專利名稱：具有改善穩(wěn)定性的新的合成的異水蛭素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的合成的異水蛭素，由于在Asp-Gly基鏈區(qū)段的交換作用，因此它具有改善的穩(wěn)定性。這一方面使生產(chǎn)時(shí)產(chǎn)率增加，另一方面可以制備待用的可直接注射的溶液劑藥物制劑。
已知可由水蛭中得到具有醫(yī)療價(jià)值的對(duì)凝血酶有高親和力的抑制劑，它可用作人的治療藥，人們期望血栓形成的治療有重大的進(jìn)展。這些肽類抑制劑稱作水蛭素，并且已知有許多種天然的異水蛭素，它們只是在序列中有幾個(gè)氨基酸不同。天然異水蛭素例如在EP-A142860，EP-A158564，E-A158986，EP-A168342，EP-A171024，EP-A193175，EP-A200655，EP-A-209061，EP-A-227938中已有敘述。過去十年中DNA重組技術(shù)的進(jìn)展有可能使用經(jīng)遺傳操作加以修飾的微生物以工業(yè)規(guī)模制備水蛭素。例如在EP-A171024和EP-A200655有其引用的文獻(xiàn)中敘述了根據(jù)天然序列制備異水蛭素的方法。
然而，現(xiàn)今一個(gè)藥物要滿足的條件遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過治療活性。這些條件包括制造的費(fèi)用，臨床應(yīng)用的方便和長(zhǎng)期使用時(shí)有較高的穩(wěn)定性。
為了使改進(jìn)的治療能夠有利于廣大患者，其中包括經(jīng)濟(jì)費(fèi)用，必須使該藥物制造的費(fèi)用較低。對(duì)于遺傳工程產(chǎn)物，可通過開發(fā)優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，但也要使藥物適合于該表達(dá)系統(tǒng)。異水蛭素在這方面的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，敘述于例如EP-A324712和EP-A448093。
長(zhǎng)期使用的藥物應(yīng)考慮其有較高的穩(wěn)定性，以避免生成的分解產(chǎn)物引起治療學(xué)和藥理上的并發(fā)癥。由水蛭中已知的異水蛭素和從經(jīng)遺傳操作修飾的微生物得到的脫硫水蛭素，在這方面是令人不滿意的，由于它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上內(nèi)部發(fā)生化學(xué)變化，易于生成副產(chǎn)物。從制造過程的經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)看，預(yù)先能杜絕副產(chǎn)物的生成是有利的，因?yàn)闊o需將其除去。這就會(huì)使產(chǎn)率提高。
改善穩(wěn)定性還可以使制劑能夠貯存并可將用藥費(fèi)用降到最低程度。在水蛭素的情況下，穩(wěn)定的、可直接注射的隨時(shí)可用的溶液劑還應(yīng)當(dāng)有長(zhǎng)期可利用性這一特點(diǎn)。在這一點(diǎn)上，已知的異水蛭素的化學(xué)不穩(wěn)定性事實(shí)上是個(gè)限制因素，因?yàn)槿芙夂蟮奈镔|(zhì)受溫度影響形成副產(chǎn)物，即使貯存在冰箱中，這種制劑也只能在有限的(短)期間應(yīng)用，所以很難達(dá)到經(jīng)濟(jì)的目的。
已知的天然異水蛭素和在藥物開發(fā)中由它得到的脫硫水蛭素，只是在幾個(gè)氨基酸單元上有區(qū)別，因此可以把氨基酸序列中的易變區(qū)段和保守區(qū)段區(qū)分開。保守區(qū)段包括的序列是-Ser32-Asp(Asn)33-Gly34-和-Asn52-Asp(Asn)53-Gly54-Asp55-。該編號(hào)是Dodt等在FEBS LETTERS.165(1984)180-183中發(fā)表的含有65個(gè)氨基酸的序列。水蛭素分解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)化學(xué)分析現(xiàn)已表明，這些序列的基鏈主要支配著水蛭素的化學(xué)不穩(wěn)定性。在這個(gè)意義上不需要考慮天冬酰胺脫酰胺生成天冬氨酸的作用，因?yàn)檫@生成另一種天然的異水蛭素。水蛭素分解的實(shí)質(zhì)是在兩個(gè)-Asp-Gly順序上的異構(gòu)化和消旋化作用。由文獻(xiàn)中已知蛋白質(zhì)分解時(shí)這些反應(yīng)的重要性(JBC262，1987，785-793頁(yè)和JBC264，1989，6164-6170頁(yè)))。同樣水蛭素的羧基端結(jié)構(gòu)對(duì)于它與凝血酶的高親和力結(jié)合的重要意義也是已知的。在序列中具有保守性質(zhì)并且參與結(jié)合的區(qū)段處的氨基酸交換，會(huì)有喪失親和力的危險(xiǎn)。現(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以在保守區(qū)段進(jìn)行一些改善穩(wěn)定性的修飾，而不減弱對(duì)凝血酶的親和力，因而不會(huì)減低活性(實(shí)施例7，表1和實(shí)施例8，表2)。
另外，還有令人驚奇的情況，即盡管進(jìn)行了氨基酸的交換，甚至不止一個(gè)，仍不會(huì)增加抗原性。
此外，還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)-Asp-Gly-序列對(duì)水蛭素的不穩(wěn)定性產(chǎn)生相同的影響。只要改變這兩個(gè)序列區(qū)段，就可顯著地減低副產(chǎn)物的生成(實(shí)施例9，表2)。
在酸性條件(實(shí)施例11，圖3)和生理pH條件(實(shí)施例10，圖4)下，母體化合物和優(yōu)化的脫硫水蛭素形成副產(chǎn)物的時(shí)間過程表明，氨基末端對(duì)穩(wěn)定性無影響，因而對(duì)它的改變無助于穩(wěn)定化作用。從上述情況可以看出，實(shí)例〔Vla1，Thr2〕脫硫水蛭素所顯示的優(yōu)化作用可適用于具有不同的氨基末端的異水蛭素(例如〔Val1，Aal2〕-和〔Ile1，Thr2〕-脫硫水蛭素。
然而，深入地分析各種合成的異水蛭素的穩(wěn)定性顯示，對(duì)于像〔Ala1，Thr2，Glu33，Glu53〕脫硫水蛭素，只改換天冬氨酸并沒有最佳的作用，〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，Ala54〕-脫硫水蛭素和〔Ala1，Thr2，Glu33，Glu52，Glu53，Glu55〕-脫硫水蛭素的優(yōu)良的穩(wěn)定性令人驚奇地表明，在52位用谷氨酰胺改換掉天冬酰胺，對(duì)穩(wěn)定化作用具有重要的作用。
因此，本發(fā)明涉及具有改善了穩(wěn)定性的異水蛭素，其中，在33位為Glu，52位為Gln，Glu，Asn或Asp，53位為Glu，54位為Gly或Ala，55位為Glu或Asp。
優(yōu)選的化合物為式Ⅰ10A1-A2-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys20Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-3040Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-B-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-5052535455Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-C-D-E-F60-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln式中 A1是Leu，Ala，Ile或Val，A2是Thr或Val，
B是Glu，C是Gln或Glu，D是Glu，E是Gly或Ala，F(xiàn)是Asp或Glu。
特別優(yōu)選的化合物是〔Ala1或Leu1，-Thr2，Glu33，Gln52-Glu53-Ala54-〕-脫硫水蛭素和〔Ala1或Leu1，-Thr2，Glu33，Gln52-Glu53，Glu55-〕脫硫水蛭素。
本發(fā)明合成的水蛭素衍生物可用微生物或者用化學(xué)合成的方法制備，產(chǎn)生菌優(yōu)先選用面包酵母或大腸桿菌。
優(yōu)化了的異水蛭素的化學(xué)穩(wěn)定性以及非常有效的表達(dá)系統(tǒng)，使得制造方法比較簡(jiǎn)單和低耗費(fèi)。在這個(gè)意義上，將本身已知的生物化學(xué)方法結(jié)合起來，會(huì)使制造方法相互間略有不同。本發(fā)明還涉及這類化合物的衍生物的制備方法。例如〔Ala1，Thr2〕脫硫水蛭素的衍生物可以按歐洲專利申請(qǐng)EP-A448093公布的表達(dá)系統(tǒng)制備，該方法只包括幾步發(fā)酵結(jié)束后的細(xì)胞懸浮液或無細(xì)胞培養(yǎng)物的濾液酸化到pH2-4(例如用甲酸，HCl酸化)，產(chǎn)生的含蛋白質(zhì)的沉淀可用離心法或過濾方法除去。在最簡(jiǎn)單的情況下，即可以用培養(yǎng)基時(shí)，可用反相層析法自澄清的上清液中高度濃縮產(chǎn)物。另一方面，當(dāng)用復(fù)雜培養(yǎng)基時(shí)，減低溶液中鹽的含量是有利的，例如用超過濾-透析過濾法，以便后來在陽(yáng)離子交換劑上進(jìn)行離子交換層析，例如用Frac-togel
EMD-SO-3。在超過濾時(shí)，也可在適宜的樹脂上進(jìn)行疏水吸附，如同例如在歐洲專利申請(qǐng)EP-A316650中所述。由陽(yáng)離子交換層析得到的產(chǎn)物可直接進(jìn)入反相層析(例如在Lichroprep
RP18層析柱上)，從而得到高純產(chǎn)物。如若需要除去遺留的雜質(zhì)，還可以用另一種陰離子交換層析柱，例如用Q-瓊脂糖進(jìn)行層析。通過對(duì)各個(gè)步驟適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，收率可超過50%。
當(dāng)使用歐洲專利申請(qǐng)EP-A316650中所公布的表達(dá)系統(tǒng)制備穩(wěn)定的〔Leu1，Thr2〕-脫硫水蛭素衍生物時(shí)，可用類似的方法進(jìn)行，在這種情況下，在進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析之前，如在歐洲專利申請(qǐng)EP-A316650中所敘述，經(jīng)分批的陰離子交換劑步驟進(jìn)一步濃縮產(chǎn)物是可取的。
實(shí)施例1載體pCMT203的構(gòu)建生物技術(shù)操作，例如建立種子細(xì)胞庫(kù)或菌株的發(fā)酵最好使所用的宿主/載體系統(tǒng)置于選擇壓力下進(jìn)行。這會(huì)將外來微生物污染的危險(xiǎn)減小到最低程度。根據(jù)美國(guó)衛(wèi)生當(dāng)局的準(zhǔn)則，在制備重組蛋白質(zhì)時(shí)不應(yīng)使用抗生素氨芐青霉素。
在歐洲專利申請(qǐng)EP-A448093中敘述了質(zhì)粒pCM7051和pCM7053。由已知的對(duì)四環(huán)素的耐受性擴(kuò)增載體DNA，可以實(shí)現(xiàn)該質(zhì)粒在上述方面的改進(jìn)。
為此，用NruI使質(zhì)粒pCM7051的DNA線性化，并與由質(zhì)粒pCM7053所得到的1.1KbNruI片段連接。該DNA片段含有從質(zhì)粒pCM7051中失去的四環(huán)素抗性基因的5′-末端部分用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Mc1061菌株的感受態(tài)細(xì)胞并涂布在含有12.5mg/l四環(huán)素的NA瓊脂平板上。于37℃保溫過夜后得到轉(zhuǎn)化體。從轉(zhuǎn)化體中再分離出質(zhì)粒DNA并用限制性內(nèi)切酶分析加以鑒定。最后將正確質(zhì)粒的DNA按制造者的說明與酶AvaI和NdeI反應(yīng)，再用凝膠電泳分級(jí)分離。分離出兩個(gè)片段自我的較大者，用Klenow聚合酶補(bǔ)平末端，然后使片段連接并再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Mc1061中。用限制性內(nèi)切酶分析鑒定DNA后，得到的質(zhì)粒稱作pCMT203(

圖1)。
實(shí)施例2N-末端氨基酸為丙氨酸的水蛭素變體的構(gòu)建以丙氨酸開始的水蛭素變體要在大腸桿菌中表達(dá)。在實(shí)施例1中敘述的載體pCM7053和pcmT203以及在EP-A171024中敘述的圖示3所示的質(zhì)粒用于克隆過程，該質(zhì)粒具有合成水蛭素的DNA順序，稱作DNA順序I，本文以后稱此質(zhì)粒為質(zhì)粒pK152。此外，用AppliedBiosystems公司的“391DNA合成儀”合成了如下的寡核苷酸Hir15'-CCCGAAACCGCAGTCTCACCAGGAAGGCGAATT-3'Hir25'-CGAATTCGCCTTCCTGGTGAGACTGCGGTTTCGGGGTAC-3'Hir55'-GATCCGAAGGTGAAAAGAACCAGTGCGTTACTGGCGAAGGTAC-3'Hir65'-CTTCGCCAGTAACGCACTGGTTCTTTTCACCTTCG-3'Hir135'-CCCGAAACCGCAGTCTCATAACGAGGGCGACTT-3'Hir145'-CGAAGTCGCCCTCGTTATGAGACTGCGGTTTCGGGGTAC-3'Hir155'-CCCGAAACCGCAGTCTCATCAGGAGGCTGACTT-3'Hir165'-CGAAGTCAGCCTCCTGATGAGACTGCGGTTTCGGGGTAC-3'
實(shí)施例2a水蛭素變體13(Ala1，Glu33，Gln52，Glu53，Glu55)在質(zhì)粒pSCH13中的構(gòu)建質(zhì)粒pK152的DNA與酶BamHI和KpnI反應(yīng)，得到兩個(gè)片段，用凝膠電泳分離開。分出較大的片段并于T4DNA連接酶反應(yīng)中與Hir5和Hir6預(yù)先雜交成雙股的寡核苷酸序列進(jìn)行連接反應(yīng)。用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞Mc1061。與此相平行的轉(zhuǎn)化是pK153載體片段進(jìn)行自我連接并也進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將該轉(zhuǎn)化混合物涂布于含有20mg/l氨芐青霉素的NA平板上，37℃保溫過夜。次晨對(duì)實(shí)驗(yàn)作評(píng)價(jià)。當(dāng)連接于寡核苷酸片段產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子比自我連接作用至少多100倍時(shí)，該克隆化可認(rèn)為是有希望的。然后從克隆化反應(yīng)得到的轉(zhuǎn)化子中分離出質(zhì)粒DNA，并用限制性分析加以鑒定。將含有水蛭素肽序列32-65并且用Glu55代替了Asp55的表明有正確的限制性圖譜的BamHI/HindⅢ的DNA片段由質(zhì)粒DNA中分離出。該片段連接到用BamHI/HindⅢ切開的載體pCM7053上，所獲得的重組質(zhì)粒是pCM7053Var3。該質(zhì)粒含有的修飾的水蛭素的DNA序列，其55位的氨基酸為Glu。
由質(zhì)粒pK152得到的DNA用限制性內(nèi)切酶KpnI和BstbI切割。用凝膠電泳分離后，分離出較大的載體片段。將該片段和預(yù)先雜交成雙股的HirI和HirⅡ的雙股寡核苷酸片段連接。按照上述的方法，產(chǎn)生了質(zhì)粒pK153的一個(gè)衍生物，稱作變體1。由該質(zhì)粒上分離出BamHI/HindⅢ片段并連接到用BamHI/HindⅢ切開的載體pCM7053上。結(jié)果為質(zhì)粒pCM7053Varl，它編碼在52，53和55位上變成Gln、Glu和Glu的經(jīng)修飾的水蛭素。該質(zhì)粒與pCM7053的區(qū)別還在于有限制性酶EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)。
質(zhì)粒pCM7053Varl和pCM7053Var3的DNA用KpnI和MluI進(jìn)行雙酶切并用凝膠電泳加以分離。每一種情況都產(chǎn)生兩個(gè)片段，從pCM7053Var1的酶切片段中分離出較大的一個(gè)，而從pCM7053Var3酶切物中分離出較小的片段。這兩個(gè)片段再重新連接成新的質(zhì)粒pVar13，它在大腸桿菌Mc1061中得到表達(dá)。按實(shí)施例5所述方法分離出水蛭素并用氨基酸分析進(jìn)行鑒定。質(zhì)粒pVar13構(gòu)建的正確性也由預(yù)期的氨基酸組成所證實(shí)。
將質(zhì)粒pCMT203和pVar13的DNA用限制性內(nèi)切酶MluI和PvuI進(jìn)行酶切，并經(jīng)凝膠電泳分離。每種質(zhì)粒都產(chǎn)生兩個(gè)片段，均分離出較大的片段。將這兩個(gè)較大的片段進(jìn)行連接得到質(zhì)粒pSCH13。其結(jié)構(gòu)用限制性酶分析和DNA順序分析得到證實(shí)。將這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12分泌突變體中，后者敘述于歐洲專利申請(qǐng)EP-A448093。
實(shí)施例2b水蛭素變體83(Ala1，Glu33，Glu53)在質(zhì)粒pSCH83中的構(gòu)建將實(shí)施例2α敘述的KpnI/BstbI載體片段與Hir13和Hir14預(yù)先雜交成雙股的寡核苷酸片段連接，產(chǎn)生一種稱作變體8的質(zhì)粒。按實(shí)施例2α所述，由此質(zhì)粒分離出BamHI/HindⅢ片段，并引入到用BamHI/HindⅢ切開的載體pCM7053上，產(chǎn)生了pCMVar8，并且從中分離出較小的KpnI/MluI片段，并將其連接到由質(zhì)粒pCMVar3得到的大的KpnI/MluI片段上。獲得質(zhì)粒pVar83，它能在大腸桿菌Mc1061菌株中表達(dá)。從表達(dá)產(chǎn)物中分離出水蛭素衍生物并且作氨基酸分析后，確證該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。如實(shí)施例2α所述從該質(zhì)粒分離出MluI/PvuI片段，并將其連接到由質(zhì)粒pCMT203得到的大的MluI/PvuI載體片段上，得到質(zhì)粒pSCH83，將此質(zhì)粒引入到上述的分泌突變體中。
實(shí)施例2c水蛭素突變體93(Ala1，Glu33，Gln52，Glu53，Ala54)在質(zhì)粒pSCH93中的構(gòu)建質(zhì)粒pSCH93的構(gòu)建按實(shí)施例2b類似的方法進(jìn)行。在第一次克隆步驟時(shí)，需要將BstbI/KpnIpK152片段與雜交成雙股的寡核苷酸Hir15和Hir16進(jìn)行連接反應(yīng)，生成的質(zhì)粒稱作變體9。
實(shí)施例3質(zhì)粒pSCH13，pSCH83和pSCH93的表達(dá)如在歐洲專利申請(qǐng)EP-A448093中所述，質(zhì)粒pSCH13，pSCH83和pSCH93的表達(dá)既可用搖瓶法，也可以10升的規(guī)模進(jìn)行。該專利申請(qǐng)中所述的菌株或變種應(yīng)用于此處。以立方米規(guī)模表達(dá)培養(yǎng)物時(shí)所用的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)條件和發(fā)酵時(shí)間，可根據(jù)它們的性質(zhì)而變動(dòng)，這是本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員皆知的。
實(shí)施例4水蛭素變體13和93在面包酵母中的克隆和表達(dá)在歐洲專利申請(qǐng)EP-A324712中敘述了人工合成的水蛭素，它改變了天然序列，其N-末端氨基酸為亮氨酸。這種水蛭素還可進(jìn)一步優(yōu)化，即在前面的修飾變體13和93時(shí)，在亮氨酸之后從第二個(gè)氨基酸進(jìn)行改換。在這一點(diǎn)上，要按照本申請(qǐng)中所述的載體和菌株實(shí)施例的方法進(jìn)行。本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員都了解，也可以應(yīng)用能分泌水蛭素或其變體的各種其它的酵母表達(dá)系統(tǒng)。
將在歐洲專利申請(qǐng)EP-A324712中所述的克隆載體7用BamHI和HindⅢ切開，并在每一種情況下，連接在從質(zhì)粒pSCH13或pSCH93分離出的BamHI/HindⅢ片段上，該片段構(gòu)成了水蛭素氨基酸序列的羧基末端部分，它在每種克隆載體中已失去。產(chǎn)生的質(zhì)粒p713和p793用限制性分析加以鑒定。然后從這些質(zhì)粒的正確DNA中分離出EcoRI/HindⅢ片段。用Klenow聚合酶補(bǔ)平突出末端。將這種方法制備的兩種片段分別連接到如歐洲專利申請(qǐng)EP-A324712的實(shí)施例1所敘述的質(zhì)粒yEP13中的平末端載體片段上。產(chǎn)生的質(zhì)粒其中兩個(gè)為pHABVar131和pHABVar132，它們的區(qū)別只是插入片段的方向不同，并且均編碼具有氨基酸為L(zhǎng)eu1，Glu33，Gln52，Glu53和Glu55的水蛭素衍生物，產(chǎn)生的質(zhì)粒另外兩個(gè)為pH ABVar931和pHABVar932，它們的區(qū)別也只是插入片段的方向不同，均編碼具有氨基酸為L(zhǎng)eu1，Glu33，Gln52，Glu53和Ala54的水蛭素衍生物。這些質(zhì)粒按實(shí)施例的方法轉(zhuǎn)化到該專利申請(qǐng)所敘述的酵母菌株中。水蛭素衍生物的表達(dá)和產(chǎn)物純化按照該專利申請(qǐng)所述的方法進(jìn)行。皆知，在用例如微孔Pellicon超過濾系統(tǒng)純化時(shí)，可以免除離心和后來的吸附層析。這里所應(yīng)用的方法是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的，以立方米規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，會(huì)需用另外的發(fā)酵時(shí)間，培養(yǎng)條件和處理步驟。這是本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員皆知的。
實(shí)施例5〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，G55〕脫硫水蛭素的純化通過加入甲酸將每升含有3.6g水蛭素的無細(xì)胞培養(yǎng)物上清液調(diào)節(jié)到pH3。于室溫1h后進(jìn)行CEPA離心分離生成的沉淀。上清液經(jīng)透析過濾使其電導(dǎo)率降低到＜2.5mS/cm，然后于Fractogel-EMD-SO-3，Lichroprep
RP18和Q-瓊脂糖上進(jìn)行連續(xù)層析，制備出高純度的產(chǎn)品。
由Q-瓊脂糖的洗脫液經(jīng)聯(lián)合的超過濾/透析過濾，可除去剩余的鹽和緩沖液的成份，之后經(jīng)冷凍干燥可以得到干燥的產(chǎn)物。
實(shí)施例6〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，Ala54〕-脫硫水蛭素的純化發(fā)酵畢，在細(xì)胞物質(zhì)的存在下將培養(yǎng)溶液酸化至pH3，用分離器將生物量與生成的沉淀分開。將5%(W/V)的DiaionHP20加到澄清的上清液中，使水蛭素定量的吸附，經(jīng)過濾方法降去母液后，用水洗滌樹脂一次。將30%濃度的異丙醇酸化到pH3，并用其使產(chǎn)物解吸附。澄清的洗脫液再按實(shí)施例5進(jìn)行處理，先用陽(yáng)離子交換層析，再經(jīng)冷凍干燥得到高純度的干燥產(chǎn)物。
實(shí)施例7被優(yōu)化的異水蛭素的比較Ki值的測(cè)定Ki值的測(cè)定按照Stone和Hofsteenge的方法(Biochemistry25，4622-4628頁(yè)，1986)0.2ml的1.25mMD-HHT-Gly-Arg-pNa的溶液于25℃下與1.7ml0.1Mtris，0.2MNaCl和0.1%(V/V)TritonX-100(pH8.3)和0.1ml的待測(cè)異水蛭素于145mMNaCl的溶液混合平衡。加入0.05ml凝血酶溶液使結(jié)合作用開始。在10-20分鐘內(nèi)記錄于405nm處的吸收。
該反應(yīng)遵循如下的方程式〔P〕＝V＊3t+(VO-VS)(1-e-k·t)K+d式中〔P〕＝產(chǎn)物的濃度(硝基苯胺)VO＝開始的速率VS＝平衡態(tài)的反應(yīng)速率d＝t為0時(shí)的〔P〕用非線性回歸計(jì)算速率常數(shù)k按照公式 k＝k＊on〔l〕/(1+S/Km)+koff以不同的抑制劑濃度外推k到〔l〕＝0，得到速率常數(shù)kon和koff，因而Ki＝koff/kon。
實(shí)施例8優(yōu)化的〔Ala1，Thr2〕脫硫水蛭素類似物對(duì)恒河猴的部分凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)的影響體重為6.5±1.6kg的雄性恒河獨(dú)居按0.5mg/kg劑量靜脈注射〔Leu1，Thr2〕脫硫水蛭素，〔Ala1，Thr2〕脫硫水蛭素，〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，Glu55〕脫硫水蛭素和〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，Ala54〕脫硫水蛭素。在一定的間隔采集血樣以測(cè)定凝血參數(shù)。部分凝血酶原激酶時(shí)間(PTT)的測(cè)定方法如下(圖2)0.1ml含檸檬酸鹽的血漿和由人血小板制取的0.1ml的PTT試劑(Behring)于預(yù)先加溫到37℃的試管中混合，并于37℃維持2分鐘整，以使內(nèi)在的凝血系統(tǒng)完全激活。然后，加入0.1ml0.025M氯化鈣溶液，于凝血儀上測(cè)定凝血作用(按Schnitger和Gross法)。
實(shí)施例9〔Ala1，Thr2〕脫硫水蛭素類似物于pH7和60℃下20小時(shí)的穩(wěn)定性待測(cè)化合物溶解于20mM NaP(pH7)，300mM NaCl，使?jié)舛葹?.5mg/ml，于60℃保溫20h。于時(shí)間t＝0和t＝20h采集樣品，用反相HPLC(Nucleosil
)和陰離子交換層析(Mono Q
)進(jìn)行分析。計(jì)算新生成副產(chǎn)物的含量。
實(shí)施例10〔Ala1，Thr2〕脫硫水蛭素類似物于pH6.5和60℃的穩(wěn)定性純化的異水蛭素如凍干劑，溶解于水，濃度為1mg/ml，用1M Na2HPO4調(diào)節(jié)至pH6.5。經(jīng)過濾滅菌后，溶液在避光下于振蕩水浴中60℃保溫。于時(shí)間t＝0，5，24，48，72和96h采樣，用反相HPLC(Nucleosil
)和離子交換層析(Mono Q
)分析其中副產(chǎn)物的含量。于時(shí)間t＝x的純度以相對(duì)于t＝0的純度表示，用每種情況下兩種分析系統(tǒng)較差的數(shù)值作為基準(zhǔn)(圖4)。
實(shí)施例11〔Ala1，Thr2〕脫硫水蛭素類似物于pH4和60℃的穩(wěn)定性純化的異水蛭素，如凍干劑，溶解于水，濃度為1mg/ml，用1M乙酸調(diào)節(jié)至pH4。按實(shí)施例10進(jìn)行保溫和分析(圖3)。
權(quán)利要求
1.具有改善穩(wěn)定性和如下氨基酸的異水蛭素的制備方法，33位Glu，52位Gln，Glu，Asn或Asp，53位Glu，54位Gly或Ala，55位Asp或Glu，該方法包括以下步驟a)制備編碼該異水蛭素的載體；b)在適宜的宿主細(xì)胞中表達(dá)該載體；c)分離表達(dá)的異水蛭素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所用的載體編碼具有下式的異水蛭素10A1-A2-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys20Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-30 40Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-B-Gly-GLu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-50 52 53 54 55Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-C-D-E-F60式中A1是Leu，Ala，Ile或Val，A2是Thr或Val，B是GluC是Gln或Glu，D是Glu，E是Gly或Ala，F(xiàn)是Asp或Glu。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所用的載體編碼1位是Ala或Leu，2位是Thr，33位是Glu，52位是Gln，53位是Glu，54位是Gly和55位是Glu的異水蛭素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所用的載體編碼1位是Ala或Leu，3位是Glu，52位是Gln，53位是Glu，54位是Ala和55位是Asp的異水蛭素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4的異水蛭素的制備方法，其中在pH≤4時(shí)經(jīng)酸沉淀法分離出宿主細(xì)胞的蛋白，然后經(jīng)連續(xù)的層析純化從培養(yǎng)基中制備高純度的產(chǎn)物，層析純化至少包括一種陽(yáng)離子交換劑和一種反相層析法。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有改善穩(wěn)定性和在33，52，53，54與55位有不同氨基酸的異水蛭毒，以及用遺傳工程制備這類異水蛭素的方法，在酵母菌或大腸桿菌中獲得表達(dá)的產(chǎn)物，經(jīng)離子交換和反相層析法得到高純度的異水蛭素。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1073978SQ9211414
公開日1993年7月7日 申請(qǐng)日期1992年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1991年12月7日
發(fā)明者P·科勞斯, P·哈伯曼, D·特皮爾, W·厄爾默, G·施密德 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司