專利名稱：應(yīng)用線粒體核酸測(cè)定法診斷膿毒癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膿毒癥的診斷或預(yù)測(cè)的預(yù)定法。
背景技術(shù)：
膿毒癥是一種對(duì)生命存在潛在危險(xiǎn)的、系統(tǒng)性臨床疾病，它是由感染或外傷的發(fā)展而引起的(Mesters，R.M.等(1996)Thromb Haemost.75902-907；Wheeler A.P.和Bernard G.R.(1999)N Engl J Med.340207-214)。通常，認(rèn)為膿毒癥是在嚴(yán)重感染過程中由于微生物毒素的釋放而引起的，但是膿毒性反應(yīng)也可以在沒有任何伴隨微生物感染的跡象下由其他疾病如外科手術(shù)、身體外傷、燒傷、器官移植或胰腺炎引起(Balk R.A.和Bone R.C.(1989)Crit Care Clin 51-8；Ayres S.M.(1985)Crit CareMed 13864-66)。在人體內(nèi)，事實(shí)上來自所有革蘭氏陰性細(xì)菌外膜上的脂多糖類的內(nèi)毒素的釋放被認(rèn)為是膿毒癥的通常致因。
膿毒癥后遺癥的癥狀包括嚴(yán)重的低血壓、連續(xù)多發(fā)性的器官衰竭或功能紊亂和壞死性細(xì)胞死亡，并且可能是在重癥監(jiān)護(hù)病房中引起死亡的最常見致因，同時(shí)可能導(dǎo)致嚴(yán)重的膿毒癥、膿毒癥誘發(fā)的低血壓或膿毒性休克(Parrillo，J.E.等(1990)Ann Intern Med 113227-42；Manship，L.等(1984)Am Surg 5094-101；Niederman M.S.和Fein A.M.(1990)Clin Chest Med11663-65)。盡管在醫(yī)藥和臨床護(hù)理方面有了很大進(jìn)步，但是身患膿毒性休克的患者死亡率估計(jì)在30％至50％之間，這取決于是否存在其他并發(fā)病癥(Natanson，C.等(1998)Crit Care Med.261927-1931；Zeni，F(xiàn).等(1997)Crit Care Med.251095-1100)。
因此，及時(shí)提出對(duì)膿毒癥的治療方案以產(chǎn)生好的結(jié)果是至關(guān)重要的。拖延患者的最早治療時(shí)間將會(huì)帶來嚴(yán)重的后果。另外，治療劑的最佳用藥時(shí)間取決于膿毒癥的發(fā)病階段。所以，對(duì)膿毒癥及時(shí)可靠的診斷是有效治療的關(guān)鍵所在。
當(dāng)前對(duì)膿毒癥的診斷技術(shù)包括檢驗(yàn)血液中的微生物或酸中毒是否呈陽性，或者檢驗(yàn)血液中的白血球或血小板的數(shù)目的變化；或是對(duì)一些身體癥狀進(jìn)行檢查，比如發(fā)燒、發(fā)冷、打顫、換氣過度、心跳加速、精神錯(cuò)亂等(von Landenberg，P和Shoenfeld，Y(2001)IMAJ 3439-442；Marshall，J.C等(1995)Crit Care Med 23(10)1638-1652；Vincen，J.L等(1996)Intensive Care Med 22707-710；Le Gall，J.R.等(1996)JAMA 276802-810；Knaus，W.A.等(1985)Crit Care Med 13818-829)。然而，這些診斷技術(shù)具有局限性，比如血液培養(yǎng)物檢查可能因?yàn)樘⒄`了最好的治療時(shí)機(jī)，或不足夠靈敏，而且這些膿毒癥的身體癥狀可能會(huì)被歸因于其他疾病癥狀，這些都可能導(dǎo)致不合理的治療。
研究一種既迅速又可靠的診斷檢驗(yàn)方法是非常有用的，它可以用于膿毒癥發(fā)展早期的診斷，一般在它發(fā)展成為膿毒性休克前就可以發(fā)現(xiàn)，這樣就可以監(jiān)測(cè)正在接受膿毒癥治療的患者的情況或鑒定有發(fā)展為膿毒癥可能的患者。研發(fā)膿毒癥診斷性檢驗(yàn)方法對(duì)促進(jìn)膿毒癥新療法的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展是有用的。
發(fā)明概述在多種備選方面中，本發(fā)明提供了檢測(cè)患者膿毒癥的多種方法，概括地說，是根據(jù)膿毒癥患者的線粒體核酸(比如線粒體DNA或RNA，如線粒體mRNA)耗損情況來定的。在某些患者身上，這些方法對(duì)于檢測(cè)膿毒癥是很有用的，而通常無視引起膿毒癥的潛在原因。
一方面，本發(fā)明提供了一種在需要診斷膿毒癥的受試者中診斷膿毒癥的方法。這種方法包括檢測(cè)受試者樣本中線粒體核酸的相對(duì)量，這些數(shù)據(jù)可以指示出受試者是否出現(xiàn)了膿毒癥。另一方面，本發(fā)明提供了可以預(yù)測(cè)出受試者是否具有發(fā)生膿毒癥可能性的方法。這個(gè)方法包括檢測(cè)受試者樣本中線粒體核酸的相對(duì)量，從而可以指示出受試者中感染膿毒癥的可能性。無論哪一個(gè)方面，患者都有可能感染膿毒癥。
另一方面，本發(fā)明提供了一種可以監(jiān)測(cè)膿毒癥在發(fā)病受試者發(fā)展變化的方法。此方法包括在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)出受試者樣本中線粒體核酸的相對(duì)量，這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的線粒體核酸相對(duì)量變化可以指示膿毒癥在受試者中的發(fā)展變化。此方法還包括在樣品中取一系列時(shí)間點(diǎn)測(cè)線粒體核酸的相對(duì)量，或包括預(yù)測(cè)受試者體內(nèi)膿毒癥可能的臨床進(jìn)程。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定膿毒癥治療效果的方法。此方法包括從對(duì)照受試者和試驗(yàn)受試者樣品中測(cè)出線粒體核酸的相對(duì)量，其中讓試驗(yàn)受試者接受治療，然后進(jìn)行檢測(cè)，兩者的線粒體核酸相對(duì)量的區(qū)別可以指示出治療的效果。
在一個(gè)備選的方面中，本發(fā)明提供了診斷試劑盒，通過測(cè)定受試者樣品中線粒體核酸相對(duì)量來診斷受試者中膿毒癥的程度。這個(gè)試劑盒可包括線粒體核酸引物和核核酸引物。
在備選實(shí)施方案中，受試者可能是人(比如嬰兒、老人或免疫缺陷的個(gè)體)或是非人動(dòng)物(比如患膿毒癥的動(dòng)物模型，像LPS引起的膿毒癥)。在某些實(shí)施方案中，如果受試者中線粒體核酸的相對(duì)量比預(yù)定的低，那么受試者可被診斷出患有膿毒癥或有感染膿毒癥的可能，或?qū)κ茉囌邌?dòng)膿毒癥的治療。測(cè)定時(shí)設(shè)定的指標(biāo)可以是任選地表示成比值，例如，線粒體DNA(mtDNA)與核DNA(nDNA)的比值，若將標(biāo)準(zhǔn)的mtDNA/nDNA的比值設(shè)定為1，那么預(yù)定的比值可以是0.45或更少。
在其它的備選實(shí)施方案中，膿毒癥疾病狀態(tài)可能是由革蘭氏陰性細(xì)菌感染、革蘭氏陽性細(xì)菌感染、真菌感染、細(xì)菌感染、外傷、胰腺炎、器官移植、出血、成人呼吸窘迫綜合征、燒傷、外科手術(shù)、化學(xué)治療或暴露于電離輻射導(dǎo)致的膿毒癥癥狀。樣品可以是例如外周血液樣本。
在備選實(shí)施方案中，線粒體核酸的相對(duì)量可以指示膿毒癥的嚴(yán)重性或膿毒癥治療成功與否。線粒體核酸數(shù)量可描述為受試者細(xì)胞中線粒體核酸與核核酸的比值，例如，通過聚合酶鏈反應(yīng)，比如定量聚合酶鏈反應(yīng)，其中，可將擴(kuò)增后的線粒體核酸的含量與參考核酸的擴(kuò)增相比較。聚合酶鏈反應(yīng)可以是實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，此時(shí)需要通過雜交探針來檢測(cè)擴(kuò)增后產(chǎn)物。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在本發(fā)明的上下文中所使用的“膿毒癥，”包括術(shù)語“膿毒癥”、“菌血癥”、“敗血癥”、“膿毒性綜合征”、“膿毒性休克”、“嚴(yán)重的膿毒癥”和“全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)”，一般是指急性全身性炎癥反應(yīng)，其與內(nèi)源性炎癥介質(zhì)比如促炎性細(xì)胞因子、粘著分子、血管活性物質(zhì)和活性氧釋放入血管相關(guān)聯(lián)，伴隨而來的是白細(xì)胞數(shù)目、體溫、心跳和呼吸作用的改變(Bone，R.C.等(1992)，Chest 1011644-55；Paterson，R.L.，和N.R.Webster(2000)J.R.coll.Surg.Edinb.，45178-182)。一般認(rèn)為膿毒癥是由感染或外傷引起的，并且是一種對(duì)所傳染的微生物產(chǎn)生的非特異性宿主反應(yīng)，這些微生物包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒；或是對(duì)由感染或受傷引起的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的非特異性宿主反應(yīng)(Bone，R.C.等(1992)Chest 1011644-55；Paterson，R.L.和N.R.Webster(2000)J.R.coll.Surg.Edinb.，45178-182)。
在某些實(shí)施方案中，SIRS經(jīng)診斷在患者中有以下兩個(gè)或更多的癥狀體溫超過38℃或低于36℃；心跳超過90次/分鐘；呼吸頻率超過20次/分鐘或PaCO2小于4.3kPa；白血球數(shù)目多于12×109/L或少于4×109/L或大于10％的不成熟形態(tài)。在備選實(shí)施方案中，膿毒癥可以定義為由感染引起的SIRS，而重度膿毒癥可以定義為具有明顯器官低灌注性膿毒癥。在備選實(shí)施方案中，膿毒性休克可限定為低血壓性(心臟收縮壓少于90mmHG)重度膿毒癥，盡管它能通過血管加壓/收力提供足夠的回復(fù)力和修復(fù)來維持血壓(Paterson，R.L.和N.R.Webster(2000)J.R.coll.Surg.Edinb.，45178-182)。如果診斷和治療不及時(shí)，膿毒癥就能發(fā)展成膿毒性休克，導(dǎo)致可致死的血壓下降，而膿毒癥的炎癥相關(guān)效應(yīng)可能導(dǎo)致組織損傷和進(jìn)行性器官功能紊亂和器官衰竭。
膿毒癥可能由器官例如腎臟(例如，因上部泌尿管道感染)；肝臟；膽囊；腸(例如，腹膜炎)；皮膚(例如，蜂窩組織炎)；肺(例如，細(xì)菌性肺炎)；泌尿生殖道(例如，尿道膿毒)；或腦和脊髓(例如，細(xì)菌性腦膜炎)的局部感染引起，或由全身性癥狀例如中毒性休克綜合征引起。膿毒癥也因一些非傳染性損傷比如化學(xué)治療、急性胰腺炎、外科手術(shù)、身體外傷、燒傷、器官移植、多器官功能失調(diào)綜合征(MODS)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、播散性血管內(nèi)凝血(DIC)、出血、或暴露于電離輻射而引起(Bone，R.C.等(1992)Chest 1011644-55；Paterson，R.L.和N.R.Webster(2000)J.R.coll.Surg.Edinb.，45178-182)。
膿毒癥發(fā)生時(shí)有一系列生理癥狀從發(fā)抖、發(fā)顫、發(fā)燒、虛弱、惡心、嘔吐、腹瀉到嚴(yán)重的低血壓、智力下降和連續(xù)的多器官功能紊亂和器官衰竭(比如說，腎臟尿排泄量少；肺呼吸困難和血中溶氧量少；心臟中血液滯留和腫脹，以及具膿毒性休克典型癥狀的壞死性和編程性細(xì)胞死亡。
在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中包括對(duì)來自受試者的樣品例如外周血液樣本或其細(xì)胞碎片中的線粒體核酸比如線粒體DNA(mtDNA)或線粒體RNA例如線粒體mRNA(mt mRNA)定量以確定線粒體核酸的水平是否預(yù)示膿毒癥?！皹悠贰笨砂ㄈ魏误w液、細(xì)胞或組織，包括但不限于受試者的外周血、淋巴細(xì)胞(例如B細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞)、唾液、尿、創(chuàng)傷組織、導(dǎo)管入口部位，或由其衍生的細(xì)胞系。在本發(fā)明的備選方案中，用于化驗(yàn)的樣品可以通過諸如尸體解剖或活組織切片從多種組織比如心臟、腦、肺、腎、脂肪、脾、肝臟或從由其衍生的細(xì)胞中獲得。
在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括確定受試者如疑似感染膿毒癥或有感染膿毒癥危險(xiǎn)的受試者中線粒體核酸的相對(duì)量的測(cè)定法。這個(gè)受試者可以是因?yàn)榧毙愿腥径邮苤委煹幕颊?，或是?duì)膿毒癥敏感的群體中的一員。在某些實(shí)施方案中，受試者可以是非人類動(dòng)物，例如家養(yǎng)的或放牧的動(dòng)物，像狗、豬、山羊、牛、雞或火雞。在某些實(shí)施方案中，受試者可以是膿毒癥的動(dòng)物模型，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知或如這里所描述，可以是大鼠、小鼠、山羊、豬、狒狒、恒河猴或狗。
本發(fā)明的檢測(cè)方法包括PCR檢測(cè)，如包括線粒體序列和參比序列比如一個(gè)基因組序列的共擴(kuò)增的半定量、定量PCR或RT-PCR。本發(fā)明的檢測(cè)方法還包括雜交檢測(cè)，例如，RNA或DNA雜交檢測(cè)，利用線粒體和核DNA或RNA樣品以及線粒體序列和參比序列(例如基因組或cDNA)作為探針。從這些檢測(cè)結(jié)果中可以估計(jì)出受試者細(xì)胞或組織中線粒體核酸與核核酸的比值(例如，mtDNA比nDNA或mt mRNA比核RNA(nRNA))。
在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，檢測(cè)方法因而可以在膿毒癥發(fā)展或惡化成膿毒性休克之前提供臨床信息。線粒體核酸(例如mtDNA或mtRNA)的損耗可以在施用合適的治療后逆轉(zhuǎn)，比如說用合適的廣譜抗生素治療。參考對(duì)照的樣品或已知的標(biāo)準(zhǔn)，包括膿毒癥性休克在內(nèi)的一些嚴(yán)重的膿毒癥癥狀可能在線粒體核酸(例如mtDNA或mtRNA)水平下降到低于正常水平的約50％，40％，30％，20％或10％時(shí)出現(xiàn)。當(dāng)線粒體核酸與核核酸的比值(例如mtDNA與nDNA的比值或mt mRNA與nRNA的比值)低于閾值比如0.5，0.45，0.4，0.35或0.3時(shí)(此參考對(duì)照樣品或已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)得)，也預(yù)示可對(duì)膿毒癥作臨床治療。
在備選實(shí)施方案中，在一段時(shí)間內(nèi)線粒體核酸(如，mtDNA或mtRNA)的相對(duì)濃度變化率也作為診斷信息。對(duì)于一些受試者，線粒體核酸(例如mtDNA或mtRNA)的相對(duì)量的相對(duì)快速減少也可以作為膿毒癥的指示指標(biāo)。在八至十天或更短的時(shí)間內(nèi)，線粒體核酸與核核酸比值的相對(duì)量(比如說mtDNA/nDNA或mt mRNA/nDNA)相對(duì)快速下降了50％或更多(或許有些情況為大于40％)，這可以表明這個(gè)受試者正在發(fā)展為膿毒癥，并需要密切監(jiān)控，和/或可能需要施用抗生素或其他抗膿毒癥療法。
在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明也提供了這樣的方案，例如，避免了確定mtDNA拷貝數(shù)本身的必要，簡(jiǎn)化為測(cè)定線粒體核酸(例如mtDNA或mtmRNA)的相對(duì)量，比如說，測(cè)定相對(duì)于核核酸(例如nDNA或nRNA)序列的數(shù)量。在一些情況下，這個(gè)方法可以簡(jiǎn)化此發(fā)明的診斷方法。比如說，如

圖1所示，將代表核-基因組-等同物的數(shù)目(30-30,000)指定為nDNA的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)，如所述數(shù)目是用已知核-基因組-等同物濃度的對(duì)照人DNA校準(zhǔn)而確定。
將同樣的線粒體基因數(shù)目隨意對(duì)應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上(雖然它們不能表示計(jì)算出的線粒體基因拷貝數(shù))。在備選的方法中，代表核-基因組-等同物的數(shù)值可被隨意賦予比如說nDNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)，其只基于樣品的稀釋度(這樣，這個(gè)數(shù)據(jù)反映了核-基因組-等同物的相對(duì)拷貝數(shù)，而不是此類等同物的絕對(duì)值)，這些隨意的數(shù)目可以類似地被賦予mtDNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)。然后本發(fā)明的檢驗(yàn)結(jié)果可以通過比如說mtDNA和nDNA比例來表示，而不需要測(cè)定絕對(duì)的mtDNA拷貝數(shù)。在這樣的實(shí)施方案中，優(yōu)選地使用可提供足夠PCR模板的樣品DNA或RNA的最初濃度，這樣它的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)在能提供最可靠結(jié)果的范圍內(nèi)，比如說，從5到15的任何最小整數(shù)到從15到40的任何最大整數(shù)。
因此本發(fā)明提供了用于比較核酸序列相對(duì)豐度的方法，包括a)在第一個(gè)和第二個(gè)核對(duì)照樣品中、在核擴(kuò)增反應(yīng)條件下測(cè)定核DNA或RNA序列的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)，以得到對(duì)照核擴(kuò)增測(cè)定值，其中第一個(gè)和第二個(gè)核對(duì)照樣品具有不同的核DNA或RNA序列濃度；b)由對(duì)照核擴(kuò)增測(cè)定值構(gòu)建對(duì)照核DNA或RNA序列數(shù)據(jù)庫，以得到表示核DNA或RNA序列擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)和濃度之間的模型標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性；c)在第一個(gè)線粒體對(duì)照樣品和在第二個(gè)線粒體對(duì)照樣品中、在線粒體擴(kuò)增反應(yīng)條件下測(cè)定線粒體DNA或RNA序列的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)，以得到對(duì)照線粒體擴(kuò)增測(cè)定值，其中第一個(gè)和第二個(gè)線粒體對(duì)照樣品具有不同的線粒體DNA或RNA序列濃度；d)由對(duì)照線粒體擴(kuò)增的測(cè)定值構(gòu)建對(duì)照線粒體DNA或RNA序列數(shù)據(jù)庫，以得到線粒體DNA或RNA序列擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)和濃度之間的模型標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性；e)在受試樣本中、在核擴(kuò)增反應(yīng)條件下測(cè)定核DNA或RNA序列的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)，以得到受試樣本核擴(kuò)增測(cè)定值；f)將核DNA或RNA序列擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)和濃度之間的模型標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性應(yīng)用于受試樣本核擴(kuò)增測(cè)定值中，以得到受試樣本核DNA或RNA序列濃度測(cè)定值；g)在受試樣本中、在線粒體擴(kuò)增反應(yīng)條件下測(cè)定線粒體DNA或RNA序列的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)，以得到受試樣本線粒體擴(kuò)增測(cè)定值；h)將線粒體DNA或RNA序列擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)和濃度之間的模型標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性應(yīng)用到受試樣本線粒體擴(kuò)增測(cè)定值，以得到受試樣本線粒體DNA或RNA序列濃度測(cè)定值；i)比較受試樣本中核DNA或RNA序列濃度測(cè)定值與受試樣本中線粒體DNA或RNA序列濃度測(cè)定值，以確定受試樣本中相對(duì)于核DNA或RNA序列，線粒體DNA或RNA序列的相對(duì)濃度。
在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和試劑盒能用來確認(rèn)處于急性感染或因此引起膿毒癥危險(xiǎn)的易感人群中的那些個(gè)體。例如，新生兒(即剛出生的嬰兒或胎兒)以及年幼的孩子(兩歲以下)特別對(duì)導(dǎo)致膿毒癥的感染易感，還有年老的人和免疫力低下的人(包括受過嚴(yán)重物理創(chuàng)傷比如燒傷的患者)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，診斷具有、疑似患有或有可能HIV感染或癌癥的個(gè)體被排斥在本發(fā)明的方法外，所以本發(fā)明包括測(cè)定來自不包括診斷具有、疑似患有或有可能HIV感染或癌癥的個(gè)體的患者的樣品中線粒體核酸相對(duì)量的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和試劑盒能用來鑒定或監(jiān)控在非人類動(dòng)物比如，家養(yǎng)的，放牧的或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的膿毒癥疾病狀態(tài)。
現(xiàn)在的治療方法包括對(duì)易感高體溫個(gè)體使用廣譜抗生素或進(jìn)行腰穿孔，以排除腦膜炎。這樣，在當(dāng)前治療膿毒癥治療策略下，諸多未患膿毒癥的患者不需要地進(jìn)行了抗膿毒癥治療，有一些因素決定了這不是所期望的。例如，廣譜抗生素的使用是不提倡的，因?yàn)榭股赜幸欢ǖ母弊饔?，比如，藥物過敏、聽力喪失或由于藥物清除不好或抗生素抗性細(xì)菌菌株的發(fā)展導(dǎo)致的內(nèi)臟受損。而用像腰穿孔治療具有相當(dāng)?shù)那秩胄圆⒔o患者帶來更多的創(chuàng)傷。
應(yīng)用快速、相對(duì)無侵入性的本發(fā)明的檢測(cè)方法，治療措施可限制于用在已確診患有膿毒癥的患者。如果需要的話，這些患者可用感染特異的療法治療；也可較早地或更積極地用廣譜抗生素治療；或使用像腰穿孔的方法來治療。不同于根據(jù)血液中微生物的存在而檢測(cè)膿毒癥的方法，本發(fā)明的方法可以用來檢測(cè)例如當(dāng)受試者使用抗膿毒癥的藥物比如一種新抗生素時(shí)是否可能患膿毒癥。
在備選實(shí)施方面，本發(fā)明的方法也可以用于確認(rèn)易感個(gè)體和患膿毒癥個(gè)體，其可從早期治療中受益。這種確定可幫助保健醫(yī)生更早地或可能更積極地施行治療。這樣，顯示嚴(yán)重耗竭的相對(duì)線粒體核酸水平比如mtDNA或mt RNA水平的患者可受益于積極的、持續(xù)的和/或多種抗生素治療。同樣地，對(duì)于耗竭的相對(duì)線粒體核酸水平比如mtDNA或mtRNA水平的患者建議推遲手術(shù)。
在備選的方面中，本發(fā)明的方法可以用于，比如說，患膿毒癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?，以測(cè)定治療膿毒癥的新療法的效果?；寄摱景Y的動(dòng)物模型包括但不限于在大鼠中施用細(xì)菌性內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)模擬由革蘭氏陰性菌引起的膿毒癥；化療誘發(fā)的感染；盲腸結(jié)扎和重穿孔，以模擬呼吸窘迫綜合征；或任何其他可以模擬膿毒癥癥狀的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ??；寄摱景Y動(dòng)物模型的描述可在以下參考文獻(xiàn)中找到且不限于這些文獻(xiàn)Bhatti AR和Micusan VV(1996)Microbios 86(349)247-53；Redl H等(1993)Immunobiology 187(3-5)330-45；Fink MP和Heard SO(1990)J Surg Res.49(2)186-96；DunnDL(1988)Transplantation 5(2)424-9；Bohnen JM等(1988)Can JMicrobiol.34(3)323-6；Mela-Riker L等(1988)Circ Shock.25(4)231-44；Walker JF等(1986)Am J Kidney Dis.8(2)88-97；Lopez-Garrido J等(1987)Lab Invest.56(5)534-43；Quimby F和Nguyen HT(1985)Crit RevMicrobiol.12(1)1-44；Noel GJ等(1985)Pediatr Res.19(3)297-9；Moesgaard F等(1983)Eur J Clin Microbiol.2(5)459-62；Hinshaw LB，等(1976)Surg Gynecol Obstet.142(6)893-900；Tieffenberg J.等(1978)Infect Immun.19(2)481-5；Wing D.A.，et al.(1978)J Lab Clin Med.92(2)239-51，所有這些均在此處引用作為參考。
在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于本發(fā)明方法中的具有組分的試劑盒。這種試劑盒可以包含PCR組分，如以下所作詳細(xì)說明，包括對(duì)mtDNA或mtRNA序列和對(duì)nDNA或nRNA序列特異的PCR引物。此試劑盒也可包括實(shí)施這里描述的本發(fā)明方法的書面說明。
在備選實(shí)施方案中，可使用多種技術(shù)來檢測(cè)細(xì)胞中線粒體DNA或RNA的相對(duì)量。定量PCR方法例如被公開在下列文獻(xiàn)中，所有這些文獻(xiàn)在這里引用作為參考文獻(xiàn)美國(guó)專利號(hào)6,180,349，于2001年1月30日授權(quán)于Ginzinger等；美國(guó)專利號(hào)6,033,854，于2000年3月7日授權(quán)于Kurnit等；以及美國(guó)專利號(hào)5,972,602，于1999年10月26日授權(quán)于Hyland等；Song，J.等(2001)Diabetes Care 24865-869。線粒體DNA或RNA序列可選自任何線粒體特異的核苷酸序列，包括但不限于ATP合成酶6，GenBank登錄號(hào)為AF368271；tRNA-Leu，GenBank登錄號(hào)為S49541；NADH脫氫酶亞基5(MTND5)，GenBank登錄號(hào)為AF339085；IDL，GenBank登錄號(hào)為AF079515；細(xì)胞色素b，GenBank登錄號(hào)為AF254896，CCOI，或任何其它合適的線粒體特異核苷酸序列。核DNA或RNA序列可選自包括但不限于人28S rRNA序列、ASPOL-γ序列、β-球蛋白序列、或任何其它合適的核DNA或RNA序列。擴(kuò)增探針可根據(jù)本領(lǐng)域已知方法設(shè)計(jì)并被描述例如在Sambrook等(Molecular CloningA LaboratoryManual.，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)或Ausubel等(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，1994).
在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可與其他有關(guān)膿毒癥的治療、預(yù)防或診斷的方法聯(lián)合使用，所述其它方法包括但不局限于描述在vonLandenberg，P和Shoenfeld，Y(2001)IMAJ 3439-442；Marshall，J.C.，Cook，D.J.，Christou，N.V.，Bernard，G.R.，Sprung，C.L.，Sibbald，W.J.(1995)Crit Care Med 23(10)1638-1652；Vincent J.L.，Moreno R.，Takala J.，Willats S.，(1996)Intensive Care Med 22707-710；Le Gall J.R.，Klar J.，Lemeshow S.(1996)JAMA 276802-810；Knaus，W.A.，Draper，E.，Wagner，D.和Zimmerman，J.(1985)Crit Care Med 13818-829；Knaus W.A.，Wagner D.P.，Draper E.A.，Zimmerman J.E.等(1991)Chest 1001619-38；Bone，R.C.，Balk，R.A.，Cerra，F(xiàn).B.，Dellinger，R.P.，F(xiàn)ein，A.M.，Knaus，W.A.，Schein，R.M.H.，Sibbald，W.J.(1992)Chest 1011644-55；美國(guó)專利號(hào)6,303,321，于2001年10月16日授權(quán)于Tracey等；美國(guó)專利號(hào)5,993,811，于1999年11月30日授權(quán)于Becker等；美國(guó)專利號(hào)5,830,679，于1998年11月3日授權(quán)于Bianchi等；美國(guó)專利號(hào)5,804,370，于1998年9月8日授權(quán)于Romaschin等；美國(guó)專利號(hào)5,780,237，于1998年7月14日授權(quán)于Bursten等；美國(guó)專利號(hào)5,639,617，于1997年6月17日授權(quán)于Bohuon；美國(guó)專利號(hào)5,545,721，于1996年8月13日授權(quán)于Carroll等；或美國(guó)專利號(hào)5,998,482，于1999年12月7日授權(quán)于David等，所有這些均在本文中作為參考。備選地或另外地，這些患者可接受線粒體治療，即有益于線粒體的組分，如線粒體酶的輔酶因子或前體。在一些實(shí)施方案中，這種線粒體療法治療物例如可選自核黃素(維生素B2)，輔酶Q10，維生素B1(硫胺素)，維生素B12，維生素K，1-乙?；舛緣A，N-乙?；腚装彼岷蜔焿A。
實(shí)施例1膿毒癥與血細(xì)胞中mtDNA含量的顯著下降有關(guān)系。提供了監(jiān)測(cè)例如膿毒癥受試者中線粒體DNA水平的方法。本發(fā)明的方法可以用來評(píng)估抗膿毒癥藥物的效果以及在患膿毒癥的患者或者在懷疑有患膿毒癥危險(xiǎn)的個(gè)體中診斷膿毒癥。
材料和方法從受試者采集縱向血樣。從血細(xì)胞中提取總DNA，并且用雜交探針通過實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增并定量核基因和線粒體基因。mtDNA水平可表示為線粒體與核DNA的比值(mtDNA/nDNA)。
樣品采集和DNA提取。
血沉棕黃層可從血樣中收集并在-70℃下保藏直到使用。用QIAampDNA血液微型試劑盒(QIAGEN，Missisauga，Ontario，加拿大)根據(jù)生產(chǎn)商提供的實(shí)驗(yàn)方法從200μL的血沉棕黃層中提取總DNA，并在200μL的洗脫緩沖液中重懸。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，相似的樣品可從對(duì)照的志愿者身上收集，并將DNA提取并收集。DNA庫中的核基因組等同物(g.eq.)可用含有已知濃度的人DNA核基因組等同物的對(duì)照試劑盒校準(zhǔn)而確認(rèn)(Roche分子生物化學(xué)，Laval，Quebec，加拿大)。
定量實(shí)時(shí)PCR對(duì)于mtDNA CCOI基因，CCOI1F5′-TTCGCCGACCGTTGACTATT-3′(SEQ ID NO1)和CCOI2R5′-AAGATTATTACAAATGCATGGGC-3′(SEQ ID NO2)引物可用于PCR擴(kuò)增，而下列寡核苷酸3′-熒光素標(biāo)記的CCOIPR15′-GCCAGCCAGGCAACCTTCTAGG-F-3′(SEQ ID NO3)和5′LCRed640-標(biāo)記的CCOIPR2 5′-L-AACGACCACATCTACAACGTTATCGTCAC-P-3′(SEQ ID NO4)，后者的3′末端用磷酸鹽分子封閉，可用做雜交探針。
對(duì)于nDNA ASPOLγ基因，ASPG3F5′-GAGCTGTTGACGGAAAGGAG-3′(SEQ ID NO5)和ASPG4R5′-CAGAAGAGAATCCCGGCTAAG-3′(SEQ ID NO6)引物被用來做PCR，而下列寡聚核苷酸3′-熒光素標(biāo)記的ASPGPR1 5′-GAGGCGCTGTTAGAGATCTGTCAGAGA-F-3′(SEQ ID NO7)和5′LC Red640-標(biāo)記的、3′-磷酸鹽封閉的ASPGPR25′-L-GGCATTTCCTAAGTGGAAGCAAGCA-P-3′(SEQ ID NO8)可用作雜交探針。
采用LightCycler FastStart DNA Master雜交探針試劑盒(RocheMolecular Biochemicals，Laval，Quebec，加拿大)，實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)可分開進(jìn)行并且每個(gè)基因做2次。PCR反應(yīng)可包含5mM MgCl2，每種引物0.5μM，0.1μM 3′-熒光素探針，0.2pM 5′LC Red640探針和4μL在洗脫緩沖液中的以1∶10稀釋的DNA提取液。PCR擴(kuò)增包括95℃10分鐘的單次變性//酶活化步驟，然后于0秒/95℃，10秒/60℃，5秒/72℃進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，其間溫度轉(zhuǎn)化速率20℃/秒。增益設(shè)置(gain settings)可為F1＝1，F(xiàn)2＝8，在每個(gè)退火步驟的最后能得到一個(gè)單一的熒光物。每個(gè)LightCycler運(yùn)行可包括30、300、3000和30000核基因組等同物的外部標(biāo)準(zhǔn)曲線，將相同的核基因組等同物的值用于核(ASPOLγ)和線粒體(CCOI)基因。利用每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的第二次衍生最大值來分析這些數(shù)據(jù)并將之與各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)。對(duì)于特定的提取物，定量PCR的結(jié)果可表示為兩次測(cè)定值的平均mtDNA基因組等同物與兩次測(cè)定值的平均nDNA基因組等同物的相對(duì)比值(mtDNA/nDNA)，這些比值隨意的分布在1.0左右，實(shí)際上相同的核基因組等同物值在兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線上都出現(xiàn)了。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的PCR方法可以是實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，其中，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可用雜交探針，如上文所描述的利用LightCyclerFastStart DNA Master雜交探針試劑盒(Roche Molecular Biochemicals，Laval，Quebec，加拿大)，或備選地使用商業(yè)上可獲得的技術(shù)如ABITaqman技術(shù)(例如ABI Prism 7700儀器來持續(xù)觀察PCR過程中PCR產(chǎn)物的積累，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California，U.S.A.)。備選的PCR方法和上述方法的改動(dòng)方法可被采用，如例如公開在下列美國(guó)專利中，這些專利在文中引用作參考6,180,349(Ginzinger等，2001年1月30日)；6,033,854(Kuit等，2000年3月7日)；5,972,602(Hyland；1999年8月26日)；5,476,774和5,219,727(Wang；1995年12月19日和1993年6月15日)；6,174,670(Wittwer等，2001年1月16日)；6,143,496(Brown；2000年11月7日)；6,090,556(Kato；2000年7月18日)；6,063,568(Gerdes等，2000年5月16日)。
實(shí)施例2LPS誘導(dǎo)的膿毒癥被用在動(dòng)物模型中以檢測(cè)膿毒癥。表1顯示小鼠施用LPS后6和24小時(shí)，在肺、肝臟組織中線粒體DNA(mtDNA)與核DNA(nDNA)比值。
表1小鼠施用LPS后6和24小時(shí)組織中線粒體DNA的相對(duì)量處理 組織 N mtDNA/nDNA比值(平均值±SD)對(duì)照 肺 6 0.29±0.05LPS-6小時(shí)肺 6 0.23±0.04LPS-24小時(shí) 肺 6 0.25±0.06對(duì)照 肝臟 3 2.40±0.99LPS-24小時(shí) 肝臟 3 2.50±0.22
結(jié)果顯示由LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的膿毒癥動(dòng)物肺組織中mtDNA/nDNA的比值有明顯變小的趨勢(shì)(P＝0.06)。
結(jié)論雖然這里公開了本發(fā)明的多種實(shí)施方案，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常識(shí)可在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行很多改進(jìn)和變化。這些變化包括對(duì)本發(fā)明的任何方面采用已知等同物的替代品以基本相同的方式達(dá)到同樣結(jié)果。數(shù)據(jù)范圍包括在限定的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)。在說明書中，單詞“包含”用作開放式術(shù)語，基本上等同于短語“包括，但不限于”，而單詞“comprises”具有相應(yīng)的意思。文中引用的參考文獻(xiàn)不構(gòu)成表明這些參考文獻(xiàn)為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。所有的出版物，包括但不限于引用在本說明書中引用的專利和專利申請(qǐng)以及本申請(qǐng)要求優(yōu)先權(quán)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/393,368(于2002年7月5日申請(qǐng))于文中引用作為參考，就像每一單獨(dú)的出版物專門并單獨(dú)指出在文中引用作為參考一樣，并且就像在文中充分公開一樣。本發(fā)明包括基本上如前文中描述的所有實(shí)施方案以及對(duì)其所做的變動(dòng)并參照實(shí)施例和附圖。
序列表<110>英屬哥倫比亞大學(xué)<120>應(yīng)用線粒體核酸測(cè)定法診斷膿毒癥<130>80021-539<140>WO PCT/CA03/01006<141>2003-07-04<150>US 60/393,368<151>2002-07-05<160>8<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ttcgccgacc gttgactatt 20<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2aagattatta caaatgcatg ggc 23<210>3
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>3’-熒光素標(biāo)記的<400>3gccagccagg caaccttcta gg 22<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>5’-LC Red640標(biāo)記的<400>4aacgaccaca tctacaacgt tatcgtcac29<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gagctgttga cggaaaggag 20
<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6cagaagagaa tcccggctaa g21<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(27)..(27)<223>3’-熒光素標(biāo)記的<400>7gaggcgctgt tagagatctgt tcagaga 27<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(25)..(25)<223>3’-磷酸鹽封閉的<400>8ggcatttcct aagtggaagc aagca2權(quán)利要求
1.在需要診斷的受試者中診斷膿毒癥疾病狀態(tài)的方法，該方法包括對(duì)來自所述受試者的樣品測(cè)定線粒體核酸的相對(duì)量，其中，所測(cè)定的線粒體核酸的相對(duì)量可預(yù)示所述受試者存在膿毒癥疾病狀態(tài)。
2.在需要預(yù)測(cè)的受試者中預(yù)測(cè)患上膿毒癥疾病狀態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括對(duì)來自所述受試者的樣品測(cè)定線粒體核酸的相對(duì)量，其中，所測(cè)定的線粒體核酸的相對(duì)量可預(yù)示所述受試者患上膿毒癥疾病狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中受試者患有膿毒癥。
4.在患有膿毒癥的受試者中監(jiān)測(cè)膿毒癥疾病狀態(tài)進(jìn)展的方法，該方法包括在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定來自所述受試者樣品中線粒體核酸的相對(duì)量和在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定來自所述受試者樣品中線粒體核酸的相對(duì)量，其中，在所述第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)和所述第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)間測(cè)定的線粒體核酸的相對(duì)量的差異預(yù)示在所述受試者中膿毒癥疾病狀態(tài)的進(jìn)展。
5.權(quán)利要求的方法，該方法還包括在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定來自所述受試者樣品中線粒體核酸的相對(duì)量。
6.權(quán)利要求1到5中任意一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括在所述受試者中預(yù)測(cè)膿毒癥的可能臨床過程。
7.確定對(duì)膿毒癥疾病狀態(tài)治療效果的方法，該方法包括i)從對(duì)照受試者樣品中確定線粒體核酸的相對(duì)量；ii)從試驗(yàn)受試者樣品中確定線粒體核酸的相對(duì)量，其中所述試驗(yàn)受試者被施與所述治療，而其中在來自所述試驗(yàn)受試者和所述對(duì)照受試者樣品中測(cè)得的線粒體核酸的相對(duì)量差異指示所述治療的療效。
8.權(quán)利要求1到7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述膿毒癥疾病狀態(tài)是由選自下列的情況引起的膿毒癥綜合征，所述情況為革蘭氏陰性細(xì)菌感染、革蘭氏陽性細(xì)菌感染、真菌感染、病毒感染、原生動(dòng)物感染、物理創(chuàng)傷、胰腺炎、器官移植、出血、成人呼吸窘迫綜合征、燒傷、外科手術(shù)、化學(xué)治療、或暴露于電離輻射。
9.權(quán)利要求1到8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述線粒體核酸的相對(duì)量指示膿毒癥的嚴(yán)重性或?qū)δ摱景Y治療性治療成功與否。
10.權(quán)利要求1到9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述線粒體核酸根據(jù)與所述受試者細(xì)胞中核核酸的相對(duì)量而確定。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述線粒體核酸或所述核核酸通過聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述聚合酶鏈反應(yīng)是定量聚合酶鏈反應(yīng)，其中將線粒體核酸的擴(kuò)增與參考核酸的擴(kuò)增比較。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述聚合酶鏈反應(yīng)是實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，其中擴(kuò)增產(chǎn)物通過用雜交探針檢測(cè)。
14.權(quán)利要求1到13中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，如果所述線粒體核酸相對(duì)量低于一個(gè)預(yù)定的水平，則所述受試者診斷為患有膿毒癥或確定為有患膿毒癥的風(fēng)險(xiǎn)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述預(yù)定的水平表示為線粒體DNA(mtDNA)與核DNA(nDNA)的比值，參考的標(biāo)準(zhǔn)mtDNA/nDNA比值設(shè)定為1，而其中所述預(yù)定的水平是比值0.45或更小。
16.權(quán)利要求1到15中任意一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括當(dāng)所述線粒體核酸相對(duì)量低于預(yù)定水平時(shí)啟動(dòng)對(duì)所述受試者進(jìn)行膿毒癥治療。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述線粒體DNA的預(yù)定水平表示為線粒體DNA(mtDNA)與核DNA(nDNA)的比值，參考的標(biāo)準(zhǔn)mtDNA/nDNA比值設(shè)定為1，而其中所述預(yù)定的水平是比值0.45或更小。
18.權(quán)利要求1到17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中受試者是人。
19.權(quán)利要求1到18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者選自新生兒、免疫力低下的個(gè)體和老年個(gè)體。
20.權(quán)利要求1到19中任意一項(xiàng)所述的方法，其中受試者是非人動(dòng)物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述非人動(dòng)物是患膿毒癥的動(dòng)物模型。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述患膿毒癥的動(dòng)物模型是LPS誘發(fā)的膿毒癥。
23.權(quán)利要求1到22中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品是外周血液樣品。
24.權(quán)利要求1到23中任意一項(xiàng)所述的方法，其中線粒體核酸是DNA。
25.權(quán)利要求1到23中任意一項(xiàng)所述的方法，其中線粒體核酸是RNA。
26.權(quán)利要求25的方法，其中RNA是mRNA。
27.用于通過測(cè)定來自受試者的樣品中線粒體核酸的相對(duì)量而確定所述受試者膿毒癥疾病狀態(tài)的診斷試劑盒，所述試劑盒包括i)線粒體核酸引物；以及ii)核核酸引物。
28.權(quán)利要求27的試劑盒，其中線粒體核酸是DNA。
29.權(quán)利要求27或28的試劑盒，其中線粒體核酸是RNA。
30.權(quán)利要求29的試劑盒，其中RNA是mRNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了在受試者中通過測(cè)定線粒體核酸相對(duì)量來檢測(cè)受試者膿毒癥疾病狀態(tài)的方法。本發(fā)明的測(cè)定方法包括PCR方法，如半定量或定量PCR，該P(yáng)CR包括對(duì)線粒體序列和參考序列比如基因組序列的共同擴(kuò)增。從這些測(cè)定法中得到的信息可用于評(píng)估以提供在受試者細(xì)胞中線粒體核酸與核核酸的比值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1665940SQ03815987
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月5日
發(fā)明者H·科特, J·蒙塔內(nèi)爾, M·奧肖內(nèi)西 申請(qǐng)人:英屬哥倫比亞大學(xué)