專利名稱：：白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶的異源表達(dá)和在顆粒淀粉水解中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來自白曲霉(Aspergilluskawachi)菌株的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(Acid-StableAlphaAmylase)(asAA)，其具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有GSH活性的asAA在絲狀真菌宿主細(xì)胞中、特別是木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞中的異源表達(dá)以及具有GSH活性的asAA在組合物中的應(yīng)用，所述組合物任選地包括葡糖淀粉酶，以增強(qiáng)淀粉水解和醇產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
：葡糖淀粉酶(glucoamylase)，特別是具有顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性的葡糖淀粉酶是重要的工業(yè)酶，用于生產(chǎn)產(chǎn)品例如有機(jī)酸(即乳酸)、氨基酸(即谷氨酸)、醇(即乙醇)和來自谷物(grains)和谷類(cereals)的淀粉底物的其它化合物。在微生物發(fā)酵期間，尤其是在同步糖化發(fā)酵(SSF)期間，當(dāng)顆粒淀粉底物被用作碳料時，降低發(fā)酵中的殘留淀粉量將是有利的。本發(fā)明通過提供具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)響應(yīng)這種需求，所述酸穩(wěn)定性α淀粉酶可以與葡糖淀粉酶聯(lián)合應(yīng)用，以增強(qiáng)淀粉水解和醇產(chǎn)量。此外，本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)組合物和方法的益處包括下列中的一個或更多個a)在淀粉水解和終產(chǎn)物生產(chǎn)期間熱能使用的減少；b)對高酶量的需求的降低；c)采用連續(xù)的內(nèi)部葡萄糖供料；d)在發(fā)酵罐中維持相對低的葡萄糖水平，其顯著降低微生物污染的高風(fēng)險和消除由于高濃度游離葡萄糖導(dǎo)致的酵母的分解代謝產(chǎn)物阻遏；e)降低棕色反應(yīng)產(chǎn)物的形成；f)降低或免除在現(xiàn)有技術(shù)噴煮工藝(jetcookingprocess)期間所要求的鈣添加；g)降低在發(fā)酵工藝期間水的使用；h)在發(fā)酵中使用較高的固體含量，其可以導(dǎo)致較高的終產(chǎn)物形成和降低的能耗；i)降低一些副產(chǎn)物的產(chǎn)量水平，例如甘油；和i)含可溶物干酒糟(distillersdrygrainsplussolubles)中降低的殘留淀粉含量。發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)醇的方法，其包括將顆粒淀粉底物與具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)和葡糖淀粉酶(GA)在發(fā)酵步驟中接觸以及在發(fā)酵步驟中產(chǎn)生醇，所述發(fā)酵步驟還包括產(chǎn)乙醇微生物。在一些實(shí)施方式中，從玉米或小麥得到顆粒淀粉底物。在其它實(shí)施方式中，從真菌宿主細(xì)胞中異源多核苷酸的表達(dá)得到具有GSH活性的asAA，所述異源多核苷酸編碼與SEQIDNO3的序列具有至少90％的序列同一性的asAA。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵步驟包括表達(dá)asAA的真菌細(xì)胞，在其它實(shí)施方式中，發(fā)酵步驟包括無細(xì)胞asAA提取物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，由所述方法產(chǎn)生的醇是乙醇，產(chǎn)乙醇微生物是酵母。在另外的實(shí)施方式中，從真菌宿主中異源多核苷酸的表達(dá)生產(chǎn)GA。在另外的其它實(shí)施方式中，從發(fā)酵中回收醇。在第二方面，本發(fā)明涉及真菌宿主細(xì)胞，其包括編碼與SEQIDNO3的序列具有至少90％的序列同一性的具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的異源多核苷酸，在一些實(shí)施方式中，異源多核苷酸編碼與序列SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性的具有GSH活性的asAA。在一些實(shí)施方式中，從真菌宿主中表達(dá)的具有GSH活性的asAA比從天然宿主中獲得的具有GSH活性的asAA的最適pH值低。在一個實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，木霉屬宿主細(xì)胞是里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞。在另一個實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是曲霉屬細(xì)胞。在第三方面，本發(fā)明涉及顆粒淀粉水解酶組合物，其包括具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，其中所述具有GSH活性的asAA與SEQIDNO3的序列具有至少90％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，從真菌宿主細(xì)胞中的異源多核苷酸的表達(dá)獲得asAA。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞是木霉屬或曲霉屬宿主細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，組合物將進(jìn)一步包括葡糖淀粉酶。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶將從曲霉屬或根霉屬(Rhizopus)菌株中獲得。在其它實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶將是具有GSH活性的葡糖淀粉酶以及從曲霉屬、根霉屬或腐質(zhì)霉屬(Humicola)的菌株獲得。在其它實(shí)施方式中，asAA和葡糖淀粉酶都將在真菌宿主中被表達(dá)，所述真菌宿主含有表達(dá)具有GSH活性的asAA和葡糖淀粉酶的異源多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，真菌宿主菌株將是相同的，在其它實(shí)施方式中，真菌宿主菌株將是不同的菌株。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及使用本方面的酶組合物水解顆粒淀粉的方法。在第四方面，本發(fā)明涉及增強(qiáng)含有葡糖淀粉酶的組合物的顆粒淀粉水解活性的方法，其包括將具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)加入到包含顆粒淀粉底物和葡糖淀粉酶的組合物中，產(chǎn)生可溶性淀粉水解產(chǎn)物，其中具有GSH活性的asAA具有與SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，并且增溶的淀粉量大于缺乏具有GSH活性的asAA的相應(yīng)組合物。在第五方面，本發(fā)明涉及從谷物底物產(chǎn)生醇、優(yōu)選乙醇的一步法，包括在合適的發(fā)酵條件下、在發(fā)酵培養(yǎng)基中混合下列物質(zhì)(i)來自谷物的顆粒淀粉底物，(ii)具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，和(iii)產(chǎn)乙醇微生物，以獲得包括醇的發(fā)酵組合物。在一個實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA與序列SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性。在另一個實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA從木霉屬宿主中的表達(dá)獲得。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶被加入該步驟。在又一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)此方法獲得的發(fā)酵組合物。在另一個實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明包含的方法所產(chǎn)生的乙醇被回收。在其它實(shí)施方式中，谷物從玉米、小麥、大麥、馬鈴薯、稻、高梁或木薯中得到。在第六方面，本發(fā)明涉及減少含固體干酒糟(distiller’sdriedgainsplussolids，DDGS)中的殘留淀粉量的方法，包括通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生醇、蒸餾該醇獲得發(fā)酵殘留物，和處理發(fā)酵殘留物以獲得含可溶物干酒糟。附圖簡述圖1提供了編碼天然白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶的基因組DNA序列，其被稱為asaA(SEQIDNO1)。在八個推知的內(nèi)含子下劃線。圖2提供了白曲霉(A.kawachi)酸穩(wěn)定性α淀粉酶(SEQIDNO4)的信號序列(SEQIDNO2)和成熟氨基酸序列(SEQIDNO3)(AsaA)。推知的信號序列(氨基酸l-21)加下劃線并設(shè)為粗體。圖3A-D提供了質(zhì)粒pTrex3g_Akalpha(圖4)的完整核酸序列(SEQIDNO5)，10990bp。圖4提供了pTrex3g_Akalpha的圖譜，pTrex3g_Akalpha被用于表達(dá)編碼AsaA(白曲霉asAA)的核酸并且其含有位于真菌表達(dá)載體側(cè)翼的EcoRI位點(diǎn)，其中a)cbhI啟動子是里氏木霉纖維二糖水解酶啟動子；b)asaA是編碼SEQIDNO4的酸穩(wěn)定性α淀粉酶的白曲霉多核苷酸；c)cbhI終止子是里氏木霉纖維二糖水解酶終止子；d)amdS是構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶營養(yǎng)標(biāo)記基因；和e)attB是用于重組的Gateway克隆系統(tǒng)(Invitrogen)入噬菌體位點(diǎn)。圖5提供了SDS-PAGE凝膠，其顯示了在里氏木霉克隆的代表性發(fā)酵試驗(yàn)中來自里氏木霉的asaA表達(dá)，如實(shí)施例5所描述。泳道1代表標(biāo)準(zhǔn)品SeeBlue+2標(biāo)記物；泳道2代表80小時后里氏木霉表達(dá)的AsaA；泳道3代表162小時后里氏木霉表達(dá)的AsaA和泳道4代表在162小時的里氏木霉宿主細(xì)胞對照，其中所述宿主細(xì)胞未被asaA轉(zhuǎn)化。AsaA蛋白質(zhì)條帶在約90kDa被清楚地觀察到，并且該條帶在宿主菌株對照中不存在。圖6以殘留活性百分比說明了天然白曲霉(nAk-AsaA)和在里氏木霉宿主中表達(dá)的白曲霉(rAk-AsaA)(SEQIDNO3)的pH穩(wěn)定性，如實(shí)施例6所述。圖7說明了在pH5.0下，隨著時間的過去，從具有葡糖淀粉酶(0.5GAU/gDISTILLASE)和α淀粉酶的玉米粉醪液發(fā)酵得到的乙醇(EtOH)產(chǎn)量百分比(v/v)，其中AKAA表示Tr-AsaA(在里氏木霉中表達(dá)的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶)；LT75表示SPEZYMELT75α淀粉酶；FRED表示SPEZYMEFRED；ETHYL表示SPEZYMEETHYL；FA表示CLARASE以及DISTILLASE是對照。參考實(shí)施例8。圖8說明了在pH5.0下，與純化的DISTILLASE(GA)、純化的AKAA(在里氏木霉中表達(dá)的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶)以及AkAA和GA的組合溫育4小時之后釋放的、顆粒淀粉降解成的葡萄糖。參考實(shí)施例11。圖9說明了顆粒玉米淀粉的SEMs，所述顆粒玉米淀粉與圖8所描述的酶溫育純化的DISTILLASE(GA)、純化的AkAA(在里氏木霉中表達(dá)的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶)以及AkAA和GA的組合。圖10A概括了在發(fā)酵72小時測量的不同玉米粉固體(％ds)下以％(v/v)表示的最終乙醇水平。圖10B說明了對于每一玉米醪液固體(cornmashsolids)(％ds)，使用AkAA的乙醇增加百分比，其相對于醪液固體(％ds)被作圖。圖11說明了在72小時后，與0.5GAU/g和AkAA(0.0SSU/g或1.5SSU/g)發(fā)酵的不同的玉米粉固體所產(chǎn)生的殘留淀粉的百分?jǐn)?shù)，如在實(shí)施例12中進(jìn)一步解釋。圖12是示意圖，其說明了本發(fā)明的一個實(shí)施方式。該實(shí)施方式包括，在包括在25-40℃的溫度下發(fā)酵2-100小時的條件下，將顆粒淀粉底物與葡糖淀粉酶、asAA和微生物在反應(yīng)器中混合，使得在單一的步驟中發(fā)酵。發(fā)酵中所產(chǎn)生的混合物被分離?？梢詮姆蛛x中回收醇，并且可以產(chǎn)生乙醇。此外，可以回收未發(fā)酵的固體和水。未發(fā)酵固體和水的混合物包括殘留的淀粉、釜餾物、蛋白質(zhì)和微生物，其可以被進(jìn)一步處理，產(chǎn)生例如DDG和DDGS的產(chǎn)物或者所述混合物的成分(單獨(dú)或合并)可以被再循環(huán)回反應(yīng)器中進(jìn)一步發(fā)酵。發(fā)明詳述在一些方面，本發(fā)明借助遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域中使用的常規(guī)技術(shù)和方法。下面的資源包括根據(jù)本發(fā)明有用的一般方法的描述Sambrooketal.，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL(2ndEd.，1989)；Kreigler，GENETRANSFERANDEXPRESSION；ALABORATORYMANUAL(1990)以及Ausubeletal.，Eds.CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(1994)。這些普通參考資料提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。然而，本發(fā)明不意欲于被限制為所述的任何具體方法、方案和試劑，因?yàn)檫@些可以變化。除非本文中另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。Singleton，etal.，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2DED.，JohnWileyandSons，NewYork(1994)和Hale&Markham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中應(yīng)用的許多術(shù)語的普通詞典。盡管與本文中所述的那些方法和材料類似或等價的任何方法和材料可以在本發(fā)明的實(shí)踐和測試中使用，還是描述了優(yōu)選的方法和材料?，F(xiàn)在，使用下面的定義和例子，僅通過參考的方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本文中提及的所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列，被明確地引入作為參考。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)。除非另外指出，分別地，核酸以5′到3′方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向從左到右書寫。本文所提供的標(biāo)題不是對本發(fā)明的不同方面和實(shí)施方式的限制，而是整體上參考說明書對其進(jìn)行理解。A.定義如本文中所使用，術(shù)語“淀粉(starch)”是指由植物復(fù)合多糖碳水化合物組成的任何物質(zhì)，由具有式(C6H10O5)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其中X可以是任何數(shù)。具體而言，該術(shù)語是指任何植物型物質(zhì)，包括但不限于谷物、草、莖和根，更具體地，是小麥、大麥、玉米、黑麥、稻、高梁、麩、木薯(cassava)、黍、馬鈴薯、甘薯和木薯(tapioca)。術(shù)語“顆粒淀粉(granularstarch)”是指生(未煮過的)淀粉，例如未經(jīng)過糊化的顆粒淀粉。術(shù)語“顆粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))酶”或“具有顆粒淀粉水解(GSH)活性”是指具有水解顆粒形式的淀粉的能力的酶。術(shù)語“α淀粉酶(alphaamylase)(例如E.C.類別3.2.1.1)”是指催化α-1，4-糖苷鍵水解的酶。這些酶還被描述為那些在含1，4-α連接的D-葡萄糖單元的多糖中實(shí)施1，4-α-D-糖苷鍵的外切型或內(nèi)切型水解作用的酶。用于描述這些酶的另一個術(shù)語是“糖原酶”。示例性酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。術(shù)語“酸穩(wěn)定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(asAA))”是指在pH3.0到7.0的pH范圍內(nèi)有活性的α淀粉酶，優(yōu)選pH3.5到6.0。術(shù)語“葡糖淀粉酶(glucoamylase(asAA))”是指淀粉葡糖苷酶類的酶(例如，E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些是外切作用酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原端釋放葡糖基。該酶還水解α-1，6鍵和α-1，3鍵，盡管速率比α-1，4鍵低得多。術(shù)語“糖基化(glycosylation)”是指通過加入糖部分的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾，其中糖是N-連接或O-連接的，形成糖蛋白。糖蛋白的N-連接糖部分由糖苷鍵連接到天冬酰胺殘基的β-酰胺氮上。O-連接糖是由糖苷鍵通過絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基連接到蛋白質(zhì)。當(dāng)在有關(guān)細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體中使用時，術(shù)語“重組體(recombinant)”指所述細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白質(zhì)或通過改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或者是指細(xì)胞是來自被如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞的天然(非重組)形式內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的基因或表達(dá)否則將異常表達(dá)、過低表達(dá)或完全不表達(dá)的天然基因。術(shù)語“蛋白質(zhì)(protein)”和“多肽(polypeptide)”在本文中可以互換使用。常規(guī)的氨基酸殘基單字母代碼和三字母代碼在本文中被使用?！靶盘栃蛄?signalsequence)”指連接到蛋白質(zhì)的N端部分的氨基酸序列，其促進(jìn)成熟形式的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外。信號肽的定義是功能性定義。胞外蛋白的成熟形式缺少信號序列，其在分泌過程中被切割。術(shù)語“天然酸穩(wěn)定性α淀粉酶(nativeacid-stablealphaamylase(n-asAA))”是指從asAA內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)生的asAA。例如，術(shù)語“n-asAA”是指來自白曲霉的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(即，SEQIDNO3)的內(nèi)源性表達(dá)。術(shù)語“重組酸穩(wěn)定性α淀粉酶(recominantacid-stablealphaamylase(r-asAA))”、“重組表達(dá)的asAA”和“重組產(chǎn)生的asAA”是指成熟asAA蛋白質(zhì)序列，其在宿主細(xì)胞中從異源多核苷酸的表達(dá)中產(chǎn)生。例如，術(shù)語“r-asaA”是指白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(即SEQIDNO3)在已導(dǎo)入編碼asaA的多核苷酸的宿主中被表達(dá)和產(chǎn)生。r-asAA的成熟蛋白質(zhì)序列不包括信號序列?！盎?gene)”是指DNA片段，其與產(chǎn)生多肽有關(guān)并且包括編碼區(qū)前和編碼區(qū)后的區(qū)域以及單獨(dú)的編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。術(shù)語“核酸(nucleicacid)”包含單鏈或雙鏈DNA、RNA，及其化學(xué)修飾。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用。因?yàn)檫z傳密碼是簡并的，一個以上的密碼子可以用于編碼一個特定的氨基酸，并且本發(fā)明包括編碼特定氨基酸序列的多核苷酸?！拜d體(vector)”是指被設(shè)計用來將核酸引入到一種或更多種細(xì)胞類型內(nèi)的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒及類似載體。本文中所使用的“表達(dá)載體(expressionvector)”是指DNA構(gòu)建物，其包括可操縱地連接到合適的調(diào)控序列的DNA序列，所述調(diào)控序列能夠引起所述DNA在合適宿主中的表達(dá)。這樣的調(diào)控序列可以包括引起轉(zhuǎn)錄的啟動子、調(diào)控轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子和調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止和翻譯終止的序列?！皢幼?promoter)”是調(diào)節(jié)序列，其參與結(jié)合RNA聚合酶以起始基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。本發(fā)明使用的優(yōu)選的啟動子是里氏木霉cbhl，其是誘導(dǎo)型啟動子?！疤幱谵D(zhuǎn)錄調(diào)控下(undertranscriptionalcontrol)”是本領(lǐng)域中被充分理解的術(shù)語，其是指多核苷酸—通常是DNA序列的轉(zhuǎn)錄，取決于其被可操縱地連接到有助于轉(zhuǎn)錄起始或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的元件。“處于翻譯調(diào)控下(undertranlationalcontrol)”是本領(lǐng)域中被充分理解的術(shù)語，其是指發(fā)生在mRNA形成之后的調(diào)節(jié)過程。如本文中在描述蛋白質(zhì)和編碼它們的基因時所使用，關(guān)于基因的術(shù)語是斜體字，(例如，編碼asaA(白曲霉asAA)的基因可以被表示為asaA)。關(guān)于蛋白質(zhì)的術(shù)語通常不是斜體并且第一個字母一般是大寫的，(例如，由asaA基因編碼的蛋白質(zhì)可以被表示為AsaA或asaA)。術(shù)語“源自(derived)”包括術(shù)語“起源自(originatedfrom)”、“得到(obtained)”或“得自(obtainedfrom)”、和“分離自(isolatedfrom)”。術(shù)語“可操縱地連接(operablylinked)”是指并列關(guān)系，其中多種元件被排列，使得它們功能性相關(guān)。例如，如果啟動子調(diào)控編碼序列的轉(zhuǎn)錄，該啟動子被可操縱地連接到該編碼序列。術(shù)語“選擇性標(biāo)記(seletivemarker)”是指能夠在宿主中表達(dá)的基因，其使得容易選擇那些含有被導(dǎo)入的核酸或載體的宿主。選擇性標(biāo)記的例子包括但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博萊霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細(xì)胞代謝優(yōu)勢例如營養(yǎng)優(yōu)勢的基因。多核苷酸或多肽具有與另一條序列某一百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性是指，當(dāng)比對時，在比較兩條序列中該百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。該比對和同源性或同一性百分比可以使用本領(lǐng)域中已知的任何合適軟件程序被確定，例如在CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubeletal.(eds)1987，附錄30，7.7.18部分)中描述的那些程序。優(yōu)選的程序包括GCGPileup程序、FASTA(Pearsonetal.(1988)Proc.Natl，Acad.SciUSA852444-2448)和BLAST(BLASTManual，Altschuletal.，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，NatlLib.Med.(NCIBNLMNIH)，Bethesda，MD，和Altschuletal.，1997)NAR253389-3402)。另一個優(yōu)選的比對程序是ALIGNPlus(ScientificandEducationalSoftware，PA)，優(yōu)選使用默認(rèn)參數(shù)。發(fā)現(xiàn)有用的另一個序列軟件程序是TFASTADataSearchingProgram，其在SequenceSoftwarePackageVersion6.0(GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin，Madison，WI)中可得到。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明包含的序列還由在嚴(yán)格的雜交條件下與示例性的asaA序列(例如SEQIDNO1)雜交的能力所定義。當(dāng)單鏈形式的核酸在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度條件下能與另一條核酸退火，該核酸可以與另一核酸序列雜交。雜交和洗滌條件在本領(lǐng)域中是熟知的(參見，例如Sambrook(1989)supra，特別是第9和11章)。在一些實(shí)施方式中，嚴(yán)格條件相當(dāng)于65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS。“宿主菌株(hoststrain)”或“宿主細(xì)胞(hostcell)”是指含有編碼根據(jù)本發(fā)明的顆粒淀粉水解酶的多核苷酸的表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適的宿主。特別地，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，“宿主細(xì)胞”是指從絲狀真菌菌株、特別是木霉屬某種或曲霉屬某利的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞和原生質(zhì)體。術(shù)語“絲狀真菌(filamentousfungi)”是指所有絲狀形式的真菌亞門(subdivisionEumycotina)(參見Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY，Wiley，NewYork)。這些真菌的特征在于營養(yǎng)菌絲體具有由幾丁質(zhì)、纖維素和其它復(fù)合多糖組成的細(xì)胞壁。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)上、生理學(xué)上和遺傳學(xué)上不同于酵母。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長并且碳代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親本細(xì)胞可以是但不限于下列種的細(xì)胞木霉屬(例如里氏木霉(以前分類為長梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)，目前也被稱為紅褐肉座菌(Hypocreajecorina))、綠色木霉(Trichodermaviride)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))；青霉屬某種(Penicilliumsp.)、腐質(zhì)霉屬某種(Humicolasp.)(例如特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)和灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea))；金孢菌屬某種(Chryrysosporiumsp.)(例如，C.lucknowense)、膠霉屬某種(Gliocladiumsp.)、曲霉屬某種(Aspergillussp.)(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori))、鐮孢菌屬某種(Fusariumsp.)、脈孢菌屬某種(Neurosporasp.)、肉座菌屬某種(Hypocreasp.)和裸孢菌屬某種(Emericellasp.)(還參見Innisetal.，(1985)Sci.22821-26)。如本文中所使用，術(shù)語“木霉屬(Trichoderma)”或“木霉屬某種(Trichodermasp.)”是指以前或當(dāng)前被歸類為木霉屬的任何真菌屬。術(shù)語“培養(yǎng)(culturing)”是指在合適的條件下在液體或固體培養(yǎng)基中生長一群微生物細(xì)胞。在一個實(shí)施方式中，培養(yǎng)是指含顆粒淀粉的淀粉底物發(fā)酵性生物轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物(通常在容器或反應(yīng)器中)。發(fā)酵是通過微生物對有機(jī)物質(zhì)的酶分解和無氧分解，產(chǎn)生較簡單的有機(jī)化合物。盡管發(fā)酵在無氧條件下發(fā)生，并不意圖使該術(shù)語僅受限于嚴(yán)格的無氧條件，正如發(fā)酵也可以在氧存在的情況下發(fā)生。短語“同步糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandfermentation，SSF)”是指產(chǎn)生生物化學(xué)物質(zhì)中的過程，其中微生物例如乙醇生產(chǎn)微生物和至少一種酶例如asAA處于同一個處理步驟中。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，SSF是指在同一個反應(yīng)器中，同時將顆粒淀粉底物水解成包括葡萄糖的糖類和將糖類發(fā)酵成醇。術(shù)語“接觸(contacting)”是指使各個酶(一種或多種)足夠近地接近各自的底物，以使得該酶(一種或多種)能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化成終產(chǎn)物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，酶與各自底物的混合溶液可以實(shí)現(xiàn)接觸。術(shù)語“酶促轉(zhuǎn)化(enzymaticconversion)”通常是指底物通過酶作用的修飾。本文中所使用的術(shù)語還指顆粒淀粉底物通過酶作用的修飾。正如本文中所使用，術(shù)語“糖化(saccharification)”是指淀粉被酶促轉(zhuǎn)化成葡萄糖。術(shù)語“糊化(gelatinization)”是指通過蒸煮溶解淀粉分子，形成粘性懸浮液。術(shù)語“液化(liquefaction)”是指在淀粉轉(zhuǎn)化中的階段，其中糊化的淀粉被水解，得到低分子量的可溶性糊精。術(shù)語“聚合度(degreeofpolymerization(DP))”是指在給定的糖中吡喃型葡萄糖酐單元(anhydroglucopyranoseunit)的數(shù)目。DPI的例子是單糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，例如麥芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合度大于3的聚合物。術(shù)語“終產(chǎn)物(end-product)”或“期望終產(chǎn)物(desiredend-product)”是指從顆粒淀粉底物酶促轉(zhuǎn)化的任何碳源來源的分子產(chǎn)物。如本文中所使用，術(shù)語“干固體含量(drysolidscontent(ds))”是指基于干重以百分比(％)計的漿體中的總固體。術(shù)語“漿體(slurry)”是指含有不溶性固體的含水混合物。術(shù)語“殘留淀粉(residualstarch)”是指在含淀粉底物發(fā)酵之后組合物中剩余的殘余淀粉(可溶性的或不溶性的)。如本文中所使用，術(shù)語“一個再循環(huán)步驟(arecyclingstep)”是指醪液組分(mashcomponents)的再循環(huán)，所述醪液組分可以包括殘留淀粉、酶和/或微生物，以發(fā)酵含顆粒淀粉的底物。術(shù)語“醪液(mash)”是指在水中的可發(fā)酵碳源(碳水化合物)的混合物，其被用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，例如醇。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語“發(fā)酵醪(beer)”和“醪液”可以被互換使用。術(shù)語“釜餾物(stillage)”是指未發(fā)酵的固體和水的混合物，其是將醇從發(fā)酵醪液除去后的殘余物。術(shù)語“干酒糟(distillersdriedgrain(DDG))”和“含可溶物干酒糟(distillersdriedgrainwithsolubles(DDSG))”是指谷物發(fā)酵的有用的副產(chǎn)物。如本文中所使用，“產(chǎn)乙醇微生物(ethanologenicmicroorganisms)”是指具有將糖或寡糖轉(zhuǎn)化成乙醇的能力的微生物。產(chǎn)乙醇微生物依靠它們表達(dá)一種或更多種酶的能力而產(chǎn)乙醇，所述酶單獨(dú)或共同將糖轉(zhuǎn)化成乙醇。如本文中所使用，術(shù)語“乙醇生產(chǎn)者(ethanolproducer)”或“乙醇生產(chǎn)微生物(ethanolproducingmicroorganism)”是指能夠從己糖或戊糖中產(chǎn)生乙醇的任何生物體或細(xì)胞。通常，乙醇生產(chǎn)細(xì)胞含有醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。乙醇生產(chǎn)微生物的例子包括真菌微生物例如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)菌株，尤其是釀酒酵母(S.cerevisiae)。與多核苷酸或蛋白質(zhì)有關(guān)的術(shù)語“異源的(heterologous)”是指在宿主細(xì)胞中并非天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，該蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)。意圖是該術(shù)語包括由天然發(fā)生的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。與多核苷酸或蛋白質(zhì)有關(guān)的術(shù)語“內(nèi)源的(endogenous)”是指在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質(zhì)。本文中所使用的術(shù)語“回收”、“分離”和“分開”是指化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸從與其天然結(jié)合的至少一種組分中被移出。如本文中所使用，與細(xì)胞有關(guān)的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)基因的”是指細(xì)胞具有非天然的(例如異源的)核酸序列，所述核酸序列整合進(jìn)所述細(xì)胞的基因組或者作為可以被維持多代的附加體質(zhì)粒。如本文中所使用，術(shù)語“表達(dá)”是指根據(jù)基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過程。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。在將核酸序列插入細(xì)胞的上下文中，術(shù)語“導(dǎo)入”是指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”并且包括將核酸序列引入真核或原核細(xì)胞中，其中所述核酸序列可以被整合入該細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子，或被瞬時表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。如本文中所使用，術(shù)語“比活性(specificactivity)”是酶單位，其定義為，在特定的條件下，每單位時間被酶制劑轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的底物摩爾數(shù)。比活性被表示為單位(U)/毫克蛋白。如本文所使用，術(shù)語“酶單位”是指在規(guī)定的試驗(yàn)條件下每分鐘產(chǎn)生1微摩爾產(chǎn)物的酶量。例如，在一個實(shí)施方式中，術(shù)語“葡糖淀粉酶活性單位”(GAU)被定義為，在60℃和pH4.2的試驗(yàn)條件下每小時從可溶性淀粉底物(4％ds)中產(chǎn)生1g葡萄糖所需的酶量。在另一個實(shí)施方式中，顆粒淀粉水解酶單位(GSHEU)被定義為，在試驗(yàn)條件例如25℃、pH5.0下，每分鐘從顆粒淀粉中產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，GSHE被定義為，在50℃、pH4.5下，每分鐘從顆粒淀粉底物中產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。術(shù)語“產(chǎn)量”是指使用本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的終產(chǎn)物或期望終產(chǎn)物的量。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)量大于使用本領(lǐng)域已知的方法的產(chǎn)量。在一些實(shí)施方式中，該術(shù)語是指終產(chǎn)物的體積，在其它實(shí)施方式中，該術(shù)語是指終產(chǎn)物的濃度?！癆TCC”是指位于Manassas，VA20108的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC；<www.atcc.com>)?！癗RRL”是指AgriculturalResearchServiceCultureCollection，NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch(以前被稱為USDANorthernRegionalResearchLaboratory)，Peoria，ILL.“一個(a)”、“一個(an)”或“這個(the)”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文中另外明確指出。如本文中所使用，術(shù)語“包括(comprising)”和其同源詞以其包含性的意義使用；也就是說，等價于術(shù)語“包含(including)”及其相應(yīng)的同源詞。B.優(yōu)選實(shí)施方式本發(fā)明涉及顆粒淀粉水解酶組合物，其包括具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)和任選含有葡糖淀粉酶，其中asAA與序列SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)顆粒淀粉底物生物轉(zhuǎn)化的期望終產(chǎn)物的方法，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將asAA與顆粒淀粉底物漿體接觸并且顆粒淀粉底物在顆粒淀粉底物沒有糊化和液化的情況下被直接轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物。顆粒淀粉底物本發(fā)明的方法中將被處理的顆粒淀粉底物可以得自任何植物部分，包括莖、谷粒、根和塊莖。特別優(yōu)選的植物來源包括玉米、小麥、黑麥、高梁、稻、黍、大麥、木薯(cassava)、豆科植物例如豆和豌豆、馬鈴薯、甘薯、香蕉和木薯(tapioca)。特別考慮的淀粉底物是玉米淀粉和小麥淀粉。來自谷物的淀粉可以是研磨過的或完整的并且包括玉米實(shí)體，例如玉米粒(kernels)、麩(brans)和/或玉米穗(cobs)。淀粉可以是高度精制的生淀粉(rawstarch)或經(jīng)過精制工藝的原料。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將充分意識到可用于制備在本發(fā)明包含的方法中所使用的顆粒淀粉底物的可得到的方法。這些方法中的一些包括使用錘磨機(jī)和軋制機(jī)對整谷粒進(jìn)行干磨，和濕磨。多種淀粉是商業(yè)上可得的。例如，玉米淀粉可以從Cerestar、Sigma和KatayamaChemicalIndustryCo.(Japan)獲得；小麥淀粉可以從Sigma獲得；甘薯淀粉可以從WakoPureChemicalIndustryCo.(Japan)獲得；馬鈴薯淀粉可以從NakaariChemicalPharmaceuticalCo.(Japan)獲得。多篇參考文獻(xiàn)已經(jīng)報道了在谷粒中發(fā)現(xiàn)的淀粉量，參考TheAlcoholTextbook，3rdEd.K.Jacquesetal.，Eds.1999，NottinghamUniversityPress。例如，玉米含有約60-68％的淀粉；大麥含有約55-65％的淀粉；黍含有約75-80％的淀粉；小麥含有約60-65％的淀粉；精白米(polishedrice)含有70-72％的淀粉。在本發(fā)明包含的方法的一些實(shí)施方式中，顆粒淀粉底物被漿液化(通常使用水)并且漿體包括i)約10％到約55％的干固體含量(ds)；ii)約15％到約50％的干固體含量；iii)約20％到約45％的干固體含量；iv)約25％到約45％的干固體含量；v)約30％到約45％的干固體含量；vi)約30％到約40％的干固體含量；和vii)約30％到約35％的干固體含量。具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)在一個實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA得自曲霉屬菌株，例如米曲霉、白曲霉、黑曲霉和泡盛曲霉。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA包括與SEQIDNO3列出的氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在另一個實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA包括與SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA包括與SEQIDNO3有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。asAA還可以包括與SEQIDNO3有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA包括SEQIDNO3的氨基酸序列。在其它實(shí)施方式中，包含SEQIDNO3的氨基酸序列或與SEQIDNO3有至少95％的序列同一性的氨基酸序列的asAA由與序列SEQIDNO1有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性的多核苷酸編碼。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼SEQIDNO3的asAA(AsaA)的核酸序列是SEQIDNO1的核酸序列。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解，用在本發(fā)明的組合物和方法中的具有GSH活性的asAA的量將取決于asAA的酶活性。通常，具有GSH活性的asAA以每克漿體干固體含量約0.01至15.0SSU的量與顆粒淀粉底物漿體混合。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的asAA以每克淤漿干固體含量約0.01至10.0SSU、約0.01至5.0SSU、約0.05至10.0SSU、約0.05至5.0SSU、約0.1至10.0SSU、約0.1至5.0SSU、約0.1至2.0SSU、約0.25至2.5SSU、約0.5至5.0SSU、約0.5至2.5SSU；并且也以約0.5至1.5SSU的量被加入。葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶(GA)可以源自細(xì)菌、植物和真菌來源。在本發(fā)明的組合物和方法中有用的優(yōu)選葡糖淀粉酶由絲狀真菌和酵母的幾個株產(chǎn)生。具體而言，從曲霉屬和木霉屬菌株分泌的葡糖淀粉酶在商業(yè)上是重要的。這些葡糖淀粉酶的來源包括黑曲霉G1和G2葡糖淀粉酶及其變體(Boeletal.，(1984)EMBOJ.31097-1102；WO92/00381和WO00/04136)；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶及其變體(Hataetal.，(1991)Agric.Biol.Chem.55941-949)和Aspergillusshirousami(參見Chenetal.，(1996)Prot.Eng.9499-505；Chenetal.(1995)Prot.Eng.8575-582；和Chenetal.，(1994)BiochemJ.302275-281)。葡糖淀粉酶還得自踝節(jié)菌屬(Talaromyces)菌株例如源自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和嗜熱踝節(jié)菌(T.thermophilus)的那些菌株(WO99/28488；USPNo.RE32,153；USPNo.4,587,215)；根霉屬菌株例如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；毛霉屬(Mucor)菌株以及腐質(zhì)霉屬菌株，例如灰腐質(zhì)霉(參見Boeletal.，(1984)EMBOJ.31097-1102；WO92/00381；WO00/04136；Chenetal.，(1996)Prot.Eng.9499-505；Tayloretal.，(1978)CarbohydrateRes.61301-308；美國專利4,514,496；美國專利4,092,434；以及Jensenetal.，(1988)Can.J.Microbiol.34218-223)。商業(yè)使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如從黑曲霉(來自GenencorInternationalInc.，商品名為DISTILLASE、OPTIDEXL-400和GZYMEG9904Xfrom)或根霉屬種(來自ShinNihonChemicals，Japan，商品名為CU.CONC)被生產(chǎn)出。也可以是商業(yè)消化酶，商品名為GLUCZYME，來自AmanoPharmaceuticals，Japan(Takahashietal.，(1985)J.Biochem.98663-671)。另外的酶包括根霉屬菌種的3種形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Glucl”(MW74,000)、“Gluc2”(MW58,600)和″“Gluc3”(MW61,400)”。Gluc1在本發(fā)明中特別有用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，用在本發(fā)明的方法和組合物中的葡糖淀粉酶的數(shù)量取決于該葡糖淀粉酶的酶活性。通常，每克(ds)被調(diào)節(jié)到20-45％干固體的漿體中可以加入0.001和10.0GAU之間的葡糖淀粉酶量。在一些實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶以每克(ds)漿體中0.01和10GAU之間、0.01和5.0GAU之間、0.05和5.0GAU之間、0.1和10.0GAU之間、0.1和5.0GAU之間、0.1和2.0GAU之間、0.25和1.5GAU之間的葡糖淀粉酶量被加入。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶的劑量范圍為從0.1至2.0GAU/g(ds)淤漿。已知一個特定組的葡糖淀粉酶(GA)為顆粒淀粉水解酶GSHE(參見，例如Tosietal.，(1993)Can.J.Microbiol.39846-855)。GA-GSHEs不僅具有葡糖淀粉酶活性，而且能夠水解顆粒(生)淀粉。GA-GSHEs已經(jīng)從真菌細(xì)胞中回收，如腐質(zhì)霉屬某種、曲霉屬某種和根酶屬某種。米根霉GA-GSHE已經(jīng)被描述在Ashikarietal.，(1986)Agric.Biol.Chem.50957-964和USP4,863,864。也可參考雪白根霉?；腋|(zhì)酶GA-GSHE被描述于Allisonetal.，(1992)Curr.Genet.21225-229和歐洲專利]71218。編碼此酶的基因在本領(lǐng)域中也已知為“gla1”。泡盛曲霉白曲霉變種(Aspergillusawamorivar.kawachi)GA-GSHE被描述在Hayashidaetal，(1989)Agric.Biol.Chem53923-929。AspergillusshirousamiGA-GSHE由Shibuyaetal.，(1990)Agric.Biol.Chem.541905-1914描述。用于本發(fā)明的一種具體的GA-GSHE制劑包括可從BioconIndia，Ltd，India獲得的以名稱“M1”出售的酶制劑。GA-GSHE制劑的活性可以根據(jù)葡糖淀粉酶的活性被定義。在一個實(shí)施方式中，GA-GSHE酶可以源自灰腐質(zhì)霉菌株，特別是灰腐質(zhì)霉嗜熱變種(Humicolagriseavar.thermoidea)的菌株(參見，美國專利號4,618,579)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，灰腐質(zhì)霉GA-GSHE酶從包括ATCC16453、NRRL(USDANorthernRegionalResearchLaboratory，Peoria，ILL)15219、NRRL15220、NRRL15221、NRRL15222、NRRL15223、NRRL15224和NRRL15225的真菌以及其遺傳改變菌株中回收。這些種產(chǎn)生免疫學(xué)上相同的葡糖淀粉酶酶制劑(參見EP0171218)。重組表達(dá)酶在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，微生物被遺傳改造以表達(dá)具有GSH活性的異源asAA，微生物也可以被改造以表達(dá)異源葡糖淀粉酶。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，絲狀真菌宿主是曲霉屬某種、木霉屬某種、鐮刀菌屬某種(Fusariumsp)和青霉屬某種的菌株。特別優(yōu)選的真菌宿主細(xì)胞包括構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉、綠色木霉、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和茄腐皮鐮孢菌(F.solani)。曲霉屬菌株在Wardetal.(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743和Goedegebuuretal.，(2002)CurrGene4189-98中被公開。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主是木霉屬的菌株，特別是里氏木霉菌株。里氏木霉菌株是已知的，非限制性例子包括ATCCNo.13631、ATCCNo.26921、ATCCNo.56764、ATCCNo.56765、ATCCNo.56767和NRRL15709。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，宿主菌是RL-P37的衍生物。RL-P37在Sheir-Neissetal.(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology2046-53中被公開。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，木霉屬宿主細(xì)胞或曲霉屬宿主細(xì)胞被遺傳改造，以表達(dá)具有GSH活性的asAA，該asAA特征在于與SEQIDNO3具有至少90％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，編碼asAA的多核苷酸將具有核酸序列SEQIDNO1或與SEQIDNO1有至少70％的序列同一性的核酸序列。在一些實(shí)施方式中，相比于由在天然宿主中具有GSH活性的asAA的內(nèi)源表達(dá)所產(chǎn)生的asAA，在被改造以包括編碼具有GSH活性的asAA的異源多核苷酸的宿主細(xì)胞中所產(chǎn)生的asAA將具有不同的性質(zhì)，例如改進(jìn)的性質(zhì)。這些性質(zhì)可以包括，例如，增加的酶活性、在較低pH水平下增加的酶穩(wěn)定性或增加的比活性。在其它實(shí)施方式中，被遺傳改造以表達(dá)具有GSH活性的asAA的宿主菌株也可以被遺傳改造以表達(dá)異源GA。宿主菌已經(jīng)可以通過遺傳工程被預(yù)先操縱。在一些實(shí)施方式中，真菌宿主細(xì)胞的多種天然基因?qū)⒁驯皇Щ?。這些基因包括，例如，編碼纖維素分解酶如內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和外切纖維二糖水解酶(CBH)的基因(例如cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)。美國專利5,650,322公開了在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37衍生菌株。載體盡管下面的描述具體指asAA，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易理解，對將編碼GA的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中有用的DNA構(gòu)建物和載體，可以應(yīng)用相同或相似的方法。根據(jù)本發(fā)明，包括編碼本發(fā)明涉及的編碼asAA的核酸的DNA構(gòu)建物被構(gòu)建，以便將asAA轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞。在一個實(shí)施方式中，DNA構(gòu)建物通過表達(dá)載體被轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體包括可操縱地連接到asAA編碼序列的調(diào)節(jié)序列。載體可以是當(dāng)其被導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞時被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并被復(fù)制的任何載體。對于載體列表，參考FungalGeneticsStockCenterCatalogueofStrains(FGSC，<www.fgsc.net>)。合適的表達(dá)載體和/或整合載體的其它例子提供在Sambrooketal.，supra(1989)、Ausubel(1987)supra、vandenHondeletal.1991)inBennettandLasure(Eds.)MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPresspp.396-428以及美國專利號5,874,276。特別有用的載體包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明包含的asAA的核酸被可操縱地連接到在真菌宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的合適的啟動子。啟動子可以源自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。優(yōu)選地，啟動子在木霉屬宿主中是有用的。啟動子的合適非限制性例子包括cbh1、cbh2、egl1、egl2。在一個實(shí)施方式中，啟動子是對于宿主細(xì)胞為天然的啟動子。例如，當(dāng)里氏木霉是宿主時，啟動子是天然的里氏木霉啟動子。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動子是里氏木霉cbh1，其是誘導(dǎo)型啟動子并且以登記號(AccessionNo.)D86235被存放于Genbank中?！罢T導(dǎo)型啟動子”是在環(huán)境調(diào)控或發(fā)育調(diào)控下具有活性的啟動子。在另一個實(shí)施方式中，啟動子是對于真菌宿主細(xì)胞為異源的啟動子。有用的啟動子的其它例子包括來自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的啟動子(Nunbergetal.，(1984)Mol.CellBiol.42306-2315和Boeletal.，(1984)EMBOJ.31581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因和纖維二糖水解酶1基因的啟動子可以是有用的(EPA137280A1)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，asAA編碼序列被可操縱地連接到信號序列。編碼信號序列的DNA優(yōu)選地是與將被表達(dá)的asAA基因天然連接的序列。優(yōu)選地，信號序列由編碼Ak-asaA的白曲霉asaA基因編碼。更優(yōu)選地，信號序列與SEQIDNO2的信號序列具有至少90％、至少95％、至少97％和至少99％的序列同一性。在另外的實(shí)施方式中，包括在將被導(dǎo)入真菌宿主的DNA構(gòu)建物或載體中的信號序列和啟動子序列來自相同的來源。例如，在一些實(shí)施方式中，信號序列是可操縱性連接到cdh1啟動子的cdh1信號序列。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體還包括終止序列。在一個實(shí)施方式中，終止序列和啟動子序列來自相同的來源，在另一個實(shí)施方式中，終止序列與宿主細(xì)胞同源。特別合適的終止序列是來自木霉屬菌株、特別是里氏木霉的cbh1。其它有用的真菌終止子包括來自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子(Nubergetal.，(1984)supra，和Boeletal.，supra(1984))。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體包括選擇性標(biāo)記。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記的例子包括使具有抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的標(biāo)記。營養(yǎng)性選擇標(biāo)記也在本發(fā)明中有用，包括本領(lǐng)域已知為amdS、argB和pyr4的那些標(biāo)記。在用于木霉屬轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)中有用的標(biāo)記是本領(lǐng)域中已知的。(參見，例如Finkelstein，BIOTECHNOLOGYOFFILAMENTOUSFUNGI中第6章，F(xiàn)inkelsteinetal.Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章；以及Kinghornetal.(1992)APPLIEDMOLECULARGENETICSOFFILAMENTOUSFUNGI，BlackieAcademicandProfessional，ChapmanandHall，London)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇性標(biāo)記是amdS基因，其編碼乙酰胺酶，允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞以乙酰胺作為氮源而生長。構(gòu)巢曲霉amdS基因作為選擇標(biāo)記的使用描述于Kelleyetal.，(1985)EMBOJ.4475-479和Penttilaetal.，(1987)Gene61155-164中。包括具有編碼asAA的多核苷酸的DNA構(gòu)建物的表達(dá)載體可以是能夠在給定的真菌宿主生物中自我復(fù)制或能夠整合進(jìn)宿主的DNA中的任何載體。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體是質(zhì)粒。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，考慮了兩種類型的表達(dá)載體，用以獲得基因表達(dá)。第一表達(dá)載體包括DNA序列，其中啟動子、asAA編碼區(qū)和終止子都源自將被表達(dá)的基因。在一些實(shí)施方式中，通過剔除不期望的DNA序列(例如編碼不需要的結(jié)構(gòu)域的DNA)獲得基因截短，留下在其自身轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列的控制下被表達(dá)的結(jié)構(gòu)域。第二類表達(dá)載體被預(yù)裝配，并包含高水平轉(zhuǎn)錄所需的序列和選擇標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，asAA基因的編碼區(qū)或其部分被插入通用表達(dá)載體，使得其處于表達(dá)構(gòu)建物啟動子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄控制下。在一些實(shí)施方式中，基因或其部分被插入強(qiáng)cbh1啟動子的下游。用于連接包括編碼asAA的多核苷酸、啟動子、終止子和其它序列的DNA構(gòu)建物的方法以及用于將它們插入合適載體的方法是本領(lǐng)域中已知的。連接通常通過在適宜的限制位點(diǎn)進(jìn)行連接而完成。如果這類位點(diǎn)不存在，根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，使用合成的寡核苷酸連接體(linker)。(參見，Sambrooksupra(1989)，以及BennettandLasure，MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPress，SanDiego(1991)pp70-76。)另外，可以使用已知的重組技術(shù)構(gòu)建載體(例如InvitrogenLifeTechnologies，GatewayTechnology)。在期望獲得具有一個或更多個失活基因的真菌宿主細(xì)胞的情況下，可以使用已知的方法(例如，美國專利5,246,853、美國專利5,475,101和WO92/06209中公開的方法)。基因失活可以通過完全或部分缺失、插入失活或使得基因?qū)τ陬A(yù)期目標(biāo)無功能化的任何其它方法(因而，阻止基因表達(dá)功能蛋白)而進(jìn)行。已被克隆的來自木霉屬某種或其它絲狀真菌宿主的任何基因可以被缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些實(shí)施方式中，通過用本領(lǐng)域已知的方法使將某一形式的要被失活的期望基因插入質(zhì)粒中，可以進(jìn)行基因缺失。然后，缺失質(zhì)粒在期望基因編碼區(qū)內(nèi)部的適宜限制性酶切位點(diǎn)被切割，并且基因編碼序列或其部分替換為選擇標(biāo)記。待缺失基因的座位(優(yōu)選約0.5至2.0kb之間)的側(cè)翼DNA序列保持在標(biāo)記基因的每一邊。適宜的缺失質(zhì)粒通常具有存在于其中的獨(dú)特限制性酶切位點(diǎn)，使得含有缺失基因的片段，包括側(cè)翼DNA序列和選擇標(biāo)記基因能夠被作為單一線性片段而被除去。宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和培養(yǎng)DNA構(gòu)建物或載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入包括技術(shù)例如轉(zhuǎn)化；電穿孔；核顯微注射；轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)染(例如，脂轉(zhuǎn)染介導(dǎo)和DEAE-Dextrin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)；與磷酸鈣DNA沉淀物溫育；DNA包被微粒的高速轟擊；以及原生質(zhì)體融合。普通轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的(參見，例如Ausubeletal.，supra(1987)，第9章；以及Sambrook(1989)supra，和Campbelletal.，(1989)Curr.Genet.1653-56)。木霉屬中異源蛋白的表達(dá)描述于USP6,022,725；美國專利6,268,328；Harkkietal.(1991)；EnzymeMicrob.Technol.13227-233；Harkkietal.，(1989)BioTechnol.7596-603；EP244,234；EP215,594；以及Nevalainenetal.，″TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandHeterologousGenes″，MOLECULARINDUSTRIALMYCOLOGY，Eds.LeongandBerka，MarcelDekkerInc.，NY(1992)pp.129-148。對于曲霉屬菌株的轉(zhuǎn)化，也參考Caoetal.，(2000)Sci.9991-1001。優(yōu)選地，用載體系統(tǒng)構(gòu)建遺傳上穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，編碼asAA的核酸由此被穩(wěn)定整合進(jìn)宿主菌株染色體中，然后，通過已知技術(shù)純化轉(zhuǎn)化體。在一個非限制性例子中，通過它們在含有乙酰胺的固體培養(yǎng)基上的更快的生長速率和具有平滑而非粗糙輪廓的環(huán)狀菌落的形成，將含有amds標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體區(qū)分開來。另外，在一些情況下，通過使轉(zhuǎn)化體在固體非選擇性培養(yǎng)基(即，缺乏乙酰胺的培養(yǎng)基)上生長、從該培養(yǎng)基收集孢子并測定這些孢子隨后在含乙酰胺的選擇培養(yǎng)基上萌發(fā)和生長的百分比，進(jìn)行進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗(yàn)?？蛇x地，可以用本領(lǐng)域中已知的其它方法選擇轉(zhuǎn)化體。在一個具體的實(shí)施方式中，用于轉(zhuǎn)化的木霉屬某種的制備包括從真菌菌絲體制備原生質(zhì)體。(參見Campbelletal.，(1989)Curr.Genet.1653-56)。在一些實(shí)施方式中，菌絲體得自萌發(fā)的營養(yǎng)孢子。用消化細(xì)胞壁的酶處理菌絲體，得到原生質(zhì)體。然后，在懸浮培養(yǎng)基中，用于存在滲透穩(wěn)定劑，原生質(zhì)體得到保護(hù)。這些穩(wěn)定劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂和類似穩(wěn)定劑。通常，這些穩(wěn)定劑的濃度在0.8M和1.2M之間變化。優(yōu)選的是，在懸浮培養(yǎng)基中使用1.2M山梨醇溶液。DNA向宿主木霉屬某種菌株的吸收取決于鈣離子濃度。通常，約10mMCaCl2和50mMCaCl2之間被用在吸收溶液中。在吸收溶液中除了需要鈣離子，通常包括的其它化合物是緩沖體系例如TE緩沖液(10mMTris，pH7.4；1mMEDTA)或10mMMOPS，pH6.0緩沖液(嗎啉丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。據(jù)認(rèn)為，聚乙二醇起著融合細(xì)胞膜的作用，從而允許培養(yǎng)基的內(nèi)容物被輸送至木霉屬某種菌株的細(xì)胞質(zhì)中以及質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)移到核。該融合通常使得多拷貝質(zhì)粒DNA整合進(jìn)宿主染色體。通常，在轉(zhuǎn)化中應(yīng)用含有木霉屬某種原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液，所述原生質(zhì)體或細(xì)胞已經(jīng)以105至107/mL的密度接受滲透性處理，優(yōu)選2×106/mL。在適宜溶液(例如1.2M山梨醇；50mMCaCl2)中的100μL體積的這些原生質(zhì)體或細(xì)胞與期望DNA混合。通常，高濃度的PEG被加入到吸收溶液。從0.1至1體積的25％PEG4000可以被加入到原生質(zhì)體懸浮液。然而，優(yōu)選將約0.25體積加入到原生質(zhì)體懸浮液中。添加劑例如二甲基亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀和類似添加劑也可以被加入到吸收溶液并幫助轉(zhuǎn)化。對于其它真菌宿主細(xì)胞，相同的步驟也可以利用。(參見，例如美國專利6,022,725和6,268,328，兩者都被引入作為參考)。通常，該混合物隨后在大約0℃下溫育10至30分鐘之間的一段時間。然后，向混合物中加入另外的PEG，以進(jìn)一步增強(qiáng)期望基因或DNA序列的吸收。25％PEG4000通常以轉(zhuǎn)化混合物的體積的5至15倍體積被加入；然而，更多或更少的體積可以是適合的。25％PEG4000優(yōu)選地是轉(zhuǎn)化混合物的體積的約10倍。加入PEG之后，然后，轉(zhuǎn)化混合物在加入山梨醇和CaCl2溶液之前在室溫下或在冰上溫育。然后，原生質(zhì)體懸浮液被進(jìn)一步加入到生長培養(yǎng)基的熔融等分試樣。該生長培養(yǎng)基僅允許轉(zhuǎn)化體生長。通常，細(xì)胞在含有生理鹽和養(yǎng)分的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(參見，例如Pourquie，J.etal.，BIOCHEMISTRYANDGENETICSOFCELLULOSEDEGRADATION，eds.Aubert，J.P.etal.，AcademicPress，pp.71-86，1988和llmen，M.etal.，(1997)Appl.Environ.Microbiol.631298-1306)。普通商業(yè)制備的培養(yǎng)基(例如酵母麥芽提取物(YM)肉湯、LuriaBertani(LB)肉湯和沙氏葡萄糖(SabouraudDextrose)(SD)肉湯)也在本發(fā)明中有用。培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的，(例如，在振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐中在適宜的培養(yǎng)基中于約28℃培養(yǎng)培養(yǎng)物直至達(dá)到asAA表達(dá)的期望水平)。對于給定的絲狀真菌，優(yōu)選的培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域中是已知的，可以在科學(xué)文獻(xiàn)中和/或從真菌來源例如AmericanTypeCultureCollection和FungalGeneticsStockCenter找到。在建立起真菌生長后，細(xì)胞被暴露于有效導(dǎo)致或允許asAA表達(dá)的條件中，如本文所限定。在具有GSH活性的asAA編碼序列處于誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控下的情況下，誘導(dǎo)劑(例如糖、金屬鹽或抗微生物劑)，以有效誘導(dǎo)asAA表達(dá)的濃度被加入到培養(yǎng)基。asAA活性的鑒定為了評價通過已經(jīng)用編碼本發(fā)明包含的asaA的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系對具有GSH活性的asAA的表達(dá)，可以在蛋白質(zhì)水平、RNA水平或使用特定于α淀粉酶活性和/或產(chǎn)量的功能生物試驗(yàn)進(jìn)行測定。通常，所使用的試驗(yàn)包括，RNA印跡法(Northernblotting)、斑點(diǎn)印跡法(dotblotting)(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))或原位雜交，其中使用適當(dāng)標(biāo)記的探針(基于核酸編碼序列)，和常規(guī)的DNA印跡法(Southernblotting)和放射自顯影。另外，具有GSH活性的asAA的產(chǎn)生和/或表達(dá)可以在樣品中直接測量，例如，通過直接測量培養(yǎng)基中的還原糖例如葡萄糖的試驗(yàn)和通過測量葡糖淀粉酶活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生的試驗(yàn)。對測量GSH活性有用的底物包括顆粒淀粉底物。例如，葡萄糖濃度可以通過任何方便的方法被確定，例如通過使用葡萄糖試劑試劑盒No15-UV(SigmaChemicalCo.)或儀器例如TechniconAutoanalyzer。還參考從InstrumentationLab.(Lexington，MA)商購可得的葡萄糖氧化酶試劑盒和葡萄糖己糖試劑盒。另外，基因表達(dá)可以通過免疫方法評價，例如細(xì)胞、組織切片的免疫組化染色，或組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的免疫測定，如通過蛋白質(zhì)印跡或ELISA。此類免疫測定可以被用于定性或定量評價asaA的表達(dá)。此類方法的細(xì)節(jié)對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是已知的并且用于實(shí)踐這類方法的許多試劑是商業(yè)可得的。另外，基因表達(dá)可以通過免疫方法評價，例如細(xì)胞、組織切片的免疫組化染色，或組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的免疫測定，如通過蛋白質(zhì)印跡或ELISA。此類免疫測定可以被用于定性或定量評價asaA的表達(dá)。此類方法的細(xì)節(jié)對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是已知的并且用于實(shí)踐這類方法的許多試劑是商業(yè)可得的。α淀粉酶活性可以通過使用DNS法測定，如在MilleR，G.L.(1959)Anal.Chem.31426-428中所描述。葡糖淀粉酶活性可以通過3，5-二硝基水楊酸(DNS)法(參見，Gotoetal.，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.5849-54)測定。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，由木霉屬或曲霉屬宿主表達(dá)的具有GSH活性的asAA為每升培養(yǎng)基1克蛋白質(zhì)(g/L)以上、2g/L以上、5g/L以上、10g/L以上、20g/L以上、25g/L以上、30g/L以上、50g/L以上，也可以是100g/L以上。純化asAA的方法通常，細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的asaA(包括n-asAA或r-asAA)被分泌到培養(yǎng)基中并且可以通過例如從細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中除去不需要的組分而被純化或分離。在一些情況下，AsaA可以在細(xì)胞形式中產(chǎn)生，使從細(xì)胞裂解液回收成為必要。在這樣的情況下，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)采用的技術(shù)，從產(chǎn)生酶的細(xì)胞中分離該酶。例子包括，但不限于，親和層析(Tilbeurghetal.，(1984)FEBSLett.16215)；離子交換色譜法(Goyaletal.，(1991)Biores.Technol.3637；Fliessetal.，(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17314；Bhikhabhaietal.，(1984)J.Appl.Biochem.6336；和Ellouzetal.，(1987)Chromatography396307)，包括使用具有高分辨力的物質(zhì)的離子交換(Medveetal.，(1998)J.ChromatographyA808153)；疏水相互作用色譜法(TomazandQueiroz，(1999)J.ChromatographyA865123)；兩相分配(Brumbauer，etal.，(1999)Bioseparation7287)；乙醇沉淀；反相HPLC；硅石上或陽離子交換樹脂例如DEAE上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀和使用例如SephadexG-75的凝膠過濾。發(fā)酵在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，表達(dá)異源葡糖淀粉酶和/或asAA的真菌細(xì)胞在分批或連續(xù)發(fā)酵條件下生長。傳統(tǒng)的分批發(fā)酵是封閉的系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成在發(fā)酵開始時設(shè)定并且在發(fā)酵期間不進(jìn)行人工調(diào)整。因此，在發(fā)酵開始時，用期望的生物體接種培養(yǎng)基。在此方法中，在不向系統(tǒng)加入任何成分的情況下進(jìn)行發(fā)酵。典型地，依據(jù)碳源的加入，分批發(fā)酵可稱為“分批”，并且經(jīng)常努力控制因素例如pH和氧濃度。分批系統(tǒng)的代謝物和生物物質(zhì)組成持續(xù)變化，直至發(fā)酵停止的時刻。在分批培養(yǎng)物中，細(xì)胞由遲緩期進(jìn)入到高速生長的對數(shù)期，最終達(dá)到生長速率降低或停止的穩(wěn)定期。如果不處理，處于穩(wěn)定期的細(xì)胞最終死亡。通常，處于對數(shù)期的細(xì)胞負(fù)責(zé)大量產(chǎn)生終產(chǎn)物。在標(biāo)準(zhǔn)分批體系中的變化是“喂料-分批發(fā)酵(fed-batchfermentation)”系統(tǒng)，該系統(tǒng)也在本發(fā)明中有用。在典型的分批系統(tǒng)的這種變化中，隨著發(fā)酵的進(jìn)程，底物以一定增量加入。當(dāng)分解代謝物阻遏傾向于抑制細(xì)胞代謝和期望在培養(yǎng)基中具有限量的底物時，喂料-分批系統(tǒng)是有用的。測量喂料-分批系統(tǒng)中的實(shí)際底物濃度是困難的，因此，根據(jù)可測量的因素例如pH、溶解的氧和廢氣例如CO2分壓的變化進(jìn)行估計。分批和喂料-分批發(fā)酵在本領(lǐng)域中是常見和熟知的。連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中限定的發(fā)酵培養(yǎng)基被連續(xù)加入到生物反應(yīng)器中，同時移出等量的條件培養(yǎng)基，以進(jìn)行發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵通常使培養(yǎng)物維持在恒定的高密度，其中細(xì)胞主要處于對數(shù)生長期。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長和/或終產(chǎn)物濃度的一種因素或任意數(shù)量的因素。例如，在一個實(shí)施方式中，限制性營養(yǎng)物例如碳源或氮源被維持在固定的速率，所有其它參數(shù)允許調(diào)節(jié)。在其它系統(tǒng)中，影響生長的許多因素可以持續(xù)改變，而由培養(yǎng)基濁度測量的細(xì)胞濃度保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)努力保持穩(wěn)態(tài)生長條件。因此，由于培養(yǎng)基的排除導(dǎo)致的細(xì)胞損失必須依據(jù)發(fā)酵中的細(xì)胞生長速率進(jìn)行平衡。調(diào)節(jié)營養(yǎng)物和生長因素以進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵工藝的方法以及使產(chǎn)物形成速率最大化的技術(shù)是工業(yè)微生物領(lǐng)域熟知的。組合物和方法在一個實(shí)施方式中，使顆粒淀粉底物與具有GSH活性的asAA接觸，其中asAA作為無細(xì)胞濾液得到(例如其中asAA分離自培養(yǎng)基)。在另一個實(shí)施方式中，使顆粒淀粉底物與具有GSH活性的asAA接觸，其中asAA在含有表達(dá)和分泌具有GSH活性的asAA的真菌宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中獲得。在其它實(shí)施方式中，在同一步驟中，使顆粒淀粉底物與具有GSH活性的asAA和葡糖淀粉酶(GA)接觸，以水解顆粒淀粉。GA也可以作為無細(xì)胞濾液或在含有表達(dá)和分泌GA的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中獲得。根據(jù)本發(fā)明特別有用的顆粒淀粉水解酶組合物包括GA(例如DISTALLASE)和與SEQIDNO3具有至少90％或至少95％的序列同一性的asAA的混合物。在一些實(shí)施方式中，以活性測量的存在于該混合物中的asAA的范圍是從0.01至15.0SSU，并且在該組合中有用的葡糖淀粉酶量是0.1至10.0GAU/gds的范圍。特別有用的酶組合物包括與SEQIDNO3有至少95％序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。另一個特別有用的酶組合物包括與SEQIDNO3有至少98％序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性(SSU)的asAA與GA活性(GAU)的比率為15∶1至1∶15的范圍內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該比率(SSU比GAU)將在約10∶1至1∶10的范圍內(nèi)；約10∶1至1∶5；約5∶1至1∶5；約4∶1至1∶4；約3∶1至1∶3；約2∶1至1∶4和約2∶1至1∶2的范圍內(nèi)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，SSU與GAU的比率將在約4∶1至2∶1之間。在一個實(shí)施方式中，包括單獨(dú)的asAA或asAA與葡糖淀粉酶的組合的酶組合物將被加入到顆粒淀粉底物的漿體中并且混合物在一步中發(fā)酵。漿體可以具有約10-50％ds；約10-45％ds；約15-40％ds；約20-40％ds；約25-40％ds；或約25-35％ds。本發(fā)明的組合物和方法包括的組分的精確量取決于所應(yīng)用的酶以及所處理的顆粒淀粉的類型的組合。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生終產(chǎn)物的方法，包括在一步中使顆粒淀粉底物漿體與包括葡糖淀粉酶和具有顆粒淀粉(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的酶組合接觸，產(chǎn)生終產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，asAA和GA被分別加入，在其它實(shí)施方式中，asAA和GA以組合摻混物加入。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，接觸步驟在顆粒淀粉的淀粉糊化溫度以下的溫度下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的方法所使用的精確溫度取決于所使用的具體淀粉底物。通常的淀粉糊化溫度范圍公開在Swinkels，STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY第32-38頁，edsVanBeynumetal.，(1985)MarcelDekkerInc.，NY和THEALCOHOLTEXTBOOK，AREFERENCEFORTHEBEVERAGE，F(xiàn)UELANDINDUSTRIALALCOHOLINDUSTRIES，3rdEd.，edsJacquesetal.，1999，NottinghamUniversityPress，UK。在一些實(shí)施方式中，溫度為至少約10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃。在其它實(shí)施方式中，該溫度將在約30-65℃、約35-65℃、約40-65℃和約45-65℃之間。在其它實(shí)施方式中，該溫度將在約25-45℃、約25-40℃、約30-40℃和約30-35℃之間。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，淀粉底物從不經(jīng)受用于液化的熱條件。在一些實(shí)施方式中，本方法的停留時間為從約2至300小時，但更通常從2至120小時。在一些實(shí)施方式中，該步驟進(jìn)行約5至100小時。在其它實(shí)施方式中，該步驟進(jìn)行約5至80小時。在其它實(shí)施方式中，該步驟進(jìn)行至少約5小時但在100小時以下。在其它實(shí)施方式中，該步驟進(jìn)行至少約10小時但在約100小時以下。在一些實(shí)施方式中，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的顆粒淀粉的干固體被水解。在一些實(shí)施方式中，顆粒淀粉底物被完全水解。在一些實(shí)施方式中，在100小時中，至少90％的顆粒淀粉被水解。在某些實(shí)施方式中，在24小時的時間段內(nèi)，至少90％的顆粒淀粉底物被水解。在其它實(shí)施方式中，在24小時的時間段內(nèi)，至少95％的顆粒淀粉底物被水解。葡萄糖產(chǎn)量(總的溶解的干固體的百分比)可以是至少約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％和98％。然而，在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡萄糖被連續(xù)產(chǎn)生并基本上所有葡萄糖都被用在該方法中，以產(chǎn)生終產(chǎn)物例如乙醇。(參考MOLECULARSTRUCTUREANDFUNCTIONOFFOODCARBOHYDRATE，ED.G.G.BIRCHETAL，APPLIEDSCIENCEPUBLISHERS，LONDON)。另外的酶可以被包括在本發(fā)明包含的組合物和方法中。這些在本發(fā)明中有用的另外的酶包括脫支酶例如支鏈淀粉酶(E.C.3.2.1.41)和異淀粉酶(E.C.3.2.1.68)。這類酶水解α-1，6-糖苷鍵。因此，在淀粉的水解期間，脫支酶從淀粉的非還原端連續(xù)除去葡萄糖單元?？梢杂迷诒景l(fā)明的組合物中的另一個酶是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)。這些是外部作用生麥芽糖淀粉酶(exo-actingmaltogenicamylases)，其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉和相關(guān)的葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷鍵的水解。這些酶的特征在于具有從4.5至7.0的最適pH范圍和從40℃至65℃的最適溫度范圍。商業(yè)β淀粉酶是可得自GenencorInternationalInc.?？梢员皇褂玫倪M(jìn)一步另外的酶是蛋白酶，例如真菌和細(xì)菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括例如得自曲霉屬、毛酶屬和根霉屬的那些蛋白酶，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米赫毛霉(M.miehei)。其它酶包括但不限于纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶和角質(zhì)酶。欲包括在本發(fā)明的方法中的這些酶的有效量可以被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定。在一些實(shí)施方式中，抗微生物劑可以被加入到本發(fā)明的組合物和發(fā)酵培養(yǎng)基中。抗微生物劑是殺死或抑制微生物生長的化合物。在另一個實(shí)施方式中，顆粒淀粉底物可以在與asAA和任選與GA接觸之前被預(yù)處理。預(yù)處理包括在與產(chǎn)乙醇微生物發(fā)酵或培養(yǎng)之前將顆粒淀粉底物優(yōu)選含生底物的漿體加熱到淀粉底物的淀粉糊化溫度以下的溫度。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，預(yù)處理包括應(yīng)用α淀粉酶，例如細(xì)菌α淀粉酶(即SPEZYME和GZYME997(GenencorInternational，Inc.))。在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理將包括在含有根據(jù)本發(fā)明的具有GSH活性的asAA以及任選含有葡糖淀粉酶的培養(yǎng)中。在其它實(shí)施方式中，預(yù)處理將從包括具有GSH活性的asAA和任選包括葡糖淀粉酶的培養(yǎng)中被分開。在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理將從約2至24小時發(fā)生。在其它實(shí)施方式中，預(yù)處理將從約2至8小時發(fā)生。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法包括同步糖化發(fā)酵(SSF)，其中顆粒淀粉水解步驟和發(fā)酵步驟同時進(jìn)行。包括與具有GSH活性的asAA接觸的顆粒淀粉底物的培養(yǎng)基還包括微生物，例如細(xì)菌、真菌或酵母，特別是產(chǎn)乙醇微生物，所述具有GSH活性的asAA或者在無細(xì)胞濾液中供應(yīng)或者由培養(yǎng)物中的真菌宿主表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，發(fā)酵系統(tǒng)可以包括至少兩種細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，除了與具有GSH活性的asAA接觸外，SSF將包括使顆粒淀粉底物與葡糖淀粉酶接觸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)乙醇微生物將包括酵母，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(美國專利4,316,956)。產(chǎn)乙醇微生物的優(yōu)選例子還包括表達(dá)醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的細(xì)菌，例如可以用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmoblis)獲得或從運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中獲得(美國專利5,028,539；5,424,202；5,487,989；5,482,846；5,554,520；和5,514,583)。在另外的實(shí)施方式中，產(chǎn)乙醇微生物表達(dá)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，它們是將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖的酶。酵母的商業(yè)來源包括FALI、REDSTAR(RedStar)、FERMIOL(DSMSpecialties)和SUPERSTART(Alltech)。在一些實(shí)施方式中，同步糖化發(fā)酵的停留時間將為約2至300小時，但優(yōu)選從2至120小時。在一些實(shí)施方式中，該時間為約5至100小時。在其它實(shí)施方式中，該時間為約5至80小時。在再其它的實(shí)施方式中，該時間為至少5小時但為100小時以下。在其它實(shí)施方式中，在10-40℃的溫度下并優(yōu)選在25-40℃下以及3.5至6.0的pH下，該處理時間(processtime)為至少約10小時但為100小時以下。酵母在發(fā)酵中的使用是熟知的并參考THEALCOHOLTEXTBOOK，K.JACQUESETAL.，EDS.1999，NOTTINGHAMUNIVERSITYPRESS，UK。在一些實(shí)施方式中，至少5％體積、至少8％體積、至少10％體積、至少12％體積、至少15％體積和至少18％體積的乙醇在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生。在其它實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的乙醇的量將在5-30％之間、也在5-25％之間以及在5-20％之間。在發(fā)酵之后，可以通過本領(lǐng)域中已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基回收醇(即乙醇)。在一些實(shí)施方式中，發(fā)酵過的培養(yǎng)基中的醇可以被蒸餾，例如通過加熱或真空蒸餾。然后，乙醇可以被用作例如燃料乙醇或飲用乙醇。被稱為釜餾物的剩下的殘留物也可以被回收，并且重復(fù)用于下次發(fā)酵的釜餾物的成分或釜餾物可以被分成可溶餾分或不可溶餾分。當(dāng)釜餾物例如通過離心或篩選為可溶餾分和不可溶餾分而被分離時，這些餾分可以被用來制備酒糟可溶物(distiller’ssolubles)或可溶性干酒糟(distiller’sdriedsolubles)或被一起混合而制備含可溶物干酒糟(DDGS)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉通常形成DDGS和酒糟的方法。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，當(dāng)在發(fā)酵過程中乙醇百分比提高時，DDGS的量降低。然而，本發(fā)明包括的方法的一個顯著的優(yōu)點(diǎn)可以是在DDGS中總蛋白百分比提高，參考實(shí)施例10。DDGS隨后可以用在例如動物飼料配制中。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括的SSF方法將導(dǎo)致含有30％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、2％以下和1％以下的殘留淀粉的DDGS。預(yù)期的是，盡管與現(xiàn)有技術(shù)的方法制備的DDGS相比具有較低的殘留淀粉含量，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的DDGS確實(shí)具有提高的蛋白總量，從而對用在動物飼料中具有另外的益處。從發(fā)酵中回收的殘留淀粉可以與酶和/或微生物一起被重復(fù)利用，并經(jīng)受重新的發(fā)酵。在一個實(shí)施方式中，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到預(yù)定的醇含量(例如8至30％)時，同時用asaA和葡糖淀粉酶以及微生物發(fā)酵20-50％ds的顆粒淀粉漿體的方法將產(chǎn)生殘留淀粉。殘留淀粉、微生物和/或殘留酶可以按照需要與新鮮顆粒淀粉和另外的酶等分試樣混合，產(chǎn)生用于另一次發(fā)酵的發(fā)酵物料。然而，意圖不是將本發(fā)明限制為重復(fù)利用酶和/或微生物及殘留淀粉。在一些實(shí)施方式中，微生物在重復(fù)利用殘留淀粉之前從殘留淀粉中除去，而在其它實(shí)施方式中，僅僅微生物被重復(fù)利用。本文中介紹的多個實(shí)施方式的一個例子見于圖12。盡管在優(yōu)選的實(shí)施方式中，期望的終產(chǎn)物是乙醇，但期望的終產(chǎn)物可以是能夠通過顆粒淀粉底物的酶促轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。顆粒淀粉水解得到的葡萄糖可以被生物轉(zhuǎn)化成許多產(chǎn)物，例如但不限于抗壞血酸中間體(葡糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、5-酮-葡糖酸和2，5-二酮葡糖酸)；1，3-丙二醇；芳族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有機(jī)酸(例如乳酸、琥珀酸、異檸檬酸和草酰乙酸)；氨基酸(絲氨酸和甘氨酸)；丙酮酸和其它。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以用在這些終產(chǎn)物的生產(chǎn)中的多種發(fā)酵條件以及測量蛋白質(zhì)表達(dá)水平的酶試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)提供下面的實(shí)施例供，用以說明和進(jìn)一步闡述本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方式和方面，并不被解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，預(yù)期的是，這些教導(dǎo)將在進(jìn)一步優(yōu)化本文中描述的方法系統(tǒng)中有用。在隨后的公開內(nèi)容和試驗(yàn)部分，使用下列縮寫具有GSH活性的asAA(具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶)；asaA(具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶，如SEQIDNO3所示，得自白曲霉中asAA的內(nèi)源性表達(dá))；Tr-asaA(在里氏木霉宿主中表達(dá)的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶)；AkAA(具有SEQIDNO3的酸穩(wěn)定性α淀粉酶，有時與asaA互換使用)；以及其它縮寫，包括GA(葡糖淀粉酶)；wt％(重量百分比)；℃(攝氏度)；rpm(轉(zhuǎn)/每分鐘)；H2O(水)；dH2O(去離子水)；dIH2O(去離子水，Milli-Q過濾)；aa(氨基酸)；bp(堿基對)；kb(千堿基對)；kD(千道而頓)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；μM(微摩爾)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；DO(溶解氧)；鄰苯二甲酸鹽緩沖液(水中的鄰苯二甲酸鈉，20mM，pH5.0)；PBS(磷酸緩沖鹽[150mMNaCl，10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2])；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三羥甲基氨基甲烷)；w/v(重量體積比)；w/w(重量比)；v/v(體積比)；Genencor(GenencorInternational，Inc.，PaloAlto，CA)；DDGS(含固體干酒糟)；MT(公噸)；和EtOH(乙醇)。下面的試驗(yàn)和方法被用在下面提供的實(shí)施例中葡糖淀粉酶試驗(yàn)使用熟知的試驗(yàn)測量葡糖淀粉酶活性，該試驗(yàn)基于葡糖淀粉酶催化對硝基苯基-α-D-比喃葡萄糖苷(PNPG)水解成葡萄糖和對硝基苯酚的能力。在堿性pH下，硝基苯酚形成黃顏色，所述顏色與葡糖淀粉酶活性成比例，并且是在400nm下檢測并與以GAU測定的酶標(biāo)準(zhǔn)品比較。1個“葡糖淀粉酶活性單位”(GAU)被定義為產(chǎn)生1克還原糖的酶的量，計算為在pH4.2和60℃下每小時得自可溶性淀粉底物(4％ds)的葡萄糖。酸穩(wěn)定性α淀粉酶活性的測量是基于在pH4.5、50℃下，酶樣品等分試樣對可溶馬鈴薯淀粉底物(4％ds)的水解程度。使用DNS法測量還原糖含量，如Miller，GL.(1959)Anal.Chem.31426-428所描述。1單位酶活性(SSU，可溶性淀粉單位(solublestarchunit))等價于在特定的溫育條件下每分鐘釋放1mg葡萄糖的還原能力?？偟矸酆康臏y定酶-酶淀粉液化和糖化方法被用于測定總淀粉含量。在通常的分析中，2g干樣品被放入100ml科耳勞奇瓶(Kohlraucshflask)并且加入45mlpH7.0的MOPS緩沖液。漿體被充分?jǐn)嚢?0分鐘。加入1.0mlSPEZYMEFRED(1∶50稀釋于水中)并加熱到沸騰3-5分鐘。該瓶被置于壓熱器中，維持在121℃下15分鐘。在壓熱后，該瓶被置于95℃水浴中并加入1ml1∶50稀釋的SPEZYMEFRED溫育45分鐘。調(diào)節(jié)pH到pH4.2，而溫度降到60℃。隨后加入20ml醋酸鹽緩沖液，pH4.2。通過加入1.0ml1∶100稀釋的OPTIDEXL-400(來自GenencorInternationalInc.的葡糖淀粉酶)進(jìn)行糖化，于60℃持續(xù)溫育18小時。于95℃加熱10分鐘終止酶反應(yīng)。使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過HPLC分析，測定總糖組成。來自在室溫下無酶處理的樣品的水抽提物的可溶淀粉水解產(chǎn)物從總糖中被減去。殘留淀粉碘試驗(yàn)醪(beer)(發(fā)酵肉湯)樣品在2ml塑料離心管中離心。潷出上清液，含有粒狀沉淀的管被置于冰浴中。將幾滴0.025N碘溶液(0.1N碘，來自VWR目錄號VW3207-1稀釋4X)加入該粒狀沉淀并混合。陽性(+)淀粉顯示從藍(lán)色到紫色的顏色范圍，并且顏色強(qiáng)度與淀粉濃度成正比例。陰性結(jié)果(-)保持淡黃色。總蛋白分析使用Kieldhal法(AmericanAssoc.CerealChemists(AACC)，(1983)，Methods22B608thEd.StPaul，MN)，測定樣品配制物中的總氮(N)。蛋白質(zhì)含量用6.25×總氮計算。乙醇和糖類測定使用HPLC法測定樣品中乙醇和糖類組成，如本文所述a)使1.5mLEppendorf離心管裝滿發(fā)酵罐醪并在冰上冷卻10分鐘b)將該樣品管在Eppendorf臺式離心機(jī)(Eppendorftabletopcentrifuge)中離心1分鐘；c)將0.5mL上清液樣品轉(zhuǎn)移到含0.05mLKill溶液(1.1NH2SO4)的測定管中并使其靜止5分鐘；d)向測定管樣品中加入5.0mL水，然后通過0.45μmNylonSyringeFilter過濾到HPLC瓶中；和e)在HPLC上運(yùn)行。HPLC條件a)乙醇系統(tǒng)柱PhenomenexRezexOrganicAcidColum(RHM-單糖)#00H-0132-KO(等價于Bio-Rad87H)柱溫60℃流動相0.01NH2SO4流速0.6mL/min檢測器RI注射體積20μLb)糖類系統(tǒng)柱PhenomenexRezexCarbohydrate(RCM-單糖)#00H-0130-KO(等價于Bio-Rad87H)柱溫70℃流動相納米純DIH2O流速0.8mL/min檢測器RI注射體積10μL(3％DS材料)該柱基于糖的分子量分離，所述糖被指為DP1(單糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)和DP+4(具有大于3的聚合度的寡糖)。如下制備用在實(shí)施例7-12中的asaA。在表達(dá)asaA的里氏木霉(根據(jù)實(shí)施例2和3制備)發(fā)酵結(jié)束時，通過離心分離生物材料，使用10,000分子量截留超濾膜濃縮澄清培養(yǎng)物濾液。具有(90SSU/g)的超濾濃縮物被使用。如下制備用在實(shí)施例7-12中的葡糖淀粉酶使用如在USP3,249,514中描述的經(jīng)選擇的黑曲霉真菌菌株。發(fā)酵后，使用包括過濾和離心的常規(guī)分離方法分離真菌菌絲體。通過在5℃下超濾，濃縮澄清濾液達(dá)到規(guī)定活性。實(shí)施例1克隆白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶基因從白曲霉菌絲體過夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。根據(jù)制造商對真菌的指示，使用FastDNAKit(QbioGene，Carlsbad，CA)SPINTM方案。對于勻漿，樣品在FastPrepInstrument上以速度4.0被處理30秒。在A.Kaneko，etal.(Kanekoetal.，(1996)，J.FermBioeng81292-298)的asaA序列的基礎(chǔ)上設(shè)計PCR引物。正向引物包含用于定向克隆到pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。α6引物的序列是CACCATGAGAGTGTCGACTTCAAG(SEQIDNO.6)，Akaa3引物的序列是CTACCTCCACGTATCAACCAC(SEQIDNO.7)。通過凝膠提取(GelPurificationkit，Qiagen)純化2.36kbPCR產(chǎn)物，并根據(jù)InvitrogenGateway系統(tǒng)的方案克隆入pENTR/D。然后，載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)化學(xué)感受態(tài)Top10大腸桿菌(E.coli)(Invitrogen)，帶有卡那霉素選擇。用限制性酶消化來自幾個克隆的質(zhì)粒DNA，確認(rèn)正確大小插入片段。從幾個克隆對α淀粉酶基因插入片段(SEQIDNO1)進(jìn)行測序(Sequetech，MountainView，CA)。來自1個克隆的質(zhì)粒DNA，pENTR/DAkaa#11，被加入到與pTrex3g/amdS目標(biāo)載體DNA的LR克隆酶反應(yīng)(clonasereaction)中(InvitrogenGateway系統(tǒng))。在LR克隆酶反應(yīng)中，重組使目標(biāo)載體的CmR和ccdB基因替換為來自pENTR/D載體的白曲霉asaA。該重組在目標(biāo)載體的cbhl啟動子和終止子之間定向插入asaA。48和80bp的重組位點(diǎn)序列分別保持在α淀粉酶的上游和下游。LR克隆酶反應(yīng)的等分試樣被轉(zhuǎn)化進(jìn)化學(xué)感受態(tài)Top10大腸桿菌并在羧芐青霉素選擇下過夜生長。來自幾個克隆的質(zhì)粒DNA被限制性消化，以確認(rèn)正確的插入片段大小。用EcoRI消化米自克隆pTrex3g_Akalpha#1的質(zhì)粒DNA(圖4)，釋放包括cbhl啟動子asaAcbhl終止子amdS表達(dá)盒。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過瓊脂糖提取純化該7.8kb的表達(dá)盒，并且使之轉(zhuǎn)化到源自公眾可得的菌株QM6a的里氏木霉菌株，如下面進(jìn)一步描述。實(shí)施例2里氏木霉的生物射彈轉(zhuǎn)化里氏木霉孢子懸浮液被鋪在MABA轉(zhuǎn)化平板的～6cm直徑的中心上(150μl5×107-5×108孢子/ml的懸浮液)。然后，該平板在生物排風(fēng)罩(hood)中被風(fēng)干。阻擋屏(Stoppingscreens)(BioRad165-2336)和微載體固定器(macrocarrierholders)(BioRad1652322)被浸泡在70％的乙醇中并風(fēng)干。DriRite干燥劑被置于小培養(yǎng)皿(6cmPyrex)中并被用Whatman濾紙覆蓋。該含有微載體(BioRad165-2335)的微載體固定器被平放于濾紙上面，將培養(yǎng)皿蓋重新放回去。通過加入60mg鎢M-10粒子(微載體，0.7微米，BioRad#1652266)到Eppendorf管中，制備鎢粒子懸浮液。加入1ml乙醇(100％)。在乙醇溶液中渦旋(votex)鎢并使其被浸泡15分鐘。Eppendorf管以最大速度短暫地被微量離心(microfuge)，以沉淀鎢。輕輕倒出乙醇并用無菌蒸餾水洗滌3次。在水洗滌液被第三次輕倒出后，鎢被重懸在1ml無菌50％甘油中。至少每2周配制新鮮鎢。對于每個轉(zhuǎn)化，通過加入25μl懸浮鎢到1.5mlEppenderf管而制備轉(zhuǎn)化反應(yīng)物。隨后順序加入0.5-5μlDNA(Xbal消化的表達(dá)盒)、25μl2.5MCaCl2、10μl0.1M亞精胺。該反應(yīng)物被連續(xù)渦旋5-10分鐘，保持鎢被懸浮。然后，Eppendorf管被短暫地微量離心并輕輕倒出液體。用200μl70％的乙醇洗滌鎢粒狀沉淀，短暫微量離心沉淀并被傾去液體。用200μl100％的乙醇洗滌沉淀，短暫微量離心沉淀，并被傾去液體。鎢沉淀被重懸于24μl100％的乙醇中。Eppendorf管被置于超聲水浴中15秒，且8μl等分試驗(yàn)被轉(zhuǎn)移到干燥過的微載體的中心上。該微載體在干培養(yǎng)皿中干燥。He罐被打開到1500psi。1000psi可裂膜(rupturediscs)(BioRad165-2329)被用在ModelPDS-1000/HeBiolisticParticleDeliverySystem(BioRad)。當(dāng)鎢溶液是干的，阻擋屏和微載體固定器被插入PDS-1000。含有靶里氏木霉孢子的MABA板被置于阻擋屏以下6cm。29英寸Hg的真空度被加到室上并被保持。HeBiolisticParticleDeliverySystem(氦生物彈射粒子輸送系統(tǒng))開槍。使該室通風(fēng)，并且MABA被移出以于28℃培養(yǎng)直至菌落出現(xiàn)(5天)。對于這個實(shí)施例2，下面的溶液被配制，改性amds生物射彈瓊脂(MABA)每升部分I，在500mldH2O中制備1000×鹽1ml高質(zhì)量瓊脂20gpH達(dá)6.0，高壓滅菌部分II，在500mldH2O中制備乙酰胺0.6gCsCl1.68g葡萄糖20gKH2PO415gMgSO4·7H2O0.6gCaCl2·2H2O0.6gpH達(dá)4.5，0.2微米過濾除菌；放入150℃烘箱中溫?zé)幔拥江傊?，混合，倒板。室溫下保存?000×鹽每升FeSO4·7H2O5gMnSO4·H2O1.6gZnSO4·7H2O1.4gC0Cl2·6H2O1g加到1LdH2O0.2微米過濾除菌實(shí)施例3里氏木霉的PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化將孢子萌發(fā)菌絲體(在Difco馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上于30℃生長5天)的1-2cm2瓊脂塊(agarplug)接種到250ml、4擋板搖瓶中的50mlYEG(5g/L的酵母提取物，其中含20g/L葡萄糖)液體培養(yǎng)基中，并以200rpm于30-37℃溫育16-20小時。通過將搖瓶內(nèi)容物轉(zhuǎn)移進(jìn)50ml錐形管中并以2500rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘來回收菌絲體。上清液被丟棄而菌絲體沉淀被轉(zhuǎn)移到250ml、0.22mCA或PESCorning過濾瓶中，該過濾瓶含有40ml過濾過的β-D葡聚糖酶溶液。該溶液在30℃下以200rpm被溫育2小時，以產(chǎn)生原生質(zhì)體。原生質(zhì)體通過過濾收集，經(jīng)過無菌Miracloth(CalBiochem，LaJolla，CA)，進(jìn)入50ml錐形管中。通過以2000rpm離心5分鐘，沉淀原生質(zhì)體，并且丟棄上清液。用50ml1.2M山梨醇洗滌原生質(zhì)體沉淀1次；離心(2000rpm，5分鐘)并丟棄上清液。用25ml山梨醇/CaCl2洗滌沉淀。使用血球計對原生質(zhì)體進(jìn)行計數(shù)，然后通過以2000rpm離心5分鐘而被沉淀。丟棄上清液，并將原生質(zhì)體沉淀重懸于山梨醇/CaCl2中，該山梨醇/CaCl2的體積足以產(chǎn)生原生質(zhì)體濃度為1.25×108/ml的原生質(zhì)體溶液。對于每一轉(zhuǎn)化，20μg等分試樣的表達(dá)載體DNA(體積不大于20μl)被轉(zhuǎn)移到冰上的15ml錐形管中。原生質(zhì)體懸浮液(200μl)和50μlPEG溶液被加到每一管中。這被緩慢混合并在冰上孵育20分鐘。PEG(2ml)溶液被加到每一轉(zhuǎn)化管中并在室溫下孵育5分鐘。4ml山梨醇/CaCl2溶液被加入到每一管中(總體積6.2ml)并被緩慢混合。然后，2ml轉(zhuǎn)化混合物被加入到3個熔融(50℃)的上層瓊脂管中的每一個。每一上層瓊脂混合物被倒在單獨(dú)的轉(zhuǎn)化板上并于30℃培養(yǎng)4至7天。對于用amdS選擇的轉(zhuǎn)化，乙酰胺/山梨醇板和上層瓊脂被使用。選擇板與轉(zhuǎn)化板相同，但不含山梨醇。推定的轉(zhuǎn)化體通過轉(zhuǎn)移分離的克隆到新鮮的含乙酰胺的選擇培養(yǎng)基中而被純化。培養(yǎng)基和溶液被如下配制。1)40mlβ-D-葡聚糖酶溶液-在40ml1.2M山梨醇中溶解600mgβ-D-葡聚糖酶(InterSpexProductsInc.，SanMateo，CA)和400mgMgSO4·7H2O。2)200mlPEG混合物-在200mldlH2O中溶解50gPEG4000(BDHLaboratorySuppliesPoole，England)和1.47gCaCl2·2H2O。每月新鮮配制。3)山梨醇/CaCl2溶液-在1.2M山梨醇中溶解50mMCaCl2。4)乙酰胺/山梨醇瓊脂-部分I-在200mldlH2O中溶解了0.6g乙酰胺(Aldrich，99％升華)、1.68gCsCl、20g葡萄糖、20gKH2PO4、0.6gMgSO4·7H2O、0.6gCaCl2·2H2O、1ml1000×鹽(參見下面)，調(diào)節(jié)pH到pH5.5，用dH2O使體積達(dá)到300毫升，并過濾除菌。部分II-20g高質(zhì)量瓊脂和218g山梨醇被加到lL量筒中，用dlH2O使體積達(dá)到700毫升，并高壓滅菌。部分II被加到部分I，得到1L的最終體積。5)1000×鹽—混合5gFeSO4·7H2O、1.6gMnSO4·H2O、1.4gZnSO4·7H2O、1gCoCl2·6H2O，并用dlH2O使體積達(dá)到1L。過濾除菌。實(shí)施例4黑曲霉的PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化從孢子萌發(fā)黑曲霉板取出2cm2瓊脂塊，接種到250ml、4擋板搖瓶中的50mlYEG(5g/L含20g/L葡萄糖的酵母抽提物)液體培養(yǎng)基中。將瓊脂塊以200rpm于30-37℃培養(yǎng)16-20小時，菌絲體通過無菌Miracloth濾器被收集并且用溶液A(SolutionA)洗滌。洗滌過的菌絲體被無菌轉(zhuǎn)移到40ml原生質(zhì)體化溶液(protoplastingsolution)中并于30℃以200rpm培養(yǎng)1-2小時，原生質(zhì)體化進(jìn)展被顯微監(jiān)測。原生質(zhì)體化反應(yīng)物通過無菌Miracloth被過濾到2個50ml無菌一次性離心管中并用溶液B(SolutionB)使每一管的體積達(dá)到45毫升。在2500rpm下離心原生質(zhì)體5分鐘，以獲得沉淀，并丟棄上清液。用20ml體積的溶液B又洗滌沉淀2次。該沉淀被重懸在10ml的溶液B中，并使用血球計進(jìn)行計數(shù)。原生質(zhì)體被再次離心并丟棄上清液。原生質(zhì)體被重懸在溶液B中，以獲得～1×107/100μl。在冰上，100μl原生質(zhì)體溶液被加入到預(yù)冷的15ml管中，每一轉(zhuǎn)化一管。10μgDNA以不超過10μl的體積被加入。加入溶液C(12.5μl)，緩慢混合，并在冰上孵育20分鐘。MMS上層瓊脂(每一轉(zhuǎn)化3管各10ml)被熔融并保持在55℃。從冰上移走原生質(zhì)體并且溶液C(1ml)和溶液B(2ml)被加入到被每個管中并緩慢混合所述管。1ml原生質(zhì)體混合物被加入到3個上層瓊脂管中的每一個并且所述上層瓊脂被倒在MMS板上。對于每一轉(zhuǎn)化，這被重復(fù)，并且板于30℃被孵育4-7天。溶液A(SolutionA)(每500ml)-0.44gK2HPO4、0.34gKH2PO4、48.156g無水MgSO4(FW120.37)；以及加入dlH2O，達(dá)到500ml的最終體積，pH5.5。過濾除菌并在室溫下儲藏。原生質(zhì)體化溶液-在40ml溶液A中溶解了180單位β-D-葡聚糖酶(InterSpexProducts，Inc)。0.2微米，過濾除菌。溶液B(SolutionB)(每500ml)-5ml1MTris，pH7.5；2.77gCaCl2(FW110.99)；109.32g山梨醇(FW182.2；1.2M)；以及加入dlH2O，達(dá)到500ml的最終體積。過濾除菌并在室溫下儲藏。溶液C(SolutionC)(每500ml)-250gPEG4000；2.77gCaCl2；5ml1MTris，pH7.5；以及加入dlH2O，達(dá)到500ml的最終體積。過濾除菌。MMS瓊脂*-在1LdlH2O中溶解6g/LNaNO3；0.52g/LKCl；1.52g/LKH2PO4；218.5g/LD-山梨醇；1ml/L痕量元素(參見下面)；10g/L瓊脂(上層瓊脂中的低熔點(diǎn)瓊脂糖)。高壓滅菌。滅菌后，無菌加入到10ml50％葡萄糖和1.25ml20％MgSO4·7H2O中。*表示amdS選擇，用0.59g/L乙酰胺和3.4g/LCsCl代替MMS中的硝酸鹽。痕量元素溶液在250mldlH2O中溶解，1g/LFeSO4·7H2O8.8g/LZnSO4·7H2O0.4g/LCuSO4·5H2O0.15g/LMnSO4·4H2O0.1g/LNa2B4O7·10H2O50mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O混合并加入0.2ml濃HCl以溶解。用dlH2O使體積達(dá)到1L。過濾除菌。實(shí)施例5用asaA基因轉(zhuǎn)化的里氏木霉的發(fā)酵和在里氏木霉克隆中的活性測定一般地，遵照Foremanetal.(Foremanetal.(2003)J.Biol.Chem27831988-31997)中所述的發(fā)酵步驟。更具體地，對于圖5所示菌株的每一個，進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。將0.8L含有5％葡萄糖的Vogels基本培養(yǎng)基(Davisetal.，(1970)METHODSINENZYMOLOGY17A，第79-143頁和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONSOFAMODELORGANISM，OxfordUniversityPress，(2000))接種1.5ml冷凍孢子懸浮液。48小時后，每一培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到在14LBiolafitte發(fā)酵罐中的6.2L相同培養(yǎng)基中。該發(fā)酵罐在每分鐘8標(biāo)準(zhǔn)升的空氣流下于25℃以750PRM運(yùn)行。初始葡萄糖被消耗完后1小時，25％(w/w)乳糖進(jìn)料被啟動并且以碳限制模式進(jìn)料，以防止乳糖堆積。分別使用葡糖氧化酶測定試劑盒或帶有加入的以切割乳糖的β-半乳糖苷酶的葡糖己糖激酶測定試劑盒，監(jiān)測葡萄糖和乳糖的濃度(InstrumentationLaboratoryCo.，Lexington，MA)。定期取樣，以監(jiān)測發(fā)酵進(jìn)展。收集的樣品在InternationalEquipmentCompany(NeedhamHeights，MA)醫(yī)用離心機(jī)上于50ml離心管中以3/4速度旋轉(zhuǎn)。在具有MOPS(嗎啡啉丙磺酸)SDS運(yùn)行緩沖液(runningbuffer)和LDS樣品緩沖液的還原條件下，使樣品上清液進(jìn)行4-12％BIS-TRISSDS-PAGE凝膠試驗(yàn)(圖5)。實(shí)施例6天然和重組的具有GSH活性的白曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asaA)的pH穩(wěn)定性的比較在pH4.5下用20mM醋酸鹽緩沖液將如上所述的重組產(chǎn)生的asaA(Tr-asaA)樣品和天然asaA樣品稀釋到相同的蛋白質(zhì)濃度。反應(yīng)在3至7的pH水平下于50℃在100mM檸檬酸/NaOH緩沖液中進(jìn)行30分鐘。1.0mL的反應(yīng)物被加到樣品管中5mL10％玉米淀粉(CargillFoods，MN)中，該玉米淀粉在100mM、pH4.5的醋酸鹽中。管于50℃被振蕩20分鐘。然后，加入0.5mL2.0％NaOH。管被旋轉(zhuǎn)并且使用二硝基水楊酸分析法(DinitoSalicylicAcid(DNS)Assay)(Gotoetal.，(1994)，見上文)測定0.5ml上清液的還原糖。結(jié)果被描述在圖6中。r-asaA在pH3.9下表現(xiàn)出100％的殘余活性。比較之下，n-asaA在pH4.5下表現(xiàn)出100％的殘余活性。實(shí)施例7在未蒸煮過的整粒粉碎玉米粉(wholegroundcorn)底物的同步糖化發(fā)酵(SSF)期間Tr-asaA濃度的影響在來自無細(xì)胞培養(yǎng)物濾液的葡糖淀粉酶(GA)的兩個水平(0.5和1.0GAU/g)下評價Tr-asaA。百分之三十六的玉米面粉淤漿被制備，其含有干玉米浸漬液(drycornsteep)(占玉米面粉的2.5％)。用稀硫酸調(diào)節(jié)該淤漿的pH到4.8。淤漿的總干固體是33.85％。在含有100gm醪液(mash)(淤漿)的125ml燒瓶中進(jìn)行發(fā)酵。期望水平的酶被加入，然后，3ml增殖的酵母淤漿被加入，以起動發(fā)酵。通過加入0.26gm的干Fali酵母到100gm含有GA活性為0.9GAU/g原材料固體的醪液中，制備酵母接種物。該淤漿被置于32℃的水浴中并緩慢混合約17小時。在不同的時間間隔，取出發(fā)酵樣品(發(fā)酵醪)，進(jìn)行HPLC分析。72小時后，終止發(fā)酵并且發(fā)酵醪于60℃干燥，以獲得DDGS。測定DDGS的淀粉含量，并且通過加入碘，抽樣調(diào)查終止發(fā)酵后發(fā)酵醪中的不可溶固體。在該研究中所使用的酶是黑曲霉GA。表1總結(jié)了乙醇水平、醪液固體的碘染和DDGS的淀粉百分比。表1在酵母發(fā)酵條件下顆粒玉米淀粉轉(zhuǎn)化成乙醇期間asaA的效應(yīng)表1中所示的結(jié)果證實(shí)了Tr-asaA增強(qiáng)葡糖淀粉酶對顆粒玉米淀粉的水解。實(shí)施例8通過葡糖淀粉酶和α淀粉酶的顆粒淀粉底物的轉(zhuǎn)化在0.5GAU/gds的葡糖淀粉酶存在下，在同步糖化發(fā)酵條件下，不同來源的商業(yè)α淀粉酶被與Tr-asaA比較。使用在前所述的可溶性淀粉底物(solublestarchsubstrate(SSU))法試驗(yàn)，測定商業(yè)α淀粉酶的活性。表2**表示重組菌使用如實(shí)施例7所述的整粒粉碎玉米進(jìn)行乙醇發(fā)酵。來自表2所列來源的α淀粉酶以每克整玉米1.0SSU被加入，并且葡糖淀粉酶以0.5GAU/g被加入。在發(fā)酵過程期間，取樣并分析乙醇含量(圖7)。在發(fā)酵之后，不可溶固體(DDGS)被分離并且玉米醪液的殘留淀粉含量在pH5.0下被測定。結(jié)果總結(jié)于表3中。表3平均(Ave)％v/vEtOH表3中的結(jié)果清楚地顯示出Tr-asaA在幫助葡糖淀粉酶在使用酵母的乙醇發(fā)酵條件下水解顆粒淀粉中是非常有效的。另外，如從表中所觀察，在使用本發(fā)明的酶組合時，在發(fā)酵中所產(chǎn)生的乙醇百分比(18.44)較大；并且DDGS中殘留淀粉百分比(9.0)顯著較低。實(shí)施例9在使用Tr-asaA的乙醇發(fā)酵中整粒磨碎小麥(wholegroundwheat)的評價干玉米浸漬液被以基于整粒磨碎小麥重量為2.5％被加入到36％整粒磨碎小麥淤漿中。在含有100gm醪液的125ml燒瓶中進(jìn)行發(fā)酵。用稀硫酸將淤漿的pH調(diào)到4.8。醪液被稀釋到33.85％ds的終濃度。葡糖淀粉酶(0.5GAU/g磨碎小麥)和asaA(1.0SSU/g整粒磨碎小麥)被加到醪液中。隨后加入3.0ml繁殖的酵母，以起動發(fā)酵。通過加入0.26gm的干Fall酵母到100gm的醪液中，制備酵母接種物。在溫和攪拌的同時于32℃水浴中進(jìn)行發(fā)酵。在不同的時間間隔取出發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵醪)，離心，以進(jìn)行糖類組成和乙醇的HPLC分析(表4)。表4用于乙醇生產(chǎn)的酵母發(fā)酵中的整粒磨碎小麥顆粒淀粉實(shí)施例10底物處理對乙醇產(chǎn)量和含固體干酒糟(DDGS)組成的影響對于燃料醇發(fā)酵，使用錘磨機(jī)，使整玉米底物經(jīng)受常規(guī)的干滾工藝，以減小顆粒大小。制備3種不同的醪液。處理1(Treatment1(Trt1))是高溫處理，其包括根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)步驟，通過噴射蒸煮(jetcooking)，在pH5.6下，用3.5U/gSPEZYMEETHYL分批液化36％ds的、含有0.9％干玉米浸漬液(drycornsteep(DCS))的玉米面粉。該淤漿被置于90℃的浴中1.5小時，混合，然后冷卻到30℃，用稀硫酸將pH調(diào)節(jié)到5.0。用水進(jìn)一步稀釋淤漿到32.71％ds。處理2(Treatment2(Trt2))是低溫處理。通過于60℃，用稀硫酸將pH調(diào)節(jié)到5.0，溫育36％ds的、含有0.9％DCS的玉米面粉3小時而制備醪液。在溫育之前，加入0.05GAU/g葡糖淀粉酶。處理3(Treatment3(Trt3))是室溫處理—在將玉米淤漿用在與0.5GAU葡糖淀粉酶/g玉米和1.0SSU/g玉米的Tr-asaA的發(fā)酵之前，在室溫下獲得玉米淤漿。然后，對每一處理進(jìn)行如實(shí)施例7所述的酵母發(fā)酵。在發(fā)酵后，測定乙醇產(chǎn)量并通過離心分離每一處理的不可溶固體，于60℃干燥，并且測定總糖類含量和氮含量。結(jié)果在表5中被說明，其中Trt3是本發(fā)明包括的方法。表5在使用酵母的乙醇發(fā)酵條件下整玉米的不同處理的乙醇產(chǎn)量和DDGS組成的比較如從表5示出的結(jié)果所觀察到，根據(jù)本發(fā)明的方法(Trt3)所處理的DDGS中的殘留淀粉百分比小于得自現(xiàn)有技術(shù)處理(Trt1)或低溫處理(Trt2)的殘留淀粉百分比。值是3.5％(Trt3)，相對于Trt1和Trt2的4.8％或3.8％。相比于現(xiàn)有技術(shù)處理(Trt1)，根據(jù)本發(fā)明的Trt3所產(chǎn)生的DDGS的總蛋白含量和乙醇的量較高。實(shí)施例11顆粒玉米淀粉與純化的白曲霉α淀粉酶和純化的黑曲霉葡糖淀粉酶的溫育酶純化采用使用AkTA(AmershamPharmacia，Biotech.，NJ)的制備型高壓液相色譜(HPLC)法，黑曲霉葡糖淀粉酶(GA)和白曲霉α淀粉酶(AkAA)都從培養(yǎng)物濾液被純化。在典型的試驗(yàn)中，使用離心柱(Bio-Rad，CA)，用10mMMES緩沖液(pH5.75)使兩個粗酶樣品脫鹽，以降低電導(dǎo)率。使樣品達(dá)到2MNH4SO2。上樣到Q-Sepharose柱(Amersham，Biosciences，NJ)并用20mMMES緩沖液(pH5.75)稀釋，使用1.5MKCl梯度。具有相應(yīng)活性的部分被合并在一起并被濃縮，用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。顆粒玉米淀粉和純化酶溫育純化酶制備物被如下加入到0.1M醋酸鹽緩沖液(pH4.5)中的4.0％顆粒玉米淀粉(Cargill，Minneapolis，MN)，用于掃描電子顯微鏡(SEM)分析。在32℃下孵育0.5GAU/g玉米淀粉的純化GA、1.0SSU/g淀粉的純化AkAA和組合的GA和AkAA并溫和攪拌。在2、4和8小時的時間間隔時取出等分試樣(0.75ml)，離心并且通過上面的實(shí)施例中所述的方法測定可溶性糖。沉淀被重懸于蒸餾水(5ml)并被離心。沉淀再次重懸于5ml無水乙醇(99％)中，攪拌以均勻混合并離心。醇處理的沉淀在管中被風(fēng)干并用于SEM分析。SEM分析約200μl干體積被轉(zhuǎn)移到1.5mlEppendorf管并且加入0.8ml無水乙醇。組分被渦旋以制備淀粉顆粒懸浮液。幾滴懸浮液被置于剛清潔過的玻璃蓋片上并被風(fēng)干。碳粘合膠片(carbonadhesivetabs)將蓋片安放在樣品臺上，用膠體銀粘合劑(ElectronMicroscopySciences，F(xiàn)t.Washington，PA)在蓋片四周圍圍涂抹并在ScanCoatSixSputterCoater(EdwardsHighVacuumIntl.Crawley，UK)上用薄層金涂覆。使用Quanta200FEG掃描電子顯微鏡(FEIInc.，Hillsboro，Ore)，在1,000和5,000×的儀器放大倍率下，在二級電子成像模式下于5kv下進(jìn)行掃描電子顯微術(shù)。從樣品臺上不同的區(qū)域獲得8到10個圖像。單獨(dú)或結(jié)合的酶處理對于顆粒玉米淀粉的影響在圖8和9中被說明。水解和顯微檢查圖8說明了還原糖(mg/ml還原當(dāng)量)，其被測定為4小時后所釋放出的葡萄糖，所述釋放出的葡萄糖是AkAA和GA的顆粒淀粉水解的結(jié)果。單獨(dú)使用葡糖淀粉酶的顆粒淀粉的降解是4.9mg/ml；單獨(dú)使用AkAA的顆粒淀粉的降解僅僅是0.3mg/ml。然而，使用GA和AkAA組合的顆粒淀粉降解是12.1mg/ml。組合酶的降解值說明了協(xié)同相互作用。其顯著大于酶的加和值。使用掃描電子顯微鏡觀察如這個實(shí)施例所述處理的淀粉顆粒。如圖9所示，與純化AkAA孵育的玉米淀粉顆粒確實(shí)顯示出較小的表面改變。這些被觀察為針刺小孔。與純化GA孵育的玉米淀粉顆粒顯示出許多小的有限范圍的深孔。顯著地，與GA和AkAA組合孵育的玉米淀粉顆粒顯示出無數(shù)寬的和深的穿透腔。另外，在與GA和AkAA組合孵育的顆粒中觀察到暴露了顆粒中心的層化結(jié)構(gòu)的表面腐蝕。實(shí)施例12顆粒玉米淀粉淤漿的干固體百分含量對乙醇產(chǎn)量的影響用水使玉米面粉漿化，獲得36％ds的醪液(mash)。在用硫酸將pH調(diào)節(jié)到4.5之前，小量玉米浸漬液(淤漿(slurry)的0.2％)被與400ppm(0.04％)脲一起被加入到醪液中。淤漿的干固體含量從20至36％ds被調(diào)節(jié)。在含有總共100g醪液的125ml燒瓶中進(jìn)行發(fā)酵。酶被稀釋，使得對于每一種酶使用恒定體積0.5ml。每一燒瓶與3ml酵母孵育，酵母在使用前繁殖17小時。酵母繁殖步驟包括在32℃水浴中溫和混合時將0.5％干Fali酵母加入到含0.5GAU/gGA和1.5SSU/gAkAA的25％ds醪液中。在約24小時的時間間隔下于60℃干燥發(fā)酵醪樣品，以獲得DDGS。表6DS含量對在75小時下乙醇產(chǎn)量和DDGS中殘留淀粉的影響幾乎所有在發(fā)酵期間產(chǎn)生的葡萄糖(DP-1)都被轉(zhuǎn)化成乙醇，除了在高固體下(數(shù)據(jù)未示出)。對于每一個測試的％DS，AkAA增加了乙醇的速率和量。圖10A總結(jié)了在每一固體水平下的最終乙醇水平，而圖10B顯示了對于每一固體水平，相對于醪液固體，使用AkAA的乙醇增加百分比。兩個圖證實(shí)了AkAA對水解顆粒淀粉尤其在高固體百分含量下具有正面效應(yīng)。在圖10A中還觀察到，當(dāng)溶解的固體增加，有AkAA和無AkAA的殘留淀粉的差別也增加。如在圖10B所觀察到，當(dāng)玉米淤漿中％ds增加時，AkAA對乙醇產(chǎn)量的影響也增加。表6和圖11的結(jié)果清楚顯示了在本發(fā)明的方法中使用AkAA和GA組合物的益處。在所有情況下，當(dāng)AkAA與GA結(jié)合使用時，DDGS中的淀粉百分比下降，并且進(jìn)一步地，當(dāng)相比于未添加AkAA的DDGS中的淀粉百分比時，在來自具有高至36％的％ds的玉米淀粉底物的DDGS中發(fā)現(xiàn)的淀粉百分比被減半。權(quán)利要求1.顆粒淀粉水解酶組合物，包括a)具有顆粒淀粉水解活性的、并與氨基酸序列SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)；和b)葡糖淀粉酶。2.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中所述asAA與葡糖淀粉酶活性的比率為10∶1至1∶10。3.權(quán)利要求2所述的酶組合物，其中所述asAA與葡糖淀粉酶活性的比率為5∶1至1∶5。4.權(quán)利要求3所述的酶組合物，其中所述asAA與葡糖淀粉酶活性的比率為4∶1至1∶2。5.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中所述asAA在木霉屬(Trichoderma)宿主中產(chǎn)生。6.權(quán)利要求5所述的酶組合物，其中所述木霉屬宿主是里氏木霉(T.reesei)。7.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中所述asAA與SEQIDNO3有至少95％的序列同一性。8.權(quán)利要求7所述的酶組合物，其中所述asAA與SEQIDNO3有至少98％序列的同一性。9.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中所述酶組合物，在合適的發(fā)酵條件下，在發(fā)酵中被同時與顆粒淀粉底物淤漿和產(chǎn)乙醇微生物混合，以產(chǎn)生醇。10.權(quán)利要求9所述的酶組合物，其中所述顆粒淀粉底物得自玉米、小麥或者水稻。11.權(quán)利要求10所述的酶組合物，其中其中所述顆粒淀粉底物得自玉米。12.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中所述葡糖淀粉酶從黑曲霉(Aspergillusniger)菌株產(chǎn)生。13.權(quán)利要求1所述的酶組合物，進(jìn)一步包括第三種酶。14.權(quán)利要求13所述的酶組合物，其中所述第三種酶選自蛋白酶、支鏈淀粉酶和纖維素酶。15.顆粒淀粉水解酶組合物，包括具有顆粒淀粉水解活性、并與氨基酸序列SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)。16.發(fā)酵培養(yǎng)基，包括從木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生的具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，所述木霉屬細(xì)胞包括編碼與SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性的asAA的異源多核苷酸。17.權(quán)利要求16所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述木霉屬細(xì)胞是里氏木霉(T.reesei)。18.權(quán)利要求16所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述多核苷酸編碼與SEQIDNO3具有至少95％序列同一性的asAA。19.在絲狀真菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)的方法，包括a)用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化絲狀真菌宿主細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建物包括在所述絲狀真菌宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動子，所述啟動子可操縱性連接到編碼具有GSH活性并與SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性的asAA的異源多核苷酸，b)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的絲狀真菌宿主細(xì)胞，以允許所述asAA的表達(dá)，和c)產(chǎn)生所述asAA。20.權(quán)利要求19所述的方法，進(jìn)一步包括回收所產(chǎn)生的asAA。21.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述木霉屬細(xì)胞是里氏木霉(T.reesei)細(xì)胞。23.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述asAA與SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性。24.根據(jù)權(quán)利要求21獲得的木霉屬細(xì)胞。25.作為終產(chǎn)物的乙醇的生產(chǎn)方法，包括使權(quán)利要求1所述的酶組合物與顆粒淀粉底物組合；并且，在合適的發(fā)酵條件下、并于25至40℃的溫度下，同時用產(chǎn)乙醇微生物發(fā)酵以及產(chǎn)生乙醇。26.權(quán)利要求25所述的方法，進(jìn)一步包括回收所述乙醇。27.作為終產(chǎn)物的乙醇的生產(chǎn)方法，包括同期使權(quán)利要求15所述的酶組合物與顆粒淀粉底物和葡糖淀粉酶組合；并且，在合適的發(fā)酵條件下，同時用產(chǎn)乙醇微生物發(fā)酵以及產(chǎn)生乙醇，所述合適的發(fā)酵條件包括25℃至40℃的溫度。28.權(quán)利要求27所述的方法，進(jìn)一步包括回收所述乙醇。29.作為終產(chǎn)物的醇的生產(chǎn)方法，包括使顆粒淀粉底物與i)葡糖淀粉酶；ii)具有顆粒淀粉(GSH)活性并與SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，和iii)微生物在合適的發(fā)酵條件下在一步中接觸，以獲得具有5至30％的醇的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述發(fā)酵是在20℃至60℃的溫度下進(jìn)行。30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述溫度是25℃至40℃。31.權(quán)利要求29所述的方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中分離所述醇。32.權(quán)利要求31所述的方法，進(jìn)一步包括從所述分離步驟獲得釜餾物副產(chǎn)物。33.權(quán)利要求32所述的方法，進(jìn)一步包括再循環(huán)步驟，其中所述釜餾物的成分被再循環(huán)用于另一個發(fā)酵循環(huán)中。34.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述釜餾物被分離成可溶性成分和不溶性成分。35.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述顆粒淀粉底物得自玉米、小麥或水稻。36.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述顆粒淀粉底物，在與所述葡糖淀粉酶和asAA接觸之前，被漿化；并具有20％至45％的干固體含量。37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述干固體含量是30％至40％。38.權(quán)利要求29所述的方法，其中來自所述顆粒淀粉底物的淀粉固體的至少50％是在2至100小時后被水解。39.權(quán)利要求29所述的方法，其中在所述發(fā)酵中使用的葡糖淀粉酶的量是0.01至5.0GAU/g。40.權(quán)利要求29所述的方法，其中在所述發(fā)酵中使用的asAA的量是0.1至5.0SSU/g。41.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述微生物是乙醇生產(chǎn)微生物。42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述乙醇生產(chǎn)微生物是酵母。43.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述醇終產(chǎn)物是乙醇。44.權(quán)利要求43所述的方法，其中所產(chǎn)生乙醇在5％至20％之間。45.從顆粒玉米淀粉底物生產(chǎn)乙醇的方法，包括在合適的發(fā)酵條件下，使顆粒玉米淀粉淤漿與i)葡糖淀粉酶；ii)具有顆粒淀粉(GSH)活性并與SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)，和iii)產(chǎn)乙醇微生物在一步中于25-40℃的溫度下發(fā)酵，以獲得具有5至20％的乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基。46.權(quán)利要求45所述的方法，其中測量為活性的asAA與GA比率為10∶1至1∶10。47.權(quán)利要求46所述的方法，其中測量為活性的asAA與GA比率為5∶1至1∶5。48.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述顆粒玉米淀粉具有25-40％的干固體含量(ds)。49.權(quán)利要求45所述的方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中分離所述乙醇。50.降低含固體干酒糟(DDGS)中殘留淀粉含量的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法產(chǎn)生醇、從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離所述醇從而得到釜餾物、以及將所述釜餾物轉(zhuǎn)化成DDGS。51.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述顆粒淀粉底物具有約25％至40％的ds。52.權(quán)利要求50所述的方法，其中在所述DDGS中的所述殘留淀粉含量為15％以下。53.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述顆粒淀粉底物是來自玉米。全文摘要本發(fā)明涉及顆粒淀粉水解酶組合物，其包括具有顆粒淀粉水解活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生醇的一步法，其包括使顆粒淀粉底物與具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酸穩(wěn)定性α淀粉酶(asAA)和葡糖淀粉酶(GA)在發(fā)酵步驟中接觸，以獲得具有5％至20％的乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)液，所述發(fā)酵步驟在25至40℃的溫度下還包括產(chǎn)乙醇微生物。文檔編號C12N9/34GK1981037SQ200480043512公開日2007年6月13日申請日期2004年11月30日優(yōu)先權(quán)日2004年5月27日發(fā)明者N·迪恩-科萊曼,O·小蘭特羅,J·K·希泰,S·E·蘭茨,M·J·佩普森申請人:金克克國際有限公司