專利名稱：一種心臟血管靶向型短肽mi-1與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別涉及一種心臟血管靶向型短肽MI-I與應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
實現(xiàn)對組織與器官靶向治療和靶向診斷，必須要解決的問題是找到合適的組織與器官血管的特異性靶向子。對受損、病損和衰老心臟實施靶向治療和靶向診斷，關(guān)鍵在于找到經(jīng)靜脈使用能特異性靶向心臟血管的靶向子。使用抗原-抗體作為特異性介導(dǎo)靶向策略是目前常用的思路，但該策略很大程度受制于(1)能否找到特異于不同組織、器官血管內(nèi)皮細胞的抗原，由于目前尚未能鑒定及純化特異于心臟血管的抗原，故尚無利用該原理成功實現(xiàn)對心臟血管特異性靶向的報道；(2)實施靶向的單克隆抗體的免疫源性是抗體作為特異性靶向的一大障礙；C3)由于抗體分子較大，當(dāng)其與別的生物大分子(如生長因子、基因治療表達載體)連接之后，能否順利穿越血管內(nèi)皮細胞，從而發(fā)揮其療效也是該策略的另一大障礙，故目前臨床尚無利用抗體介導(dǎo)特異性靶向?qū)θ毖獕乃佬募嵤┌邢蛑委煹乃幬铮矝]有能為臨床使用，能特異性靶向心臟血管的靶向子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種心臟血管靶向型短肽MI-1。該短肽經(jīng)靜脈使用(注射及介入輸入等)，能在活體內(nèi)能特異性靶向心臟血管，并能高親和靶向粘附在心臟血管內(nèi)皮細胞表面分子，從而實現(xiàn)對心臟血管的特異性靶向。本發(fā)明的另一目的在于提供所述心臟血管靶向型短肽MI-I的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種心臟血管靶向型短肽MI-1，其氨基酸序列如下所示CPRRPGRVC ；更優(yōu)選為，該心臟血管靶向型短肽MI-I通過兩端的半胱氨酸之間形成強力二硫鍵，從而形成環(huán)肽結(jié)構(gòu)。所述的心臟血管靶向型短肽MI-I由L型氨基酸或D型氨基酸組成，優(yōu)選通過D型氨基酸組成，在通過載體表達該MI-I或合成該MI-I時，可通過兩端的半胱氨酸形成二硫鍵，使其呈環(huán)狀。所述心臟血管靶向型短肽MI-I的核苷酸序列如下所示5，-TGCCCGAGGAGGCCGGGG AGGGTTTGC-3，。所述的心臟血管靶向型短肽MI-I應(yīng)用于制備特異性靶向心臟血管的制劑。該特異性靶向心臟血管的制劑可通過心臟血管靶向型短肽MI-I (鏈狀或環(huán)狀)與生物大分子連接得到，或通過把編碼該MI-I短肽的基因序列克隆到其它表達載體，使MI-I與其它功能蛋白表達為融合蛋白，從而能得到利用MI-I實現(xiàn)對心臟血管特異性靶向的載體及其蛋白表達產(chǎn)物；所述的生物大分子為生長因子、基因治療表達載體、視蹤劑、顯影劑、生物微囊或其它化學(xué)結(jié)構(gòu)成分、其它能與MI-I進行連接的大分子結(jié)構(gòu)，或通過把編碼該MI-I短肽的基因序列克隆到其它表達載體所形成的含MI-I編碼序列的載體及其蛋白表達產(chǎn)物。所述心臟血管靶向型短肽MI-I經(jīng)靜脈使用(注射及介入輸入等)，能在活體內(nèi)能特異性靶向心臟血管，并能高親和靶向粘附在心臟血管內(nèi)皮細胞表面分子，從而實現(xiàn)對心臟血管的特異性靶向，利用該心臟血管靶向型短肽MI-I的上述特性，使用D型氨基酸合成的短肽MI-I能有效對抗各種蛋白酶的降解并能高親和性靶向心臟血管，而成為能特異性靶向心臟血管的靶向子，把該心臟血管靶向型短肽MI-I與其它生物大分子(如生長因子、 基因治療表達載體、視蹤劑、顯影劑、生物微囊等)進行連接(注由于上述大分子只是連接在MI-I的氨基端或羧基端，并沒有破壞兩端半胱氨酸之間所形成強力二硫鍵，因此，MI-I 還呈環(huán)狀)，就能介導(dǎo)相應(yīng)的連接物特異性靶向錨定在心臟血管內(nèi)皮細胞，并介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞對其的內(nèi)吞作用，從而介導(dǎo)與之連接的生物大分子跨越血管進入心肌層，從而發(fā)揮靶向治療、靶向視蹤劑及靶向顯影劑的作用。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果如下①由于血管內(nèi)皮細胞位于血管的內(nèi)表面，本發(fā)明是在活體狀態(tài)下直接對心臟血管內(nèi)皮細胞表面分子進行篩選而得到的，因此該MI-I能高親和性靶向心臟血管的內(nèi)皮細胞表面分子，從而能實現(xiàn)對心臟血管的特異性靶向。②通過實驗證明，本發(fā)明所述的心臟血管靶向型短肽MI-I經(jīng)靜脈注射使用(注射及介入輸入等)，能在活體內(nèi)特異性靶向心臟血管，并能高親和靶向粘附在心臟血管內(nèi)皮細胞表面，從而實現(xiàn)對心臟血管的特異性靶向。③本發(fā)明所述的心臟血管靶向型短肽MI-I共由9個氨基酸構(gòu)成，兩端各有一個半胱氨酸，該兩端的半胱氨酸之間形成強力二流鍵使MI-I形成環(huán)肽，從而能高親和性與其結(jié)構(gòu)相配的心臟血管內(nèi)皮細胞的表面分子相結(jié)合；而且其具有分子量小，沒有細胞毒性和免疫源性的優(yōu)點。④本發(fā)明所述的心臟血管靶向型短肽MI-I能與其它生物分子連接(如生長因子、基因治療表達載體、視蹤劑、顯影劑、生物微囊等)，從而介導(dǎo)所連接的生物分子特異性靶向心臟血管。本發(fā)明所述的心臟血管靶向型短肽MI-I由于分子較小，當(dāng)其與別的生物大分子(如生長因子、基因治療表達載體、視蹤劑、顯影劑、生物微囊等)連接之后，能靶向錨定在心臟血管內(nèi)皮細胞，并介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞對其的內(nèi)吞作用，從而介導(dǎo)與之連接的生物大分子跨越血管進入心肌層，從而發(fā)揮其靶向治療的療效。


圖1是由D型氨基酸構(gòu)成的心臟血管靶向型短肽MI-I的質(zhì)譜圖。圖2是靜脈注射用FITC熒光標(biāo)記MI-I的SD大鼠心臟熒光圖，其中A為MI-I用量100 μ g組；B為MI-I用量50 μ g組；C為MI-I用量20 μ g組；D為MI-I用量5 μ g組；E 和F為對照組。圖3是靜脈注射用FITC熒光標(biāo)記MI-I的SD大鼠不同器官的切片圖。圖4是靜脈注射不同劑量用FITC熒光標(biāo)記MI-I后的心臟的陽性血管數(shù)柱形圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1利用隨機短肽文庫噬菌體顯示體內(nèi)篩選技術(shù)對能高親和性粘附在心臟血管內(nèi)皮細胞的短肽進行篩選。具體步驟如下(1)本發(fā)明使用隨機短肽文庫噬菌體顯示體內(nèi)篩選技術(shù)對能高親和性粘附在心臟血管內(nèi)皮細胞的短肽進行篩選，使用Mo Bi Tec公司的噬菌體顯示7肽文庫系統(tǒng)，所使用的文庫的機理使插入的短肽和噬菌體包膜蛋白III 一起被表達成為融合蛋白，并在插入的短肽基因的兩端各加了一個半光氨酸編碼序列(TGC)，兩個半光氨酸之間的二硫鍵能使插入短肽向外凸起形成一個環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，易于與其機構(gòu)相配的蛋白形成高親和性結(jié)合。所使用文庫系統(tǒng)含IO9短肽編碼序列，每擴增一次，每個序列能產(chǎn)生約200個拷貝，且廣泛的擴增未能使文庫產(chǎn)生明顯的構(gòu)成短肽序列氨基酸的非隨機性偏離。本發(fā)明的操作過程如下使用濃度為1012cfU//200y 1，含7肽文庫噬菌體進行本研究的體內(nèi)篩選。使用SD大鼠模型(廣東省實驗動物中心，本研究所使用的鼠均為達到III 級)進行體內(nèi)篩選，于大鼠尾靜脈注射按照Mo Bi Tec噬菌體顯示7肽文庫系統(tǒng)說明書中操作步驟制備的200 μ 1的含短肽文庫噬菌體(IO12Cfu)，5分鐘后，使用PBS (0. OlM ；pH = 7. 4)進行主動脈插管灌注直至灌注流出的液體顏色由紅變清，然后分離出經(jīng)注射的心臟， 置于處于感受態(tài)的Ε. coliWK6 XmutS(Mo Bi Tec噬菌體顯示7肽文庫系統(tǒng)提供)中，回收高親和性粘附在心臟血管的噬菌體，然后在4°C、8000rpm下離心10分鐘，收集上清液，然后再按0. 15體積比加入PEG8000/NaCl (質(zhì)量體積比16. 7% /3. 3M)溶液，并在4°C、100，OOOrpm 下離心30分鐘以收集高親和性粘附在心臟血管的噬菌體，然后將收集噬菌體使用另一 SD 大鼠使用如上述步驟進行下一輪的篩選，整個篩選共需3個循環(huán)，于第三個循環(huán)結(jié)束后，將單個經(jīng)篩選的獨立克隆進行DNA測序以確定不同克隆噬菌體所編碼短肽的DNA序列，然后使用DNA-蛋白序列的互換軟件，即可得到相應(yīng)的氨基酸序列，從而甄別出能高親和性粘附在心臟血管內(nèi)皮細胞表面分子的短肽序列。通過上述篩選，篩選到心臟血管靶向型短肽MI-1，其氨基酸序列為 CPRRPGRVC (兩端的半胱氨酸之間形成強力二硫鍵使MI-I形成環(huán)肽)，該短肽序列的編碼基因序列為:5，-TGC CCG AGG AGG CCG GGG AGG GTT TGC-3，。實施例2合成由D型氨基酸構(gòu)成的心臟血管靶向型短肽MI-ID型氨基酸構(gòu)成的短肽能有效地抵抗蛋白酶的降解，因此按照實施例1得到的心臟血管靶向型短肽MI-I的氨基酸序列(CPRRPGRVC)，使用D型氨基酸合成，得到心臟血管靶向型短肽MI-I (簡稱MI-1)，在合成MI-I時，在氨基端和羧基端的半胱氨酸之間通過二硫鍵連接，使得到的MI-I呈環(huán)狀。為了對MI-I的體內(nèi)靶向能力進行示蹤，在合成時，可使用 FITC標(biāo)記MI-I的氨基端，以便對其進行體內(nèi)示蹤，以確認(rèn)短肽MI-I的體內(nèi)靶向心臟能力。 使用質(zhì)譜確認(rèn)合成的心臟血管靶向型短肽MI-I的分子量為1041. 3 (如圖1所示)，使用高效液相色譜(使用s印axGP-C18柱，溶液A為體積百分比為0. 的三氟乙酸水溶液；溶液 B為體積百分比為80%的丙烯腈水溶液中加入三氟乙酸得到，其中三氟乙酸的終濃度為體積百分比的0. 09% ；測定流速為lml/min，檢測波長為220nm)確定純度大于95%。實施例3
5
應(yīng)用在體實時和離體組織切片觀察已證明經(jīng)靜脈使用，環(huán)狀短肽MI-I能特異性靶向心臟血管并存在最適劑量。(1)在體內(nèi)實時觀察于經(jīng)麻醉的SD大鼠模型Q50 300g)的尾靜脈注射經(jīng)FITC標(biāo)記的不同劑量的合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I (5 μ g, 20 μ g, 50 Ug和100 μ g)，并打開經(jīng)注射動物的胸腔，使用熒光體視顯微鏡(Olympus-MVXlO)對經(jīng)注射心臟的血管進行在體實時觀察，實施尾靜脈注射FITC-環(huán)狀短肽MI-I (50 μ g組)3分鐘后，即在心臟表面的血管壁的發(fā)現(xiàn)熒光陽性(如圖2的A C中箭頭所示)，而作為對照組的注射FITC(0. 005mg/mL)熒光染料的心臟，血管壁的內(nèi)層不呈熒光陽性(如圖3的E和F箭頭所示)，在靠近血管部位的心肌組織卻呈熒光陽性(如圖2的E和F的星號所示)。而在IOOyg組，呈熒光陽性的血管壁的熒光強度與50 μ g組接近，且與50 μ g組相比，有大量的尚未靶向血管壁熒光物存在于管腔的血流中(如圖3的A C中箭頭所示)。5 μ g和20 μ g組，呈熒光陽性的血管壁的熒光強度明顯弱于50 μ g組(如圖2的A D)。(2)離體組織切片觀察把經(jīng)FITC熒光標(biāo)記的合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I (5 μ g, 20 μ g, 50 Ug和 100 μ g)，靜脈注射入SD大鼠模型Q50 300g)中，5分鐘后分別取出心臟、大腦、骨骼肌、 肝和腎進行冰凍切片，在熒光/白光顯微鏡下觀察經(jīng)標(biāo)記的合成環(huán)狀短肽MI-I體內(nèi)靶向的情況。本部分的研究結(jié)果表明50 μ g合成環(huán)狀短肽MI-I注射組的心臟有許多血管呈熒光陽性(發(fā)綠色熒光)(如圖3的A D所示)，而在大腦(如圖3的E)、骨骼肌(如圖3 的F)、肝(如圖3的G)和腎(如圖3的H]沒有發(fā)現(xiàn)有陽性血管。經(jīng)注射對照短肽-FITC 的心臟未見呈熒光陽性的血管(如圖3的I和J所示)。IOOyg合成環(huán)狀短肽MI-I經(jīng)注射組的心臟，橫切面呈熒光陽性的血管數(shù)目與50 μ g組比較，沒有顯著性差異(P > 0. 05)。 5 μ g和20 μ g合成環(huán)狀短肽MI-I經(jīng)注射組的心臟，橫切面呈熒光陽性的血管數(shù)目顯著低于 50 μ g 組(P < 0. 05)(如圖 4 所示)。上述研究結(jié)果表明(1)合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I-FITC經(jīng)靜脈應(yīng)用能靶向心臟血管，而在經(jīng)合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I-FITC注射的大腦，骨骼肌，肝臟和腎臟卻未能發(fā)現(xiàn)有呈綠色熒光陽性的血管。證明①合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I能特異性地靶向心臟血管；②合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I能作為心臟血管特異性的靶向子。(2)合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I經(jīng)靜脈應(yīng)用，其特異性靶向心臟血管的能力存在劑量效應(yīng)，在本模型中，其最適劑量為50 μ g。實施例4應(yīng)用在體實時觀察已證明經(jīng)靜脈使用，環(huán)狀短肽MI-I特異性靶向心臟血管后， 能跨越血管進入心肌層。于經(jīng)麻醉SD大鼠模型Q50-300g)的尾靜脈注射經(jīng)FITC標(biāo)記的不同劑量的合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I (5 μ g, 20 μ g, 50 Ug和100 μ g)，并打開經(jīng)注射模型鼠的胸腔，使用熒光體視顯微鏡(Olympus-MVXlO)對經(jīng)注射的心臟的血管進行在體實時觀察，實施尾靜脈注射FITC-環(huán)狀短肽MI-I (50 μ g組)3分鐘后，即在心臟表面的血管壁發(fā)現(xiàn)熒光陽性，隨著時間的推移，在靠近血管部位的心肌組織也逐漸呈熒光陽性。連續(xù)觀察1小時，經(jīng)靜脈注射FITC-環(huán)狀短肽MI-I心臟的許多血管仍然呈陽性(如圖2B中的箭頭所示)。上述結(jié)果提示合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I能特異性地靶向心肌的血管內(nèi)皮細胞，且在靶向血管內(nèi)皮細胞之后，相當(dāng)一部分的合成環(huán)狀心臟血管靶向型短肽MI-I 能停留起碼1小時以上，且部分靶向心肌血管內(nèi)皮細胞的環(huán)狀短肽MI-I能穿越血管進入心肌層。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種心臟血管靶向型短肽MI-1，其特征在于該心臟血管靶向型短肽MI-I的氨基酸序列如下所示CPRRPGRVC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟血管靶向型短肽MI-1，其特征在于所述的心臟血管靶向型短肽MI-I為線性肽鏈或是通過兩端的半胱氨酸連接形成的環(huán)狀肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟血管靶向型短肽MI-1，其特征在于所述的心臟血管靶向型短肽MI-I中的氨基酸為L或D型氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟血管靶向型短肽MI-1，其特征在于所述的心臟血管靶向型短肽MI-I的核苷酸序列如下所示5，-TGCCCGAGGAGGCCGGGGAGGGTTTGC-3，。
5.權(quán)利要求1 4任一項所述的心臟血管靶向型短肽MI-I的應(yīng)用，其特征在于所述的心臟血管靶向型短肽MI-I用于制備特異性靶向心臟血管的制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的心臟血管靶向型短肽MI-I的應(yīng)用，其特征在于所述的特異性靶向心臟血管的制劑為心臟血管靶向型短肽MI-I與生物大分子連接得到，或通過把編碼該MI-I短肽的基因序列克隆到其它表達載體，使MI-I與其它功能蛋白表達為融合蛋白得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的心臟血管靶向型短肽MI-I的應(yīng)用，其特征在于所述的生物大分子為生長因子、基因治療表達載體、視蹤劑、顯影劑或生物微囊。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種心臟血管靶向型短肽MI-1與應(yīng)用。該心臟血管靶向型短肽MI-1的氨基酸序列為CPRRPGRVC，編碼該MI-1的核苷酸序列為5’-TGCCCGAGGAGGCCGGGGAGGGTTTGC-3’。該心臟血管靶向型短肽MI-1能高親和性靶向心臟血管的內(nèi)皮細胞表面分子，從而能實現(xiàn)對心臟血管的特異性靶向。將其與生物大分子，如生長因子、基因治療表達載體、示蹤劑、顯影劑、生物微囊和其它化學(xué)結(jié)構(gòu)成分等連接之后，能靶向錨定在心臟血管內(nèi)皮細胞，并介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞對其的內(nèi)吞作用，從而介導(dǎo)與之連接的生物大分子跨越血管進入心肌層，從而發(fā)揮其靶向治療及靶向示蹤等功能。
文檔編號C07K7/06GK102504015SQ201110388369
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者姚瑤, 曹亮, 李丹, 李震, 沈曉濤, 王鍵, 蔡冬青, 趙寶寅, 鄭馨 申請人:暨南大學(xué)