似，通過用含枯草芽孢桿菌serA基因的表達(dá)盒子(盒中該基因克隆在強組成型啟動子下游)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌細(xì)胞來增強serA基因的表達(dá)。為構(gòu)建表達(dá)盒子，用表5中描述的引物RY405和RY406通過PCR從分離自枯草芽孢桿菌PY79的染色體DNA中擴(kuò)增serA基因。然后用XbaI和BamHI切割擴(kuò)增的DNA并克隆到載體pAN004(圖5)的XbaI和BamHI位點之間，以生成質(zhì)粒pAN393(圖7，SEQ ID NO25)。為轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，從pAN393中分離含P26serA盒子和cat基因的NotIDNA片段、自連接并轉(zhuǎn)化導(dǎo)入枯草芽孢桿菌PY79感受態(tài)細(xì)胞中。篩選出幾株氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體并命名為PA1004和PA1005。從每個菌株中分離染色體DNA并用于轉(zhuǎn)化PA721B-39和PA824感受態(tài)細(xì)胞以分別產(chǎn)生PA1010和PA1013菌株。對篩選的PA1010和PA1013分離株的細(xì)胞提取物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，證實這些菌株與其親本菌株P(guān)A721B-39和PA824相比含有數(shù)量增加的serA基因產(chǎn)物。
為試驗增強serA表達(dá)對泛酸生產(chǎn)的影響，將PA1010和PA1013在試管培養(yǎng)基(此培養(yǎng)基為SVY葡萄糖外加5g/L的β-丙氨酸)中43℃培養(yǎng)48小時。如表7中提供的數(shù)據(jù)所顯示，PA1010的平均泛酸產(chǎn)量(4.7g/L)多于其親本菌株P(guān)A721B-39的產(chǎn)量(4.1g/L)。同樣，PA1013的平均泛酸產(chǎn)量(4.1g/L)多于其親本菌株P(guān)A824的產(chǎn)量(3.1g/L)。
表7.比較PA1010和PA1013與PA721B-39和PA824的泛酸和HMBPA產(chǎn)量.
實施例V.應(yīng)用serA和glyA表達(dá)增強的菌株進(jìn)行的搖瓶和發(fā)酵罐實驗。
基于試管試驗的結(jié)果，選擇具有可擴(kuò)增的serA盒子的兩菌株和具有可擴(kuò)增的gly盒子的兩菌株，其各來自親本菌株P(guān)A824和PA721B-39。四株菌與親本一道在搖瓶中培養(yǎng)(表8)。在大豆面粉MOPS葡萄糖(SMG)培養(yǎng)基中，四株菌產(chǎn)生的泛酸均多于其親本菌株。在大豆面粉MOPS麥芽糖(SMM)培養(yǎng)基中，四株菌中的一株表現(xiàn)出優(yōu)于其親本株。
來自各自親本的serA過表達(dá)株和glyA過表達(dá)株在10升的Chemap臺式發(fā)酵罐中同時培養(yǎng)。glyA過表達(dá)株P(guān)A1014-3(來源于PA824)在SMM中產(chǎn)生的泛酸滴度最高，而在發(fā)酵罐中也有最佳表現(xiàn)(表9)。在36小時，菌株P(guān)A1014-3的培養(yǎng)物上清中的泛酸產(chǎn)量為71g/l且在48小時培養(yǎng)物上清中的泛酸產(chǎn)量為86g/l，與之比較其親本PA824的產(chǎn)量分別為41g/l和46g/l。serA菌株P(guān)A1012-4的培養(yǎng)物上清中的泛酸產(chǎn)量也顯著高于PA824對照，在36和48小時時分別為52g/l和60g/l。這些結(jié)果清楚地證明增加glyA和serA的有效性。
PA721B-39的serA過表達(dá)和glyA過表達(dá)衍生物也明顯地較其親本有所改進(jìn)。二者培養(yǎng)48小時后在培養(yǎng)物上清中均產(chǎn)生約80g/l的泛酸(分別為82g/l和79g/l)。相對于PA824衍生物，PA721B-39衍生物中提高的PanB水平的效應(yīng)亦顯示在HMBPA的減少上。PA721B-39和其衍生物48小時后產(chǎn)生的HMBPA低于PA824或甚至低于PA668-24。增加GlyA也表現(xiàn)出可減少碳流向HMBPA。
表8.搖瓶生產(chǎn)評價過表達(dá)serA或glyA的泛酸生產(chǎn)菌株
所有數(shù)據(jù)為兩次重復(fù)試驗搖瓶培養(yǎng)物48小時后的平均值。
條件40ml培養(yǎng)基/200ml帶擋板的搖瓶，4X生物防護(hù)蓋，300rpm，2.5％的接種物及43℃培養(yǎng)。
培養(yǎng)基20g/Cargill 200/20豆粉，1×PSTE，8g/l(NH4)2SO4和5g/l谷氨酸鹽。
緩沖液0.1M磷酸鹽pH7.2以及0.3M MOPS pH7.2。
碳源(單獨滅菌，作為20倍貯液)60g/l葡萄糖或麥芽糖w/10mM鎂和1.4mM鈣。
表9.過表達(dá)serA或glyA的泛酸生產(chǎn)菌株用10升發(fā)酵罐評價。
應(yīng)用的培養(yǎng)基為PFM-222。除以下的變化外與在美國系列No.60/262,995(2001年1月19日提交)中描述的PFM-155培養(yǎng)基相同，所述的變化為(1)在分批材料中沒有Amberex 1003。Cargill 200/20(豆粉)40g/L已改變?yōu)镃argill 20-80(大豆粗磨粉)50g/L，MgSO4·7H2O替換為MgCl2·7H2O，1g/L，且SM-1000X替換為PSTE-1000X(PSTE-1000X＝MnCl2·4H2O，2.0g/L；ZnSO4·7H2O，1.5g/L；CoCl2·6H2O，2.0g/L；CuSO4·5H2O，0.25g/L；Na2MoO4·2H2O，0.75g/L)。在補料材料中SM-1000X替換為PSTE-1000X。
提高泛酸產(chǎn)量也可在單一菌株中組合過表達(dá)serA和glyA來實現(xiàn)，和/或通過引入突變來實現(xiàn)，所述突變導(dǎo)致serA或glyA或二者均抵抗反饋作用。
實施例VI.通過突變purR基因提高glyA基因的表達(dá)如實施例III和V所述，glyA基因的表達(dá)可通過添加其中g(shù)lyA基因由強組成型啟動子驅(qū)動的一個或多個拷貝的表達(dá)盒提高。提高glyA表達(dá)的替代方法是改變對其的調(diào)節(jié)。描述glyA∷lacZ融合物的文獻(xiàn)提示glyA啟動子在正常條件下是中等強度的(約400Miller單位)，但是如果其負(fù)調(diào)控因子purR基因缺失的話，該啟動子能夠被誘導(dǎo)至相對的高水平(1,800 Miller單位)(Saxild等(2001)J.Bacteriol.1836175-6183)。因此，進(jìn)行實驗以確定是否glyA的表達(dá)以及由此泛酸產(chǎn)量可通過缺失泛酸生產(chǎn)菌株中的purR而得以提高。
由PY79染色體DNA通過PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌purR基因，并將所得片斷克隆到PvuII切割的pGEM5-Zf(+)載體DNA中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pAN835F(SEQ ID NO26，圖8)。這個步驟消除了插入物兩端的PvuII位點，留下位于purR開放讀框中間的唯一的PvuII位點。下一步，將來自pAN363F(SEQ ID NO27)的含革蘭氏陽性卡那霉素抗性基因的平端PCRDNA片斷連接到pAN835F的此唯一PvuII位點中，以產(chǎn)生pAN838F(SEQID NO28，圖9)。
然后將pAN838F轉(zhuǎn)化到PY79、PA668-24和PA824中，以10mg/l進(jìn)行卡那霉素抗性選擇，產(chǎn)生新的菌株系列，分別命名為PA1059、PA1060和PA1061。通過PCR證明所有新分離菌株均含有由雙交換事件所預(yù)期的被破壞的purR∷kan等位基因。對幾個PA1060和PA1061分離株在生長于SVY葡萄糖+β-丙氨酸的試管培養(yǎng)物中進(jìn)行了泛酸產(chǎn)量測試(表10)。衍生自PA668-24的最佳分離株P(guān)A1060-2和PA1060-4分別將3.0g/l泛酸提高到5.3至5.1g/l，這是75％的提高。同樣地，衍生自PA824的最佳分離株P(guān)A1061-1和PA1061-2將泛酸產(chǎn)量從約3.1g/l提高到5.4g/l，也是75％的增長。這些結(jié)果提示glyA基因在這些菌株中通過purR基因的破壞而得以被充分誘導(dǎo)。或者，PA1060和PA1061中泛酸產(chǎn)量的提高可能是由于更為復(fù)雜的多效作用引起。在任何情況下，解除purR調(diào)節(jié)子的調(diào)控作用對泛酸生產(chǎn)均具有正面效果。
在其它實施方案中，可以在其它泛酸生產(chǎn)菌株中實施purR破壞，例如那些具有整合的P26serA等位基因或者不止一個拷貝的P26panBCD操縱子的菌株。purR基因也可用作為添加期望的表達(dá)盒如P26panB的位點。也可以利用對鳥嘌呤類似物例如8-氮雜鳥嘌呤的抗性作為對purR突變的選擇方法。
表10.在于SVY葡萄糖+5g/lβ-丙氨酸中生長的試管培養(yǎng)物中含破壞的purR的PA824和PA668-24衍生物的泛酸和fantothenate產(chǎn)量
b.d.＝檢測不到*接種菌落所取自的培養(yǎng)皿中的抗生素濃度實施例VII.由非擴(kuò)增型盒過表達(dá)serA基因本實施例描述了提高絲氨酸產(chǎn)量的另一種方法，其中一個兩步操作將強組成型啟動子(P26)置于染色體serA基因的前面。構(gòu)建了兩個質(zhì)粒，分別含有來自天然serA基因緊上游區(qū)域的大約700個堿基對的DNA序列。第一個質(zhì)粒pAN821也含有serA編碼區(qū)的3’部分，并且在前述兩序列之間含有卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO30，圖10)。當(dāng)轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌中時，進(jìn)行卡那霉素抗性選擇，pAN821將引起serA基因被破壞，導(dǎo)致絲氨酸營養(yǎng)缺陷型。這產(chǎn)生了稱之為ΔserA∷kan等位基因的遺傳序列。
被設(shè)計用于引入P26serA結(jié)構(gòu)的第二個質(zhì)粒，通過在pAN395中在P26啟動子5’端插入serA上游序列構(gòu)建。所得質(zhì)粒pAN824示于圖11(SEQ IDNO31)。質(zhì)粒pAN395類似于實施例IV中所述的pAN393。serA基因的開放讀框利用枯草芽孢桿菌PY79DNA作為模板通過PCR合成。上游引物含XbaI位點和中等強度的合成核糖體結(jié)合位點RBS2。下游引物含BamHI位點。該serA開放讀框被用來取代中等拷貝質(zhì)粒pAN006中的panBCD基因，以產(chǎn)生pAN395(SEQ ID NO29，圖12)。該質(zhì)粒含有自P26啟動子表達(dá)的serA基因和RBS2核糖體結(jié)合位點。
將來自pAN821的ΔserA∷kan等位基因引入到菌株P(guān)A824中以產(chǎn)生PA1026。如預(yù)期的那樣，PA1026在基本培養(yǎng)基中不生長。在第二步中，將來自質(zhì)粒pAN824的P26serA盒引入到PA1026中，進(jìn)行絲氨酸原養(yǎng)型選擇，產(chǎn)生PA1028。幾個PA1028分離株通過診斷性PCR證實具有預(yù)期的染色體結(jié)構(gòu)(P26serA)。然后對這些分離株在于SVY+5g/lβ-丙氨酸中生長48小時的試管培養(yǎng)物中進(jìn)行泛酸產(chǎn)量測試(表11)。PA1028分離株(衍生自PA824)使泛酸產(chǎn)量提高10％到25％。如表12所示，在搖瓶實驗中，PA824產(chǎn)生大約7g/l泛酸，而PA1028產(chǎn)生11g/l。
實施例VIII.構(gòu)建含整合的非擴(kuò)增型P26serA盒以及擴(kuò)增型P26glyA盒的泛酸生產(chǎn)菌株因為整合在serA處的非擴(kuò)增型P26serA盒導(dǎo)致更高的泛酸合成(參見例如表12)，并且因為glyA處的氯霉素擴(kuò)增型P26glyA盒導(dǎo)致高得多的泛酸合成(參見例如PA1014-3，表8)，我們提出將兩者組合可能具協(xié)同作用。菌株P(guān)A1028-4為PA824的衍生物，其含整合在serA處的非擴(kuò)增型P26serA盒，利用來自PA1014-3的染色體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化以獲得5mg/l的氯霉素抗性，產(chǎn)生命名為PA1038的菌株系列，現(xiàn)在這些菌株含有氯霉素可擴(kuò)增的P26glyA盒子。利用在SVY+β-丙氨酸中生長的標(biāo)準(zhǔn)試管培養(yǎng)物對PA1038分離株進(jìn)行泛酸產(chǎn)量測試(表13)。如預(yù)期的那樣，PA1038的泛酸產(chǎn)量表現(xiàn)出顯著提高，由PA824的約4.2g/l到PA1038組的6.6至7.5g/l。如表12所示對PA1038-3和PA1038-12分離株進(jìn)一步在搖瓶中進(jìn)行了測試。兩者都產(chǎn)生平均13.6g/l的泛酸，相比之下PA824產(chǎn)生7.4g/l的泛酸。
表11.于SVY+5g/lβ-丙氨酸中生長48小時的試管培養(yǎng)物中，在serA基因座含單拷貝P26serA的PA824衍生物的泛酸和fantothenate產(chǎn)量
b.d.＝檢測不到表12.過表達(dá)serA和/或glyA的泛酸生產(chǎn)菌株的搖瓶評價
所有數(shù)據(jù)為一式雙份搖瓶培養(yǎng)物48小時后的平均值。
條件40ml培養(yǎng)基/200ml擋板式搖瓶，4X Bioshield covers，300rpm，2.5％接種物及43℃。
接種物SVY基w/麥芽糖43℃24小時。
培養(yǎng)基20g/l Cargill 200/20大豆粉，8g/l(NH4)2SO4，5g/l谷氨酸鹽及1xPSTE。
緩沖液0.1M磷酸鹽pH 7.2和0.3M MOPS pH 7.2。
碳源(作為20X貯液單獨滅菌)30g/l麥芽糖，5mM MgCl2和0.7mM CaCl2。
表13.在serA處含非擴(kuò)增型P26serA盒、而在glyA處含擴(kuò)增型P26glyA盒的PA824衍生物PA1038的泛酸產(chǎn)量
試管培養(yǎng)物使用SVY葡萄糖+5g/lβ-丙氨酸在43℃培養(yǎng)48小時。
實施例IX.通過改變甘氨酸裂解途徑提高M(jìn)TF產(chǎn)量如上述實施例所證明的那樣，提高細(xì)菌中的MTF產(chǎn)量可以提高已通過操縱panBCD和/或panE基因而被工程化以產(chǎn)生更多泛酸的菌株的泛酸產(chǎn)量。已證明泛酸產(chǎn)量可通過提高glyA或serA基因的表達(dá)而得以提高。如實施例III到V以及VII到VIII所證明的那樣，可利用更強的啟動子或核糖體結(jié)合位點來提高glyA或serA的表達(dá)。備選地，如實施例VI所舉例說明的那樣，芽孢桿菌中g(shù)lyA基因的表達(dá)可通過破壞purR阻遏基因而去調(diào)節(jié)。
提高M(jìn)TF產(chǎn)量的另一種方法是增強甘氨酸裂解途徑中的酶的表達(dá)。例如，由gcvT、gcvPA、gcvPB、gcvH及pdhD基因編碼的酶催化甘氨酸裂解為MTF、CO2和NH3。強組成型啟動子例如之前描述過的SP01噬菌體P26啟動子，可克隆到gcvT-gcvPA-gcvPB操縱子前或者gcvH或pdhD基因的前面以增強其表達(dá)。除上述方法以外，可額外向培養(yǎng)基中添加便宜的甘氨酸，以進(jìn)一步提高如本文所述工程化的任何菌株的MTF產(chǎn)量。
等同方案 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，或只需使用常規(guī)試驗即能夠確定本文所述的本發(fā)明具體實施方案的很多等同方案。這些等同方案旨在包括在下列權(quán)利要求中。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>用于提高泛酸產(chǎn)量的微生物和方法<130>BGI-154PC2<150>60/393826<151>2002-07-03<160>31<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>194<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述啟動子序列<220>
<221>-35_signal<222>(136)..(141)<220>
<221>-10_signal<222>(159)..(164)<400>1gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa 60tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa 120ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg 180gcaaccccgc ctgt 194<210>2<211>163<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述啟動子序列<220>
<221>-35_signal<222>(113)..(118)<220>
<221>-10_signal<222>(136)..(141)<400>2gcctacctag cttccaagaa agatatccta acagcacaag agcggaaaga tgttttgttc 60tacatccaga acaacctctg ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt tgttgacttt 120atctacaagg tgtggtataa taatcttaac aacagcagga cgc 163<210>3<211>127<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述啟動子序列<220>
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<221>-10_signal<222>(98)..(103)<400>3gaggaatcat agaattttgt caaaataatt ttattgacaa cgtcttatta acgttgatat 60aatttaaatt ttatttgaca aaaatgggct cgtgttgtac aataaatgta gtgaggtgga 120tgcaatg 127<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點<400>4taaacagag gaggagaaaa catg 24<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點<400>5attcgagaaa tggagagaat ataatatg28<210>6<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點<400>6agaaaggagg tga13
<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點<220>
<221>misc_feature<222>17，18，19，20<223>n＝a，t，c，或g<400>7ttaagaaagg aggtgannnn atg 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點<220>
<221>misc_feature<222>16，17，18，19，20<223>n＝a，c，t，或g<400>8ttagaaagga ggtgannnnn atg 23<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點<220>
<221>misc_feature<222>14，15，16，17，18，19，20<223>n＝a，c，t，或g<400>9agaaaggagg tgannnnnnn atg 23<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點<220>
<221>misc_feature<222>14，15，16，17，18，19<223>n＝a，c，t，或g
<400>10agaaaggagg tgannnnnna tg 22<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述核糖體結(jié)合位點<400>19attcgtagaa aggaggtgaa ttaatatg 28<210>20<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5′PCR引物<223>針對serA基因<400>20ccctctagag gaggagaaaa catgtttcga gtattggtct cagacaaaat g 51<210>21<211>43<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述3′PCR引物<223>針對serA基因<400>21cccggatcca attatggcag atcaatgagc ttcacagaca caa 43<210>22<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5′PCR引物<223>針對glyA基因<400>22ggatctagag gaggtgtaaa catgaaacat ttacctgcgc aagacgaa 48<210>23<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述3′PCR引物<223>針對glyA基因<400>23cggggatccc ccatcaacaa ttacacactt ctattgattc tac 43<210>24<211>7926<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述serA過表達(dá)<223>質(zhì)粒<400>24gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020tatcttgata ataagggtaa ctattgaatt cggtaccaag agtttgtaga aacgcaaaaa 1080ggccatccgt caggatggcc ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc 1140ctgcccgcca ccctccgggc cgttgcttcg caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg 1200tcctactcag gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg 1260
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<223>人工序列的描述glyA過表達(dá)<223>質(zhì)粒<400>25gaattttgcg gccgcttcga aagctgtaat ataaaaacct tcttcaacta acggggcagg 60ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480
tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020tatcttgata ataagggtaa ctattgaatt cggtaccaag agtttgtaga aacgcaaaaa 1080ggccatccgt caggatggcc ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc 1140ctgcccgcca ccctccgggc cgttgcttcg caacgttcaa atccgctccc ggcggatttg 1200tcctactcag gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg 1260actgagcctt tcgttttatt tgatgcctgg cagttcccta ctctcgcatg gggagacccc 1320acactaccat cggcgctacg gcgtttcact tctgagttcg gcatggggtc aggtgggacc 1380accgcgctac tgccgccagg caaattctgt tttatcagac cgcttctgcg ttctgattta 1440atctgtatca ggctgaaaat cttctctcat ccgccaaaac aggatccccc atcaacaatt 1500acacacttct attgattcta caaaaaaaga cattgagttt caagaacatc gtcaaaaaac 1560ccgccgggca taagcccaag cgggttttag gatcttaata atctaattct ttatataaag 1620gaaatttatc agtcagagca gctacacgct gtcttgcttc ttcaagtttt ccttcatctt 1680cgtggttttt caatgcaagc gcaatgatag caccgacttc ttctaatgcg tctccgtcaa 1740aaccgcggct ggttacagca gctgtaccaa gacggatgcc gcttgttacg aaaggttttt 1800caggatcata tggaatcgcg tttttgttag acgtaatacc aatttcatca agtacatgct 1860ccgcaacctt accagtcagt ccgagcgaac gaaggtcaac aaggataagg tggttgtctg 1920ttccgcctga aacgagctgg atgccctctt tcgttaaggc ttcagccaga cgtttcgcgt 1980ttgaaatgac gttttgtgca tatgttttga aatcgtcctg caatacttca ccgaatgaaa 2040cagcttttgc ggcaataacg tgcatcagag ggccgccttg aattccaggg aagatcgatt 2100tatcaatttt cttgccaaac tcttcacggc aaaggatcat accgccgcga ggaccgcgaa 2160gtgttttatg tgttgttgtt gtaacgaaat cagcgtaagg aaccgggttt ggatgaaggc 2220ctgccgcaac aagtcctgcg atatgtgcca tatccaccat gaagtaagcg ccgacttcat 2280cagcaatttc acggaatttc ttaaagtcga ttgtacgagg atacgcactt gctcctgcta 2340cgataagctt cggtttatga gcgagggctt tttcacgcac gtcatcgtaa tcaatatatt 2400gagtttcttt atctacgccg tactcaacaa agttatattg aacaccgctg aagttgactg 2460ggcttccgtg tgttaaatgg ccgccgtggg agaggttcat cccaagtaca gtatcgcctt 2520gctccaaaat cgtgaagtac actgccatgt ttgcttgtgc gcctgaatga ggctgaacgt 2580ttacatgctc cgctccaaag atttccttcg cgcggtcacg ggcgatatct tcaacgacat 2640cgacgtgctc gcatccgccg tagtagcgtt tgcccggata tccttctgcg tacttatttg 2700tcaaaacaga tccttgtgct tccataaccg cttcacttac aaagttctca gaagcaatca 2760attcgatctt agtctgttgg cgttcacgct catttttaat ggcgttaaac acttgttcgt 2820cttgcgcagg taaatgtttc atgtttacac ctcctctaga gcgtcctgct gttgttaaga 2880ttattatacc acaccttgta gataaagtca acaacttttt gcaaaatttt tcaggaattt 2940tagcagaggt tgttctggat gtagaacaaa acatctttcc gctcttgtgc tgttaggata 3000tctttcttgg aagctaggta ggcctcgagt tatggcagtt ggttaaaagg aaacaaaaag 3060accgttttca cacaaaacgg tctttttcga tttcttttta cagtcacagc cacttttgca 3120aaaaccggac agcttcatgc cttataactg ctgtttcggt cgacaagctt cgcgaagcgg 3180ccgcaaaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 3240caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 3300cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg 3360tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca 3420atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgactat 3480gcttgtaaac cgttttgtga aaaaattttt aaaataaaaa aggggacctc tagggtcccc 3540aattaattag taatataatc tattaaaggt cattcaaaag gtcatccacc ggatcagctt 3600agtaaagccc tcgctagatt ttaatgcgga tgttgcgatt acttcgccaa ctattgcgat 3660aacaagaaaa agccagcctt tcatgatata tctcccaatt tgtgtagggc ttattatgca 3720cgcttaaaaa taataaaagc agacttgacc tgatagtttg gctgtgagca attatgtgct 3780tagtgcatct aacgcttgag ttaagccgcg ccgcgaagcg gcgtcggctt gaacgaattg 3840ttagacatta tttgccgact accttggtga tctcgccttt cacgtagtgg acaaattctt 3900ccaactgatc tgcgcgcgag gccaagcgat cttcttcttg tccaagataa gcctgtctag 3960cttcaagtat gacgggctga tactgggccg gcaggcgctc cattgcccag tcggcagcga 4020catccttcgg cgcgattttg ccggttactg cgctgtacca aatgcgggac aacgtaagca 4080ctacatttcg ctcatcgcca gcccagtcgg gcggcgagtt ccatagcgtt aaggtttcat 4140ttagcgcctc aaatagatcc tgttcaggaa ccggatcaaa gagttcctcc gccgctggac 4200ctaccaaggc aacgctatgt tctcttgctt ttgtcagcaa gatagccaga tcaatgtcga 4260tcgtggctgg ctcgaagata cctgcaagaa tgtcattgcg ctgccattct ccaaattgca 4320gttcgcgctt agctggataa cgccacggaa tgatgtcgtc gtgcacaaca atggtgactt 4380ctacagcgcg gagaatctcg ctctctccag gggaagccga agtttccaaa aggtcgttga 4440tcaaagctcg ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacggtcac cgtaaccagc aaatcaatat 4500
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權(quán)利要求
1.用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括在使泛酸產(chǎn)量提高的條件下培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物。
2.用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括在使泛酸產(chǎn)量提高的條件下培養(yǎng)微生物，所述微生物具有(i)去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑，和(ii)去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述微生物具有至少兩個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述微生物具有至少三個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述微生物具有至少四個去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成酶。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述微生物具有去調(diào)節(jié)的酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、去調(diào)節(jié)的酮泛解酸還原酶、去調(diào)節(jié)的泛酸合成酶和去調(diào)節(jié)的門冬氨酸-α-脫羧酶。
7.權(quán)利要求1到6任何一項的方法，其中所述微生物還具有去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述微生物具有至少兩個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述微生物具有至少三個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述微生物具有去調(diào)節(jié)的乙酰羥酸合成酶、去調(diào)節(jié)的乙酰羥酸異構(gòu)還原酶和去調(diào)節(jié)的二羥酸脫水酶。
11.權(quán)利要求1到10任何一項的方法，其中微生物具有至少一個去調(diào)節(jié)的MTF生物合成酶。
12.權(quán)利要求11的方法，其中微生物具有去調(diào)節(jié)的glyA基因。
13.權(quán)利要求11的方法，其中微生物具有去調(diào)節(jié)的serA基因。
14.權(quán)利要求11的方法，其中微生物具有去調(diào)節(jié)的glyA基因和去調(diào)節(jié)的serA基因。
15.權(quán)利要求12或14的方法，其中微生物具有突變、缺失或破壞了的purR基因。
16.用于提高泛酸產(chǎn)量的方法，包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物，其中所述去調(diào)節(jié)致使泛酸產(chǎn)量得以提高。
17.生產(chǎn)泛酸的方法，包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物，使得在培養(yǎng)該微生物36小時后泛酸產(chǎn)量至少為50g/L。
18.權(quán)利要求17的方法，包括培養(yǎng)所述微生物使得在培養(yǎng)該微生物36小時后泛酸的產(chǎn)量至少為60g/L。
19.權(quán)利要求17的方法，包括培養(yǎng)所述微生物使得在培養(yǎng)該微生物36小時后泛酸的產(chǎn)量至少為70g/L。
20.用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑的微生物，從而使得在培養(yǎng)該微生物48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為60g/L。
21.權(quán)利要求20的方法，包括培養(yǎng)所述微生物使得在培養(yǎng)該微生物48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為70g/L。
22.權(quán)利要求20的方法，包括培養(yǎng)所述微生物使得在培養(yǎng)該微生物48小時后泛酸的產(chǎn)量至少為80g/L。
23.前述任何一項權(quán)利要求的方法，其中通過調(diào)節(jié)泛酸激酶的活性進(jìn)一步提高泛酸的產(chǎn)量。
24.權(quán)利要求23的方法，其中泛酸激酶的活性被降低。
25.權(quán)利要求24的方法，其中缺失CoaA并下調(diào)CoaX。
26.權(quán)利要求24的方法，其中缺失CoaX并下調(diào)CoaA。
27.權(quán)利要求24的方法，其中CoaX和CoaA均被下調(diào)。
28.以上任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述微生物在絲氨酸過量的條件下培養(yǎng)。
29.用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括在絲氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑的微生物，使泛酸產(chǎn)生。
30.以上任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述微生物的泛酸生物合成途徑被去調(diào)節(jié)以致泛酸的產(chǎn)生不依賴于β-丙氨酸的飼喂。
31.以上任何一項權(quán)利要求的方法，其中微生物為革蘭氏陽性微生物。
32.以上任何一項權(quán)利要求的方法，其中微生物為芽孢桿菌屬微生物。
33.以上任何一項權(quán)利要求的方法，其中微生物為枯草芽孢桿菌。
34.根據(jù)以上任何一項權(quán)利要求的方法合成的產(chǎn)物。
35.包含根據(jù)以上任何一項權(quán)利要求的方法生產(chǎn)的泛酸的組合物。
36.用于提高泛酸產(chǎn)量的重組微生物，所述微生物具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑。
37.用于提高泛酸產(chǎn)量的重組微生物，所述微生物具有去調(diào)節(jié)的泛酸生物合成途徑、去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑和去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)途徑。
38.權(quán)利要求36或37的微生物，其還具有降低的泛酸激酶活性。
39.權(quán)利要求36-38任何一項的微生物，所述微生物為革蘭氏陽性微生物。
40.權(quán)利要求36-38任何一項的微生物，所述微生物屬于芽孢桿菌屬。
41.權(quán)利要求36-38任何一項的微生物，所述微生物為枯草芽孢桿菌。
42.用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括在致使微生物于培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少30g/l泛酸的條件下培養(yǎng)重組微生物，其中所述重組微生物具有(a)去調(diào)節(jié)的panB基因；(b)去調(diào)節(jié)的panD基因；和(c)至少一個去調(diào)節(jié)的異亮氨酸-纈氨酸(ilv)生物合成酶編碼基因。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述微生物還具有去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑，且所述微生物在可使微生物于培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸的條件下培養(yǎng)。
44.用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括在絲氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因；和(b)去調(diào)節(jié)的panD基因；從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
45.用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因；(b)去調(diào)節(jié)的panD基因；和(c)去調(diào)節(jié)的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成途徑；從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
46.用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因；(b)去調(diào)節(jié)的panD基因；和(c)去調(diào)節(jié)的glyA基因；從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
47.用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因；(b)去調(diào)節(jié)的panD基因；和(c)突變、缺失或破壞了的purR基因；從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
48.用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因；(b)去調(diào)節(jié)的panD基因；和(c)去調(diào)節(jié)的serA基因；從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
49.用于生產(chǎn)泛酸的方法，包括在纈氨酸過量的條件下培養(yǎng)具有如下基因的重組微生物(a)去調(diào)節(jié)的panB基因；(b)去調(diào)節(jié)的panD基因；(c)去調(diào)節(jié)的serA基因；(d)去調(diào)節(jié)的glyA基因；從而在微生物培養(yǎng)36小時后產(chǎn)生至少50g/l泛酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用具有修飾的泛酸生物合成酶活性以及具有修飾的亞甲基四氫葉酸(MTF)生物合成酶活性的微生物提高泛解酸和泛酸產(chǎn)量的改良方法。尤其是，本發(fā)明公開了通過增加直接或間接有助于關(guān)鍵性中間體酮泛解酸合成的酶或底物藉以提高酮泛解酸的水平，從而來提高期望產(chǎn)品的產(chǎn)量的方法。也公開了重組微生物和用于培養(yǎng)所述微生物的條件。此外還公開了由此類微生物產(chǎn)生的組合物。
文檔編號C12N1/21GK1788089SQ03815784
公開日2006年6月14日 申請日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月3日
發(fā)明者R·R·約卡姆, T·A·帕特森, J·G·佩羅, T·赫爾曼 申請人:巴斯福股份公司