專利名稱：一種檢測氨基苷類抗生素單克隆抗體及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其針對抗氨基苷類抗生素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，已及獲取對其殘留的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
氨基苷類抗生素是由二個或三個氨基糖分子和一個的氨基環(huán)醇通過醚鍵連接而成，主要包括鏈霉素、慶大霉素、新霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星等，是一類廣譜抗生素，對結(jié)核桿菌、鉤端螺旋體、放線菌及多種革蘭氏陰性桿菌具有較強(qiáng)的殺菌作用，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中也常添加到飼料中促進(jìn)生長發(fā)育。同時，氨基苷類抗生素極易產(chǎn)生交叉耐藥性，例如，原先對lug/ml濃度鏈霉素敏感的大腸桿菌，經(jīng)過3-4天治療后，可以耐受100ug/ml的濃度，因此在農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)中用量越來越大。而該類抗生素為對人腦、神經(jīng)、聽覺 以及腎臟產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。例如，德國從2002年6月I日起，將鏈霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)由原來的0. 2mg/kg提高到0. 02mg/kg,導(dǎo)致目前所有的歐盟國家都將按此標(biāo)準(zhǔn)來控制，而對我國蜂蜜的檢測情況看，絕大部分都高于這一標(biāo)準(zhǔn)，因而導(dǎo)致我國蜂蜜不能出口到歐盟國家或只能降價(jià)銷售，使我蜂蜜出口商和生產(chǎn)商嚴(yán)重虧損。隨著對食品安全問題的重視，我國在1990年11月頒布的《乳與乳制品衛(wèi)生管理辦法》及農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》的通知，均對氨基苷類抗生素的最高殘留限量(MRLs)作出了規(guī)定；因此加強(qiáng)對食品中各種藥物殘留的監(jiān)控已成為重塑我國食品安全信心的重要手段。文獻(xiàn)檢索披露2003年歐盟及第三方國家基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室(NRL)聯(lián)合舉行的使用ELISA方法來檢測牛奶中的氨基糖苷類抗生素殘留協(xié)同試驗(yàn)，各參加實(shí)驗(yàn)室使用內(nèi)部ELISA方法或使用商業(yè)試劑盒(由Eurodiagnostica、r_Biopharm和Tecna等公司提供)對提供的12支樣本進(jìn)行測試，通過對靈敏度、特異性、回和收率等參數(shù)的考核，證明所使用的ELISA方法可以用來初篩定性檢測使用。本發(fā)明構(gòu)思的制備方法，利用所制備的單克隆抗體，建立氨基苷類抗生素殘留的ELISA快速檢測技術(shù)及試劑盒；同時提供的單克隆雜交瘤細(xì)胞株已被中國典型生物保藏中心保藏，號為CCTCC C201135。該單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、親和力高的優(yōu)點(diǎn)，與其它抗生素?zé)o交叉反應(yīng)，而與鏈霉素、新霉素、慶大霉素，卡那霉素等氨基苷類抗生素具有極高親和力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于提供的檢測氨基苷類抗生素殘留的方法，苷類抗生素殘留檢測試劑盒中的運(yùn)用，[微軟用戶I]能夠保證氨基苷類抗生素殘留檢測過程中的靈敏度和特異性。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1)獲得具有保藏號為CCTCC C201135的單克隆雜交瘤細(xì)胞株P(guān)ami-SP20 ；2) 一種抗氨基苷類抗生素的單克隆抗體Pami-SP20_antibody,由雜交瘤細(xì)胞株P(guān)ami-SP20產(chǎn)生的抗體為IgGl亞型，可特異性識別氨基苷類抗生素，并具有較強(qiáng)的親和力；3) —種檢測氨基苷類抗生素殘留的試劑盒，利用保藏號為CCTCC C201135的單克隆雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，獲取氨基苷類抗生素的檢測方法及試劑盒。本發(fā)明構(gòu)思的技術(shù)路線
I)采用碳二亞胺(Carbodiimide, EDC)法,將鏈霉素(Streptomycin, SM)與卵清蛋白(ovalbumin, OVA)偶聯(lián),合成了鏈霉素完全抗原SM-0VA,用于Balb/c小鼠免疫。2)碳二亞胺(Carbodiimide, EDC)法，將鏈霉素(Streptomycin, SM)與牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)偶聯(lián),合成鏈霉素完全抗原SM-BSA,用于單克隆抗體的ELISA篩選；
3)用PEG1500將經(jīng)SM-OVA免疫的Balb/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)后，SM-BSA包被酶標(biāo)板，篩選陽性克隆，陽性克隆經(jīng)三輪有限稀釋單克隆化后，擴(kuò)大培養(yǎng)； 4)所獲單克隆抗體，進(jìn)一步westernblot及ELISA驗(yàn)證其特異性,并采用SIGMA公司單抗亞型鑒定試劑盒進(jìn)行亞型鑒定；
5)陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞注射Balb/c小鼠制備所需單克隆抗體腹水。本發(fā)明將系列抗生素與BSA偶聯(lián)后，用所述單克隆抗體進(jìn)行Western-blot檢測，驗(yàn)證了單克隆抗體具有極高的特異性，并獲取了能高效分泌抗氨基苷類抗生素單克隆抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞系，并同時進(jìn)行的單克隆抗體的殘留檢測試劑盒的靈敏度試驗(yàn)及特異性試驗(yàn)，更進(jìn)一步驗(yàn)證了本發(fā)明的單克隆抗體用于檢測氨基苷類抗生素殘留時表現(xiàn)出的高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢，彰顯技術(shù)進(jìn)步。


本發(fā)明對照附圖作進(jìn)一步的說明。附圖I是單克隆抗體與系列抗生素-BSA偶聯(lián)抗原的western blot雜交結(jié)果的電泳 如圖所示A:SDS PAGE電泳圖；B =Wester blot結(jié)果；1. BSA ；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(分子量由上至下分別為170、130、95、72、55、43、34、26、17kDa) ；2.鏈霉素-BSA ;3.慶大霉素-BSA;4.新霉素-BSA ;5.氨芐霉素-BSA ;6.卡那霉素-BSA ;7.大觀霉素-BSA ;8.強(qiáng)力霉素-BSA。附圖2是ELISA方法的應(yīng)用電泳 如圖所示a:抗原包被濃度實(shí)驗(yàn)，Al -Hl (A2-H2為重復(fù))分別為鏈霉素-BSA抗原40 ug/ml-0. 00571 ug/ml倍比稀釋，HU H2為未包被對照；b: ELISA特異性實(shí)驗(yàn)，Al、A2孔包被鏈霉素-BSA，BI，B2包被慶大霉素-BSA，Cl，C2包被新霉素-BSA，Dl, D2包被卡那霉素-BSA，El, E2包被氨芐霉素-BSA，F(xiàn)l, F2包被強(qiáng)力霉素_BSA，Gl, G2包被大觀霉素-BSA，H1、H2包被BSA ；c :ELISA敏感性實(shí)驗(yàn)，正交法法將鏈霉素進(jìn)行稀釋，測定ELISA方法敏感性H4_A4 :鏈霉素 200 ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12. 5ng/ml、6. 25ng/ml、3. 125ng/ml、l. 5625ng/mlng/ml,隨后依次由第4列向第I列倍比稀釋。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明將對照實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例利用保藏號為CCTCC C201135的單克隆雜交瘤細(xì)胞株P(guān)ami_SP20所分泌的單克隆抗體，獲取氨基苷類抗生素的檢測方法及試劑盒，實(shí)驗(yàn)步驟如下；
I)抗體檢測板的制備
步驟一，碳二亞胺(Carbodiimide，EDC)法，將EDC置于室溫下，放置3h ;取IOmg BSA溶于ImL MES緩沖液中，取20mg SM溶于2. 5mL MES緩沖液中，兩溶液混合；取5mg EDC溶于0. 5mL滅菌蒸餾水中后，緩慢加入SM和BSA的混合溶液，室溫下反應(yīng)6h，在4 °C冰箱中，用PBS0. 01 moL/ L，pH 7. 2，透析4次，每次5h，偶聯(lián)產(chǎn)物冷凍干燥保存?zhèn)溆茫? 步驟二，將經(jīng)透析純化后的完全抗原SM-BSA固定于酶聯(lián)板，以梯級濃度包被酶聯(lián)板，每孔100ul，4°C包被過夜，而后用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌2min;將其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37°C封閉2h，晾干后即得到所述檢測板。步驟三，選用的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)的純度大于96%(Sigma A6003);卵清蛋白(ovalbumin, OVA)的純度大于 98% (Sigma A5503);鏈霉素(Streptomycin, SM)的純度大于 98% (Sigma S1277)。2)完全抗原的制備
制備用于動物免疫及單抗篩選的完全抗原
步驟一、SM-OVA的合成，將EDC置于室溫下，放置3h ;取IOmg OVA溶于ImL MES緩沖液中，取20mg SM溶于2. 5mL MES緩沖液中，兩溶液混合；取5mg EDC溶于0. 5mL滅菌蒸懼水中后，緩慢加入SM和OVA的混合溶液，室溫下反應(yīng)6h，在4 °C冰箱中，用PBS0. 01 moL/L，pH 7.2，透析4次，每次5 h，偶聯(lián)產(chǎn)物冷凍干燥保存?zhèn)溆?，用于Balb/c小鼠免疫。3)單克隆雜交瘤細(xì)胞系的制備
步驟一、動物免疫分別以SM-OVA免疫8周齡Balb/c小鼠首次免疫以弗氏完全佐劑乳化抗原，多點(diǎn)皮下注射。初次免疫間隔21d，以后每隔14d用不完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫4次；第4次免疫7d后，尾靜脈采血，分離血清，測定效價(jià)。步驟二、細(xì)胞融合取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清，常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，并經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選，待雜交瘤細(xì)胞長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。步驟三、雜交瘤細(xì)胞克隆SM-BSA抗原用包被液稀釋至10ug/ml,包被酶標(biāo)板，間接ELISA法對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測；采用有限稀釋法對抗體檢測陽性孔進(jìn)行三輪克隆，獲較為均一的陽性克隆后，擴(kuò)大培養(yǎng)，并液氮凍存。步驟四、抗體亞型鑒定單克隆細(xì)胞培養(yǎng)液上清用PBSl :100倍稀釋后，包被96孔酶標(biāo)板(IOOul/孔)；采用 Sigma公司的小鼠單克隆抗體分型試劑盒，按操作說明，間接ELISA法進(jìn)行單克隆抗體亞型鑒定，每種抗體樣品重復(fù)3次，并設(shè)陽性及空白對照。步驟五、單克隆腹水制備8周齡Balb/c小鼠每只注射0. 5ml降植燒，14d后分別注射Pami-SP20交瘤細(xì)胞0. 5ml (I X 107細(xì)胞/毫升)，IOd左右收集腹水，簡單離心純化后ELISA測定其效價(jià)。步驟六、western-blot分析參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南,配制各種溶液,積層膠濃度為4 %，分離膠濃度為12 %，BSA、SM-BSA, SM-慶大霉素、SM-新霉素、SM-氨芐霉素、SM-卡那霉素、SM-大觀霉素、SM-強(qiáng)力霉素50微克/孔分別點(diǎn)樣，積層膠恒流10mA，分離膠恒流25mA電泳，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，單克隆抗體I :2000稀釋，western-blot驗(yàn)證其特異性。如圖I所示，進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡，參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，配制好反應(yīng)液體，積層膠濃度為4 %，分離膠濃度為12 %，積層膠恒流10mA，分離膠恒流25mA電泳，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，Pami-SP20-antibody單克隆抗體I :2000稀釋,進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(western-blot),驗(yàn)證單克隆抗體的反應(yīng)特異性。步驟七、Pami-SP20_antibody單克隆抗體的辣根過氧化物酶標(biāo)記稱取HRP25mg溶于I. 25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜；反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)S印hadex G_25層析柱，用生理鹽水洗脫，流速控制在lml/1分鐘，收集棕色流出液；待標(biāo)記的抗體12. 5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中；用IM pH9. 5碳酸緩沖液0. 25ml，繼續(xù)攪拌3h ;力口0. 2M賴氨酸0. 25ml，混勻后，置室溫2h ;在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C Ih ； 3000rpm離心30min，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于3ml0. 15MpH7. 4的PBS中；將上述溶液裝入透析袋中，用0. 15M pH7. 4的PB緩沖鹽水透析，10, OOOrpm離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。4)完全抗原的包被實(shí)驗(yàn)在本實(shí)施例中需要對SM-BSA完全抗原的包被條件和濃度進(jìn)行優(yōu)化；為了達(dá)到此目的還需要先對試劑盒中ELISA反應(yīng)液成分進(jìn)行說明
試劑盒中ELISA反應(yīng)液成分
酶結(jié)合物工作液辣根過氧化物酶標(biāo)記的Pami-SP20_antibody單克隆抗體；
陽性對照20ng/ml鏈霉素的PBS溶液；
陰性對照無鏈霉素的PBS溶液；
樣品稀釋液10mmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中含有I % BSA,0. 05 % Tween-20和lmg/L慶大霉素；
濃縮洗滌液0. lmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中含有1%胎牛血清，0. 5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；
顯色液A :0. 02%H202 ;用0. IM檸檬酸-0. 2M磷酸氫二鈉，pH 4. 5稀釋；
顯色液B :0. 4%0 TMB-HCl :用50mM檸檬酸鈉，濃HCl調(diào)pH值為2. 8的溶液溶解； 終止液2M H2SO4。將上述實(shí)施例I中獲取的SM-BSA抗原分別以40、20、10、5、2. 5、I. 25、0. 625、0. 3125,0. 15625,0. 07534 ug/ml濃度包被酶聯(lián)板，每孔用量lOOul，4°C包被過夜，PBST洗滌3min，拍干，5%BSA 37°C封閉2h，Pami-SP20_antibody單克隆抗體1:5000倍稀釋后取100ul加入反應(yīng)孔，37°C反應(yīng)lh，PBST洗滌4次，每次lmin，拍干，HRP標(biāo)記抗鼠二抗1:10000倍稀釋后，每孔加入100 ul，37°C反應(yīng)40min，PBST洗滌4次，每次lmin，拍干，每孔加入TMB底物溶液100 ul，37°C反應(yīng)15min，加入50 ul 2M H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定OD值，如表2所示，結(jié)果顯示在包被濃度I. 25ug/ml范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)OD值無明顯差別，最終選擇抗原包被濃度為10ug/ml。
權(quán)利要求
1.有保藏號為CCTCCC201135的單克隆雜交瘤細(xì)胞株P(guān)ami-SP20。
2.一種抗氨基苷類抗生素的單克隆抗體Pami-SP20-antibody,其特征在于由具有保藏號為CCTCC C201135的雜交瘤細(xì)胞株P(guān)ami_SP20產(chǎn)生，所述抗體為IgGl亞型，可特異性識別氨基苷類抗生素，并具有較強(qiáng)的親和力。
3.—種檢測氨基苷類抗生素殘留的試劑盒，其特征在于利用保藏號為CCTCCC201135的單克隆雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，獲取氨基苷類抗生素的檢測方法及試劑盒，步驟如下； 其中完全抗原的制備 步驟I SM-BSA的合成，將EDC置于室溫下，放置2_3h ;取IOmg BSA溶于ImL MES緩沖液中，取20mg SM溶于2. 5mL MES緩沖液中，兩溶液混合；取511^ EDC溶于O. 5mL滅菌蒸餾水中后，緩慢加入SM和BSA的混合溶液，室溫下反應(yīng)5-7h，在4 °C冰箱中，用PBS0. 01 moL/L，pH 7.2，透析4次，每次5-6 h，偶聯(lián)產(chǎn)物冷凍干燥保存?zhèn)溆?，用于單克隆抗體的ELISA篩選； 步驟2 SM-OVA的合成，將EDC置于室溫下，放置2_3 h ;取IOmg OVA溶于ImL MES緩沖液中，取20mg SM溶于2. 5mL MES緩沖液中，兩溶液混合；取5mg EDC溶于O. 5mL滅菌蒸餾水中后，緩慢加入SM和OVA的混合溶液，室溫下反應(yīng)5-7h，在4 °C冰箱中，用PBS0. 01moL/ L，pH 7.2，透析4次，每次5_6 h，偶聯(lián)產(chǎn)物冷凍干燥保存?zhèn)溆?，用于Balb/c小鼠免疫； 其中單克隆雜交瘤細(xì)胞系的制備 步驟I動物免疫，分別以SM-OVA免疫8周齡Balb/c小鼠；首次免疫取200ulSM_0VA加入等量弗氏完全佐劑乳化抗原，多點(diǎn)皮下注射，初次免疫間隔21d，以后每隔14d，用150ulSM-0VA加入等量不完全佐劑充分乳化，加強(qiáng)免疫4次，第4次免疫3d后，尾靜脈采血，分離血清，測定效價(jià)； 步驟2細(xì)胞融合，取免疫的BALB/c小鼠，采血，常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選，期間視細(xì)胞生長情況，每3-5d換液一次，IOd后改換HT培養(yǎng)液； 步驟3雜交瘤細(xì)胞克隆，待雜交瘤細(xì)胞長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測將SM-BSA抗原分別以10 ug/ml濃度包被酶聯(lián)板，每孔用量100ul，4°C包被過夜，用PBST洗滌3min，拍干，5%BSA 37°C封閉2h，待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清1:5倍稀釋后，取100 ul加入反應(yīng)孔，37°C、反應(yīng)lh，PBST洗滌4次，每次lmin，拍干，用HRP標(biāo)記抗鼠二抗1:10000倍稀釋后，每孔加入100 111,371€、反應(yīng)40111；[11,再用PBST洗漆4次,每次lmin,拍干,每孔加入TMB底物溶液100 111，37°〇、反應(yīng)151^11，加入50 ul 2M H2SO4即終止反應(yīng)；陽性克隆采用有限稀釋法對抗體檢測陽性孔進(jìn)行三輪克隆，獲陽性克隆后，擴(kuò)大培養(yǎng)，并液氮凍存； 步驟4抗體亞型鑒定，單克隆細(xì)胞培養(yǎng)液上清1:100倍稀釋后，按IOOul/孔包被96孔酶標(biāo)板；采用Sigma公司小鼠單克隆抗體分型試劑盒，貨號098k4823，進(jìn)行單克隆抗體亞型鑒定，每種抗體樣品重復(fù)3次； 步驟5單克隆腹水制備，8周齡Balb/c小鼠每只注射O. 5ml降植烷，14_20d分別注射Pami-SP20交瘤細(xì)胞O. 5ml，即為I X IO7細(xì)胞/毫升；8-12 d收集腹水，離心純化經(jīng)ELISA測定其效價(jià)； 步驟6 western-blot即蛋白質(zhì)印跡檢測,參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南,配制好反應(yīng)液體，用BSA、SM-BSA, SM-慶大霉素、SM-新霉素、SM-氨芐霉素、SM-卡那霉素、SM-大觀霉素、SM-強(qiáng)力霉素50微克/孔分別點(diǎn)樣，積層膠恒流10mA，分離膠恒流25mA電泳，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，Pami-SP20_antibody單克隆抗體I :2000稀釋，進(jìn)行western-blot反應(yīng)，驗(yàn)證單克隆抗體的反應(yīng)特異性； 步驟7 Pami-SP20-antibody單克隆抗體的辣根過氧化物酶標(biāo)記稱取HRP25mg溶于I.25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜；反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)S印hadex G_25層析柱，用生理鹽水洗脫，流速控制在lml/lmin,收集棕色流出液；待標(biāo)記的抗體12. 5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中；用IM pH9. 5碳酸緩沖液O. 25ml，繼續(xù)攪拌3h ;加0. 2M賴氨酸O. 25ml，混勻后，置室溫2h ;在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C Ih ；3000rpm離心30min，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于3ml0. 15M pH7. 4的PBS中；將上述溶液裝入透析袋中，用O. 15M pH7. 4的PB緩沖鹽水透析，10, OOOrpm離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2、3所述，其特征在于采用了保藏編號為CCTCCC201135單克隆雜交瘤細(xì)胞株P(guān)ami_SP20所分泌的單克隆抗體Pami-SP20_antibody ； 試劑盒的ELISA檢測板 將上述實(shí)施例I中獲取的SM-BSA抗原以10ug/ml濃度包被酶聯(lián)板，每孔用量lOOul，4°C包被過夜，PBST洗滌3min，拍干，5%BSA 37°C封閉2h，晾干，即為所述ELISA檢測板； 試劑盒的ELISA反應(yīng)液 酶結(jié)合物工作液辣根過氧化物酶標(biāo)記的Pami-SP20-antibody單克隆抗體IOml ；陽性對照20ng/ml鏈霉素的PBS溶液；陰性對照無鏈霉素的PBS溶液；樣品稀釋液IOmmoI/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中含有I % BSA，O. 05% Tween-20和lmg/L慶大霉素；濃縮洗滌液0. lmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中含有1%胎牛血清，0. 5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；顯色液A :0. 02% H2O2 ;用pH 4. 5的0. IM檸檬酸-0. 2M磷酸氫二鈉稀釋；顯色液B :0. 4%o TMB-HCl :用50mM檸檬酸鈉，濃HCl調(diào)pH值為2. 8的溶液溶解；終止液2M H2SO4 ； 試劑盒的ELISA反應(yīng)條件 ELISA反應(yīng)條件為用包被緩沖液將SM-BSA、BSA稀釋至20 ug / mL,每孔加100 μ L，4 °〇包被過夜，棄去孔內(nèi)的液體，PBST洗板I次，5%BSA 37°C封閉2h，棄上清，加入SM標(biāo)準(zhǔn)品50 μ L，使標(biāo)準(zhǔn)品中的SM和聚苯乙烯酶標(biāo)板上的SM-BSA競爭抗SM抗體，37 1濕盒放置I h，PBST洗板4次，每次I min，拍干；加TMB底物液100yL，37°C，避光顯色15 min ;力口50 μ L 2 mo I/L H2SO4終止反應(yīng)，用BI0-RAD2550型酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD 450值。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3所述，其特征在于所用weiCarbodiimide,EDC即為碳二亞胺，PIERCE公司，貨號77652 ；Streptomycin, SM即為鏈霉素Sigma公司，貨號S1277 ；ovalbumin, OVA 即為卵清蛋白 Sigma 公司，貨號 A5503 ；Bovine Serum Albumin, BSA 即為牛血清白蛋白Sigma公司，貨號A6003。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、3所述，其特征在于所用Balb/c小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心、SP2/0細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存、PEG1500購自Merck公司，貨號MK807489，辣根過氧化物酶購自Sigma，貨號YA0989，TMB購自MBCHEM公司，Tween-20購自MBCHEM公司、小鼠單克隆抗體分型試劑盒購自Sigma公司，貨號098k4823，弗氏不完全和完全佐劑購自美國Sigma公司。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種檢測氨基苷類抗生素單克隆抗體及其試劑盒，獲取保藏號為CCTCCC201135的雜交瘤細(xì)胞株P(guān)ami-SP20，并以該株所分泌單克隆抗體所建立的氨基苷類抗生素殘留快檢方法，即單克隆雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體可以直接用于氨基苷類抗生素殘留的ELISA快檢試劑制作及雙抗夾心ELISA法檢測氨基苷類抗生素殘留的捕獲抗體；本發(fā)明公開的氨基苷類抗生素檢測試劑盒中包含包被有鏈霉素-BSA抗原的檢測板、HRP標(biāo)記的上述單克隆抗體和ELISA反應(yīng)液；本發(fā)明公開的單克隆雜交瘤細(xì)胞株所分泌單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、親和力高的優(yōu)點(diǎn)，為氨基苷類抗生素殘留的快速檢測提供了新的手段。
文檔編號C07K16/44GK102776151SQ20111038724
公開日2012年11月14日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者于軍, 徐曉立, 楊建軍 申請人:塔里木大學(xué)