專利名稱：K－ras寡核苷酸微型陣列及用其檢測(cè)K－ras突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在K-ras基因突變熱點(diǎn)區(qū)域檢測(cè)突變的一種K-ras寡核苷酸微型陣列、其制造方法以及用其檢測(cè)K-ras突變的一種方法。
背景技術(shù)：
K-ras是在各種癌癥中經(jīng)過突變的ras基因的一種。在密碼子12和13的K-ras基因突變參與腫瘤發(fā)生，其引起p21-ras蛋白質(zhì)(一種K-ras基因產(chǎn)物)的功能修飾，使過度增長(zhǎng)信號(hào)傳到細(xì)胞核，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂。K-ras突變?cè)谝劝┑陌l(fā)生率約為90％，在結(jié)腸直腸癌的發(fā)生率約為50％，在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生率約為30％，其突變概圖表明85％左右的突變發(fā)生在密碼子12和13(Samowitz WS等人，CancerEpidemiol.Biomarkers Prev.91193-1197，2000)。因此，K-ras基因突變的辨別已廣泛用作癌癥診斷的有用工具，例如，胰癌、結(jié)腸直腸癌和非小細(xì)胞肺癌，而研究認(rèn)為其可能同一些腫瘤表型有關(guān)(SamowitzWS等人，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.91193-1197，2000；Andreyev HJ等人，BR.J.Cancer 85692-696，2001；以及Brink M等人，Carcinogenesis 24703-710，2003)。然而，這種研究通常需要大量的樣品以找出K-ras突變和某些臨床特征之間的有意義的聯(lián)系(Andreyev HJ等人，Br.J.Cancer 85962-696，2001)，在流行病學(xué)領(lǐng)域有著對(duì)高生產(chǎn)量技術(shù)的需求，例如，一種寡核苷酸微型陣列可以準(zhǔn)確、快速地處理大量的樣品。
具有突變熱點(diǎn)的K-ras基因(密碼子12和13)已被用作靶基因來測(cè)試新突變檢測(cè)技術(shù)，例如“DNA芯片”。然而，以前的研究使用專門的硅裝置或復(fù)雜的方案以改善其系統(tǒng)(Lopwz-Crapez E等人，Clin.Chem.47186-192，2001；Prix L等人，Clin.Chem.48428-435，2002)，現(xiàn)在這些裝置或方案不適于對(duì)大量樣品作準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的評(píng)估。
所以，本發(fā)明開發(fā)了一種K-ras寡核苷酸微型陣列，其通過使用一個(gè)自動(dòng)微型陣列在固體矩陣表面固定寡核苷酸而制得，寡核苷酸被設(shè)計(jì)成檢測(cè)K-ras基因突變熱點(diǎn)區(qū)域的各種突變，以及其使用一種稱為競(jìng)爭(zhēng)性DNA雜交(CDH)的新的雜交法，以便提高效率和產(chǎn)能。本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列可被用于研究中，以檢測(cè)K-ras突變并解釋信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和同K-ras基因相關(guān)的腫瘤發(fā)生。
發(fā)明概述因而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種寡核苷酸微型陣列，其可被用作快速、可靠的基因診斷裝置，以研究信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和同K-ras基因相關(guān)的腫瘤發(fā)生以及檢測(cè)K-ras突變。
根據(jù)本發(fā)明所述的一個(gè)方面，提供了一種用以檢測(cè)K-ras突變的寡核苷酸微型陣列，其包含多種固定在固體矩陣表面的寡核苷酸，其中寡核苷酸被設(shè)計(jì)成檢測(cè)在K-ras基因突變熱點(diǎn)的錯(cuò)義突變型，所述寡核苷酸包括具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列的野生型和具有SEQ IDNOs2-10核苷酸序列的在密碼子12上的錯(cuò)義突變型，以及具有SEQ IDNO.11的核苷酸序列的野生型和具有SEQ ID NOs12-20核苷酸序列的在密碼子13上的錯(cuò)義突變型。
因而，根據(jù)本發(fā)明所述另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)K-ras突變的方法。


本發(fā)明上述以及其他目的和特征從下述發(fā)明描述并結(jié)合附圖清晰可見；圖1a-1e說明使用本發(fā)明所述寡核苷酸微型陣列在結(jié)腸癌組織中檢測(cè)K-ras突變時(shí)使用或不使用CDH方法的結(jié)果；1aD231-對(duì)照， 1bD231-CDH，1cD281-對(duì)照， 1dD281-CDH1e癌癥患者的正常組織發(fā)明詳述本發(fā)明提供了檢測(cè)K-ras突變的一種寡核苷酸微型陣列，包括使用自動(dòng)微型陣列儀固定在固體矩陣表面的寡核苷酸，其中寡核苷酸能夠檢測(cè)K-ras基因突變熱點(diǎn)區(qū)域的各種突變。
首先，寡核苷酸被設(shè)計(jì)成檢測(cè)在K-ras基因突變熱點(diǎn)區(qū)域的密碼子12和13的各種可能的錯(cuò)義突變。
具體地說，通過分別用TGT(半胱氨酸)、AGT(絲氨酸)、CGT(精氨酸)、GAT(門冬氨酸)、GCT(丙氨酸)、GTT(纈胺酸)、GGA(甘氨酸)、GGG(甘氨酸)、GGC(甘氨酸)替代GGT(甘氨酸)獲得的九種替代寡核苷酸用于密碼子1。通過分別用CGC(精氨酸)、AGC(絲氨酸)、TGC(半胱氨酸)、GCC(丙氨酸)、GAC(門冬氨酸)、GTC(纈胺酸)、GGT(甘氨酸)、GGA(甘氨酸)、GGG(甘氨酸)替代GGC(甘氨酸)獲得的九種替代寡核苷酸用于密碼子12。
根據(jù)本發(fā)明所述一個(gè)方面，本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列有18種點(diǎn)樣和固定在固體矩陣表面上的寡核苷酸，寡核苷酸能檢測(cè)在K-ras基因兩個(gè)熱點(diǎn)密碼子的各種錯(cuò)義突變。九種寡核苷酸(M)被設(shè)計(jì)成包含在各個(gè)熱點(diǎn)密碼子上的所有可能的替代，而一種寡核苷酸(W)用于野生型。這樣，共有18種寡核苷酸被用以檢測(cè)密碼子12和13的錯(cuò)義突變。
一種野生型寡核苷酸(W)使各種密碼子直接與突變類型比較，其包括純合和雜合的突變。例如，10種寡核苷酸被點(diǎn)樣于密碼子12，其中一種是正常的堿基序列，而其他九種則是突變的堿基序列。總的說來，18種突變物寡核苷酸被設(shè)計(jì)成用于兩個(gè)熱點(diǎn)密碼子的18個(gè)錯(cuò)義突變類型，2個(gè)寡核苷酸用于野生型和陽性對(duì)照。每個(gè)寡核苷酸被水平四倍點(diǎn)樣，以提高被測(cè)信號(hào)的精度，這樣導(dǎo)致了總共點(diǎn)樣80個(gè)寡核苷酸。由于本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列有三套獨(dú)立點(diǎn)樣于固體矩陣表面上的80個(gè)寡核苷酸，它能與三種不同的樣品同時(shí)雜交。
本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)上述K-ras基因突變熱點(diǎn)密碼子12和13上的所有可能突變，這些突變?cè)谒锌疾爝^的案例中以85％以上的頻率出現(xiàn)。此外，由于用于本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列的寡核苷酸被用于檢測(cè)在兩種密碼子上的所有可能的錯(cuò)義突變，它能檢測(cè)這些密碼子上未被發(fā)現(xiàn)的任何錯(cuò)義突變。這就是說，考慮到基因特性，由于本發(fā)明所述寡核苷酸被設(shè)計(jì)成專門用于檢測(cè)K-ras基因熱點(diǎn)區(qū)的突變，本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列提供了檢測(cè)K-ras基因突變的改善的精度和效率。
本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列可以通過使用自動(dòng)微型陣列在固體矩陣表面上固定多達(dá)80個(gè)寡核苷酸而制成，其包含下述步驟1)將每個(gè)寡核苷酸混合在一種微型點(diǎn)樣溶液中并分布到一個(gè)孔板內(nèi)；2)用一個(gè)微型陣列將寡核苷酸點(diǎn)樣在固體矩陣表面上；3)在固體矩陣表面固定寡核苷酸并沖洗；4)將固體矩陣浸泡在95攝氏度水中，使固定的寡核苷酸變性，然后用一種硼氫化鈉溶液處理固體矩陣；和5)沖洗并干燥固體矩陣。
用于步驟(1)中的每個(gè)寡核苷酸優(yōu)選有一個(gè)功能基團(tuán)，其可被用于與固體矩陣表面形成一個(gè)穩(wěn)定的鍵。例如，每個(gè)寡核苷酸可以連接一個(gè)12碳間隔團(tuán)，該間隔團(tuán)有一個(gè)5’氨基修飾，如H2N-(CH2)12-寡核苷酸。這個(gè)胺基團(tuán)和固體矩陣的一個(gè)醛基團(tuán)進(jìn)行希夫堿反應(yīng)(Schiff’sbase reaction)，以在兩者之間形成一個(gè)堅(jiān)硬的鍵。12碳間隔團(tuán)有助于使寡核苷酸和一個(gè)熒光染料標(biāo)記的靶DNA進(jìn)行接觸，從而提高雜交率。
用于步驟(1)中的微型點(diǎn)樣溶液可以包括適當(dāng)?shù)柠}和聚合物，以保證固體矩陣上寡核苷酸的使用。
用于步驟(2)中的固體矩陣可以用玻璃、改性的硅樹脂、塑料盒或如聚碳酸酯或其凝膠之類的聚合物組成。固體矩陣表面可以涂有化學(xué)成分的化合物，其可將寡核苷酸和矩陣基質(zhì)連接在一起。可用作這種涂料的優(yōu)選化學(xué)品具有功能基團(tuán)，如醛或環(huán)氧基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用涂有醛的玻璃滑片。
根據(jù)步驟(1)和(2)所述的一個(gè)實(shí)施方案，用自動(dòng)定位微型陣列以特殊的方式將80個(gè)寡核苷酸安置在固體矩陣上。每個(gè)寡核苷酸點(diǎn)優(yōu)選呈環(huán)形，直徑范圍為100-500微米。固體矩陣的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例是3.7cm×7.6cm玻璃滑片，其每個(gè)芯片可以容納100-10,000個(gè)點(diǎn)。優(yōu)選共80個(gè)寡核苷酸點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)直徑為130微米，可以以200-800微米的間隔安排成多行多列，優(yōu)選為300微米間隔。
在步驟(3)中，通過希夫堿反應(yīng)，在寡核苷酸胺基團(tuán)和固體矩陣醛基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，將寡核苷酸固定在固體矩陣上。用SDS(十二烷基硫酸鈉)、SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽)、SSPE(鹽-磷酸鈉-EDTA)等沖洗固體矩陣，以此去除游離未反應(yīng)的寡核苷酸。
在步驟(4)中，固定的寡核苷酸被變性，通過硼氫化鈉處理還原并失活留在固體矩陣上的未反應(yīng)醛基團(tuán)。
本發(fā)明所述的用上述方法制得的K-ras寡核苷酸微型陣列可以有利地用于檢測(cè)基因突變，本發(fā)明所述的方法比任何傳統(tǒng)的基因突變檢測(cè)方法簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)得多。如使用傳統(tǒng)方法如SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)形)、PTT(蛋白截?cái)嘣囼?yàn))、RFLP(限制內(nèi)切片段多態(tài)形)、克隆、直接測(cè)序等研究基因突變是否存在平均需花費(fèi)幾天到幾個(gè)月時(shí)間，而使用本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列分析DNA樣品的K-ras基因突變所需時(shí)間少于10或11小時(shí)。另外，本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列的制備簡(jiǎn)單得多，其生產(chǎn)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)芯片。一旦合成所需的寡核苷酸，就有可能大規(guī)模生產(chǎn)本發(fā)明的滑片。如使用本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列，所需的試劑數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于任何傳統(tǒng)方法要求的數(shù)量。
本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列容易用一個(gè)定位微型陣列制得，而現(xiàn)有的Affymetrix寡核苷酸微型陣列必須使用復(fù)雜昂貴的照相平版技術(shù)來制備。
再則，用本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列可以提純和修飾寡核苷酸，而Affymetrix寡核苷酸微型陣列是通過在固體矩陣表面上直接合成寡核苷酸而制得的，其間不能提純或修飾寡核苷酸。在本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列中，可以通過提純寡核苷酸，增加其純度以及很容易地修飾寡核苷酸來點(diǎn)樣高質(zhì)量的寡核苷酸，減少實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤?？紤]到待點(diǎn)樣寡核苷酸的質(zhì)量決定寡核苷酸微型陣列整體反應(yīng)的準(zhǔn)確度，本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列能夠提供較以往更高的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度。
本發(fā)明提供了使用K-ras寡核苷酸微型陣列檢測(cè)K-ras突變的方法，該方法包含下列步驟1)制備一個(gè)熒光染料標(biāo)記的DNA樣品；2)使標(biāo)記的DNA樣品與K-ras寡核苷酸微型陣列上的寡核苷酸斑點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)；3)沖洗反應(yīng)后的陣列，去除未結(jié)合的樣品DNA；4)利用熒光讀數(shù)器檢測(cè)特定寡核苷酸斑點(diǎn)的雜交模式；和5)檢查是否有基因突變。
在步驟(1)中，通過PCR用熒光染料標(biāo)記患者的腫瘤樣品或血樣以制備DNA樣品?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)能浖约盁晒庾x數(shù)器分析熒光染料標(biāo)記的DNA與寡核苷酸微型陣列上特定的寡核苷酸斑點(diǎn)的雜交。優(yōu)選的熒光染料包括，但不限于Cy5、Cy3、AlexaTM594氟、Texas Red、熒光素和Lissamine。
在步驟(2)中，將在步驟(1)中制備的熒光染料標(biāo)記的DNA樣品與雜交試液混合并轉(zhuǎn)送到每個(gè)寡核苷酸。這時(shí)，可以根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性DNA雜交(CDH)法進(jìn)行雜交反應(yīng)，該方法基于這樣的原理從病人得到放大的每種混合熒光染料標(biāo)記的DNA在有限數(shù)量的點(diǎn)樣寡核苷酸內(nèi)，在雜交反應(yīng)中互相競(jìng)爭(zhēng)。
至于CDH法，除了步驟(1)使用的熒光染料外，DNA樣品再被其它兩種熒光染料進(jìn)一步標(biāo)記。用于該步驟的其它熒光染料包括除步驟(1)使用的熒光染料以外所有可以買到的熒光染料。在本發(fā)明所述的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，三種熒光染料，即Cy3、Cy5、AlexaTM594氟通過分別用Cy3-、Cy5-、AlexaTM594氟標(biāo)記的dNTPs放大每個(gè)DNA樣品而引入DNA。混合各個(gè)Cy3-、Cy5-、AlexaTM594氟標(biāo)記的DNA樣品，并在一個(gè)微型陣列點(diǎn)樣區(qū)域內(nèi)雜交。雜交反應(yīng)在水蒸氣飽和的45-60攝氏度的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行三小時(shí)。
然后，沖洗微型陣列，去除未結(jié)合的樣品DNA，并予以干燥(步驟3)，運(yùn)用適當(dāng)?shù)能浖?步驟4)用熒光讀數(shù)器分析得到的熒光。根據(jù)每個(gè)熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)Cys5、Cy3和Alexa氟分別在632.8納米、543.8納米和594納米處掃描雜交的微型陣列(Lavmar L等人，Nucleic Acids Res.31e129，2003)。
在步驟(5)中確定了在99％可靠范圍的最大值作為閾值，任何熒光水平高于該閾值的信號(hào)可以被認(rèn)為突變存在呈陽性。
本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列可以有效地被用于診斷癌癥，如結(jié)腸直腸癌、胰癌、非小細(xì)胞肺癌、腺癌、鱗狀癌等。再則，本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列可以被用作研究信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和與K-ras基因有關(guān)的腫瘤發(fā)生的有效診斷工具。
以CDH方法運(yùn)用K-ras寡核苷酸微型陣列檢測(cè)K-ras突變的優(yōu)點(diǎn)如下；1)可以減少小的DNA斷片引起的非特異性結(jié)合信號(hào)，這些小斷片可能和點(diǎn)樣寡核苷酸有同一性，在雜交時(shí)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。
2)通過計(jì)算突變信號(hào)對(duì)野生型的比率來進(jìn)行突變分析(Kim IJ等人，Hardiman G編輯，Microarrays Methods and applications-nuts&bolts.Eagleville，DNA press，249-272，2003；Prix L等人，Clin.Chem.48428-435，2002)。然后本發(fā)明所述方法可以將大于閾值的比率認(rèn)做突變。所以，他們的比率越大，對(duì)做出精確的分析就越有幫助。
3)通過將標(biāo)有三種不同熒光染料的三種樣品混合，本發(fā)明所述方法可以減少試驗(yàn)成本和時(shí)間。此外，K-ras寡核苷酸微型陣列被設(shè)計(jì)成有三組獨(dú)立的寡核苷酸，因此，每個(gè)微型陣列能夠研究九(3×3)個(gè)樣品。
盡管基因型和強(qiáng)調(diào)并聯(lián)基因型的DNA匯集中已使用多個(gè)熒光團(tuán)(Lovmar L等人，Nucleic Acids Res.31e129，2003；Hirschhom JN等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9712164-12169，2000；Lindroos K等人，Nucleic Acids Res.30e70，2002)，本發(fā)明不僅使用標(biāo)記多種熒光染料的多個(gè)DNA樣品，而且使它們互相競(jìng)爭(zhēng)。此外，本發(fā)明旨在減少“crosstalk”問題，這是一種一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)在一個(gè)以上的波長(zhǎng)上被檢測(cè)出來的現(xiàn)象(Hirschhom JN等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9712164-12169，2000)。由于一些熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射光譜可能重疊，其信號(hào)可以在另一波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)發(fā)射。為了避免這種現(xiàn)象，本發(fā)明使用三種具有不同光譜的不同的熒光染料標(biāo)記的dNTPs，Cy5-dCTP、Cy3-dCTP和Alexa氟-dUTP，進(jìn)行CDH法。結(jié)果是，通過減少非特異的雜交信號(hào)，本發(fā)明所述CDH法顯示了更清晰的微型陣列的圖像(見附圖1a-1e)。。還檢測(cè)到兩種野生型信號(hào)(密碼子12和13)略有減少，原因是各個(gè)樣品的野生型DNA片段為了雜交而互相競(jìng)爭(zhēng)。但是，在三種混合樣品中少有的同型突變DNA并不競(jìng)爭(zhēng)，保留了其原有的信號(hào)。結(jié)果是，當(dāng)樣品有突變時(shí)，突變和野生型的信號(hào)比率從0.91上升到1.66(見附圖1a和1b)，從0.28上升到0.56(見附圖1c和1d)。
204個(gè)結(jié)腸直腸癌患者接受了體細(xì)胞K-ras突變存在與否的調(diào)查。結(jié)果，用K-ras寡核苷酸微型陣列在結(jié)腸直腸癌中總共認(rèn)定50個(gè)突變(50/204，24.5％)。其中，28個(gè)來自近側(cè)結(jié)腸癌(28/103，27.2％)，22個(gè)來自遠(yuǎn)側(cè)結(jié)腸直腸癌(22/101，21.8％)。上述檢測(cè)到的突變被分成四種錯(cuò)義突變，它們?cè)斐擅艽a子12和13的氨基酸變化。最常見的突變種類是密碼子13中的GGC(Gly)到GAC(Asp，21/50)的突變。其余種類是從GGT(Gly)到GAT(Asp，16/50)、GTT(Val，8/50)和TGT(Cys，5/50)的變化。
突變結(jié)果與直接測(cè)序100％一致，說明既無假陽性，也無假陰性。為了考查突變概圖和表型之間的顯著性，運(yùn)用SPSS軟件使用x2或Fisher’s精確試驗(yàn)進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析。α＝0.05定為顯著性水平。發(fā)現(xiàn)GGT到GAT的突變類型在近側(cè)結(jié)腸癌(13/28)中比遠(yuǎn)側(cè)結(jié)腸癌(3/22，p＝0.014)更普遍，這同以前的報(bào)告(Samowitz WS等人，標(biāo)記CancerEpidemiol.Biomarkers Prev.91193-1197，2000；Brink M等人，Carcinogenesis 24703-710，2003)是一致的。然而，在K-ras突變和性別、年齡、腫瘤大小、分化和TNM階段之間沒有發(fā)現(xiàn)有任何顯著性關(guān)系。
總之，已發(fā)現(xiàn)K-ras寡核苷酸微型陣列的結(jié)果正好同傳統(tǒng)的自動(dòng)測(cè)序相吻合，而根據(jù)本發(fā)明所述使用CDH法的K-ras寡核苷酸微型陣列可以增加分析多種樣品的效率。K-ras寡核苷酸微型陣列是一種敏感快速、高產(chǎn)量的系統(tǒng)，因此適用于需要大量樣品的研究，如基于人口的研究。
下述實(shí)施例和試驗(yàn)例只用于說明目的，無意限制發(fā)明的種類。
實(shí)施例1K-ras寡核苷酸微型陣列的制造18種寡核苷酸被設(shè)計(jì)成包括在K-ras基因的兩種突變熱點(diǎn)密碼子(密碼子11和12)上的一切可能的替代物，而2種寡核苷酸被用為野生型。所有寡核苷酸均為21個(gè)堿基對(duì)，各個(gè)錯(cuò)配序列位于寡核苷酸中央，如表1所示。在一個(gè)熱點(diǎn)密碼子上有錯(cuò)義突變的寡核苷酸是在密碼子12上SEQ ID NOs.2-10描述的寡核苷酸；在密碼子13上SEQ IDNOs.12-20描述的寡核苷酸。SEQ ID NOs.1和11描述的寡核苷酸是野生型。
表1

所有20個(gè)寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸在5’端有一個(gè)用胺殘基修飾的12-碳間隔團(tuán)，其可與醛基團(tuán)發(fā)生希夫堿反應(yīng)，這些寡核苷酸均從Metabion(德國)獲得，并由HPLC提純。
本發(fā)明所述K-ras寡核苷酸微型陣列由上述方法(Kim IJ等人，Hardiman G編輯，Microarrays methods and applications-nuts&bolts.Eagleville，DNApress，249-72，2003)制得。尤其是，每個(gè)寡核苷酸用一種微型點(diǎn)樣試液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)以1∶1的混合率混合，40微升的每種寡核苷酸的被轉(zhuǎn)到一個(gè)96孔板。40pmol/μl的寡核苷酸被用于密碼子12和13的點(diǎn)樣。帶電的96孔板被置于一個(gè)定位微型陣列內(nèi)后(Microsys 5100Cartesian，Cartesian TechnologiesInc，Irvine，CA)，每個(gè)寡核苷酸被印在一個(gè)涂有醛的玻璃滑片上(26×76×1mm，CEL Associates Inc，Houston，TX)。每個(gè)直徑為130μm的斑點(diǎn)以300微米的間隔被排列成多行多列。共有80(20×4)個(gè)寡核苷酸以四倍的形式排列，包括覆蓋了K-ras基因的密碼子12和13的2種野生型和18個(gè)錯(cuò)義突變型。3套寡核苷酸在一個(gè)滑片上分開點(diǎn)樣，這樣3個(gè)不同的樣品可以用一個(gè)微型陣列雜交。
用0.2％SDS沖洗點(diǎn)樣有寡核苷酸的玻璃滑片兩次，然后再用蒸餾水沖洗一次。玻璃滑片被浸泡在95度熱水中使寡核苷酸變性，然后浸泡在硼氫化鈉試液中5分鐘，失活未反應(yīng)的醛基團(tuán)。然后，用0.2％SDS清洗玻璃滑片兩次，然后再用蒸餾水清洗一次，離心，并干燥。
實(shí)施例2用K-ras寡核苷酸微型陣列研究K-ras突變(步驟1)DNA樣品的制備首爾國立大學(xué)醫(yī)院和韓國國立癌癥中心共有204名結(jié)腸直腸癌患者接受體細(xì)胞是否存在K-ras的調(diào)查。從所有病人那兒獲得了書面同意。在204個(gè)結(jié)腸直腸癌中，103個(gè)來自近側(cè)結(jié)腸(盲腸至脾彎處)，101個(gè)來自遠(yuǎn)結(jié)腸直腸(脾彎處至直腸)。再者，結(jié)腸直腸癌患者的正常組織被用作陰性對(duì)照。
使用TRI試劑(分子研究中心，美國俄亥俄州辛辛那提市)，如以前所述(Kim IJ等人，Clin.Cancer Res.92920-2925，2003)從冰凍樣品中提取基因組DNA，。為產(chǎn)生熒光染料標(biāo)記的DNA樣品，用提取的DNA作為模板，用SEQ ID NOs 21和22這兩對(duì)引物(Metabion，Germany)進(jìn)行PCR放大，方法如以前所述(Kim IJ等人，Clin.Cancer Res.8457-463，2002；Kim IJ等人，Clin.Cancer Res.92920-2925，2003)。
PCR反應(yīng)溶液(25ul)包括100ng基因組DNA，10pmol的各種引物，dATP，dTTP和dGTP(MBIFermentas)各50μM，的熒光染料標(biāo)記的Cy5-dCTP(AmershamBioscience)和dCTP各10μM。在可程控的熱循環(huán)控制裝置(Perkin Elmer Cetus 9600；羅氏分子系統(tǒng)公司，新澤西)中，在94攝氏度條件下變性五分鐘，引發(fā)反應(yīng)。PCR條件包括94攝氏度30秒、56攝氏度30秒和72攝氏度1分鐘，共35各循環(huán)，最后在72攝氏度時(shí)延長(zhǎng)7分鐘。
至于CDH法，DNA樣品標(biāo)有另一熒光染料Cy3-dCTP(AmershamBioscience)或CromatideTM-dUTP-Alexa氟594(MolecularProbe)。在CDH的PCR反應(yīng)中，每個(gè)樣品用那些熒光標(biāo)記的dNTPs放大，與DNA融合。
PCR反應(yīng)后，用一個(gè)提純?cè)噭┖?QIAquick PCR提純?cè)噭┖?，Qiagen Inc，Valencia，CA)提純每種Cy5-、Cy3-和AlexaTM594標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，并用0.05U的DNase I(Takara，Shiga，Japan)在25攝氏度時(shí)消化3分鐘。剩余的酶在80攝氏度時(shí)失活10分鐘，分別回收Cy5-、Cy3-和AlexaTM594標(biāo)記樣品。
(步驟2)雜交反應(yīng)與分析混合在步驟(1)中制備的Cy5-、Cy3-和AlexaTM594標(biāo)記的DNA樣品，并在5x雜交試液中(Hybit，TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)再懸浮到2-4μl的容積。2μl的混合DNA樣品被滴到實(shí)施例1制造的玻璃滑片上，玻璃滑片蓋著一個(gè)蓋玻片。雜交反應(yīng)通過在56攝氏度在一個(gè)飽和蒸汽管對(duì)玻璃滑片孵育于時(shí)反應(yīng)2.5小時(shí)進(jìn)行。樣品這一程序使得從病人那兒得到放大并有特定標(biāo)記的DNA樣品在有限量的點(diǎn)樣寡核苷酸的雜交反應(yīng)中互相競(jìng)爭(zhēng)。
在0.2％SDS+0.5xSSC的緩沖劑中室溫下清洗雜交的玻璃滑片15-30分鐘，然后在蒸餾水中清洗5分鐘，接著離心和干燥。通過ScanArray Lite的圖像分析法(Parkard Instrument Co，Meriden，CT)和QuantArray(version 2.0，Parkard Instrument Co，Meriden，CT)掃描玻璃滑片，計(jì)算每個(gè)斑點(diǎn)的密度，其代表了來自腫瘤的雜交DNA的量。根據(jù)每個(gè)熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)于Cy5、Cy3、AlexaTM594，分別用632.8納米、543.8納米和594納米的波長(zhǎng)掃描雜交的微型陣列(Lovmar L等人，Nucleic Acids Res.31e129，2003).
兩個(gè)野生型信號(hào)互相比較，通過信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化調(diào)整到相同。每個(gè)密碼子上其余的18個(gè)信號(hào)作為野生型信號(hào)以同樣方式予以調(diào)整。在信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化后，如前所述對(duì)所有信號(hào)進(jìn)行重新分析(Kim，IJ等人，Clin.Cancer Res.8457-463，2002)。計(jì)算背景信號(hào)的平均值(BA)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(BSD)，截止閾確定為BA+2.58BSD。(BA+2.58BSD)指99％信任區(qū)間的上限，高于該值的信號(hào)認(rèn)作為有意義信號(hào)。所有數(shù)據(jù)分析使用SigmaPlot(SPSS Inc.，San Rafael，CA)進(jìn)行，使用Microsoft Excel程序計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
結(jié)果是，結(jié)腸直腸癌中共有50個(gè)(50/204，24.5％)突變用K-ras寡核苷酸微型陣列得到了辨認(rèn)。其中，28個(gè)來自近側(cè)結(jié)腸癌(28/103，27.2％)，22個(gè)來自遠(yuǎn)結(jié)腸直腸癌(22/101，21.8％)。檢測(cè)到共有四種錯(cuò)義突變?cè)斐闪嗣艽a子12和13處的氨基酸變化。最常見的突變類型是密碼子13處的GGC(Gly)變成GAC(Asp，21/50)。其他突變類型是從GGT(Gly)變化為GAC(Asp，16/50)，GTT(Val，8/50)和TGT(Cys，5/50)。但是，在癌癥病人的正常組織中沒有檢測(cè)到這種突變類型。
附圖1a-1e表示使用(CDH組)和不使用CDH法(對(duì)照組)時(shí)K-ras寡核苷酸微型陣列的掃描圖像及其信號(hào)強(qiáng)度。附圖1a是用D231樣品的常規(guī)雜交結(jié)果，該樣品用Cy5標(biāo)記的dCTP放大(D231-對(duì)照)。附圖1b是用D231樣品的競(jìng)爭(zhēng)性雜交，該樣品用Cy5-，Cy3-和AlexaTM594標(biāo)記的dCTP放大(D231-CDH)。附圖1c是用D281樣品的常規(guī)雜交，該樣品用Cy3標(biāo)記的dCTP放大(D281-對(duì)照)。附圖1d是用D231樣品的競(jìng)爭(zhēng)性雜交，該樣品用Cy5-，Cy3-和AlexaTM594標(biāo)記的dCTP放大(D281-CDH)。使用Cy5標(biāo)記的dCTP在D231樣品中檢測(cè)到密碼子13的錯(cuò)義突變(GGC突變?yōu)镚AC)，使用Cy3標(biāo)記的dCTP在D281樣品中檢測(cè)到密碼子12的錯(cuò)義突變(GGT突變?yōu)镚AT)。附圖1e是癌癥患者正常組織(陰性對(duì)照)的競(jìng)爭(zhēng)性雜交的結(jié)果，其中沒有檢測(cè)到K-ras突變。突變用箭頭表示，基于野生型信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化后，對(duì)點(diǎn)樣寡核苷酸的信號(hào)強(qiáng)度作圖。還檢測(cè)到一些非特異結(jié)合(*)。將CDH(附圖1b和1d)和其對(duì)照(附圖1a和1c)相比較，發(fā)現(xiàn)非特異性結(jié)合的信號(hào)減少，而突變和野生比率(R)增加(D231；0.91變?yōu)?.66，D281；0.28變?yōu)?.56)。還檢測(cè)到野生型的兩個(gè)信號(hào)(密碼子12和13)有所降低。原因是每個(gè)樣品的野生型DNAs斷片參與了雜交。但是，突變DNA在三種混合樣品的狀態(tài)中很少有共同序列，不參與競(jìng)爭(zhēng)，保留了其原始信號(hào)。
為了調(diào)查突變概圖和表型的顯著性，以SPSS軟件使用x2或Fisher’s精確試驗(yàn)進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析。α＝0.05定為顯著性水平。結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)GGT變?yōu)镚AT的類型在近側(cè)結(jié)腸癌(13/28)中比遠(yuǎn)側(cè)結(jié)腸癌(3/22，p＝0.014)更普遍，符合原先的報(bào)告(Samowitz WS等人，標(biāo)記Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.91193-1197，2000；Brink M等人，Carcinogenesis 24703-710，2003).然而，K-ras突變與性別、年齡、腫瘤大小、分化和TNM之間沒有檢測(cè)到顯著性關(guān)系。
實(shí)施例3通過K-ras寡核苷酸微型陣列檢測(cè)到的K-ras突變的確以為了確認(rèn)本發(fā)明所述的K-ras寡核苷酸微型陣列檢測(cè)到的K-ras突變，對(duì)205個(gè)結(jié)腸直腸癌樣品作了雙向測(cè)序分析，如前描述(Park，JH等人，Clin.Genet.6448-53，2003)。關(guān)于測(cè)序，使用了原先報(bào)告過的SEQ ID NOs23和24引物(Lagarda H等人，J.Pathol.193193-199，2001)。用與實(shí)施例2的步驟(1)中描述的同樣方法進(jìn)行了PCR，不過使用的是傳統(tǒng)的dNTP混合物。
使用Taq雙脫氧終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(Taq dideoxy terminatorcyclesequencing kit)和ABI 3100DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)orster City，CA)進(jìn)行雙向測(cè)序。
結(jié)果是，突變結(jié)果100％與直接測(cè)序吻合，表明既無假陽性，亦無假陰性。
盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已描述和說明，但是顯然只要不偏離本發(fā)明所述的主旨可以進(jìn)行各種變化和改動(dòng)，該變化和改動(dòng)受到權(quán)利要求所述范圍的限制。
序列表<110>國立癌中心<120>K-ras寡核苷酸微型陣列及用其檢測(cè)K-ras突變的方法<130>PCA40217-NCC<150>KR10-2004-28926<151>2004-04-27<160>24<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12W<400>1gttggagctg gtggcgtagg c 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12M1<400>2agttggagct tgtggcgtag g 21
<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12M2<400>3agttggagct agtggcgtag g 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12M3<400>4agttggagct cgtggcgtag g 21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12M4<400>5gttggagctg atggcgtagg c 21<210>6<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>12M5<400>6gttggagctg ctggcgtagg c 21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12M6<400>7gttggagctg ttggcgtagg c 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12M7<400>8ttggagctgg aggcgtaggc a 21<210>g<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12M8<400>9ttggagctgg gggcgtaggc a 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12M9<400>10ttggagctgg cggcgtaggc a 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>13W<400>11ggagctggtg gcgtaggcaa g 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>13M1
<400>12tggagctggt cgcgtaggca a 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>13M2<400>13tggagctggt agcgtaggca a 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>13M3<400>14tggagctggt tgcgtaggca a 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12M4<400>15ggagctggtg ccgtaggcaa g 21
<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>13M5<400>16ggagctggtg acgtaggcaa g 21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>13M6<400>17ggagctggtg tcgtaggcaa g 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>13M7<400>18gagctggtgg tgtaggcaag a 21<210>19<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>13M8<400>19gagctggtgg agtaggcaag a 21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>13M9<400>20gagctggtgg ggtaggcaag a 21<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正義引物<400>21ggcctgctga aaatgactga atat 24<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>反義引物<400>22tgttggatca tattcgtcca caaaatg27<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>測(cè)序用正義引物<400>23ggtggagtat ttgatagtgt a 21<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>測(cè)序用反義引物<400>24ggtcctgcac cagtaatatg ca 2權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)K-ras突變的K-ras寡核苷酸微型陣列，其包含多種固定在固體矩陣表面的寡核苷酸，其中寡核苷酸被設(shè)計(jì)成用于檢測(cè)在K-ras基因突變熱點(diǎn)區(qū)的錯(cuò)義突變型，所述寡核苷酸包括具有SEQID NO.1的核苷酸序列的野生型和具有SEQ ID NOs2-10核苷酸序列的密碼子12的錯(cuò)義突變型，以及具有SEQ ID NO.11的核苷酸序列的野生型和具有SEQ ID NOs12-20核苷酸序列的密碼子13的錯(cuò)義突變型。
2.如權(quán)利要求1所述的K-ras寡核苷酸微型陣列，其中每個(gè)寡核苷酸有一個(gè)含5’氨基修飾的12碳間隔團(tuán)，其中固體矩陣涂有醛或胺。
3.如權(quán)利要求2所述的K-ras寡核苷酸微型陣列，其中通過在寡核苷酸的胺基團(tuán)和固體矩陣的醛基團(tuán)之間以希夫堿反應(yīng)的方式形成共價(jià)鍵，將寡核苷酸固定在固體矩陣表面。
4.一種使用權(quán)利要求1所述的K-ras寡核苷酸微型陣列檢測(cè)K-ras突變的方法，包括1)制備熒光染料標(biāo)記的DNA；2)使標(biāo)記的DNA樣品在K-ras寡核苷酸微型陣列上與寡核苷酸斑點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)；3)沖洗反應(yīng)后的微型陣列，去除未結(jié)合的樣品DNA；4)利用熒光讀數(shù)器檢測(cè)特異的寡核苷酸斑點(diǎn)的雜交形式；和5)檢查是否有基因突變的存在。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中樣品是從目標(biāo)病人得到的腫瘤樣品或血樣。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中雜交反應(yīng)根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性DNA雜交(CDH)法進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中競(jìng)爭(zhēng)性DNA雜交法包括下述步驟混合用不同熒光染料標(biāo)記的dNTP放大的至少兩個(gè)樣品；將樣品混合物滴于微型陣列表面一個(gè)點(diǎn)樣的寡核苷酸內(nèi)；使樣品在有限數(shù)量?jī)?nèi)的點(diǎn)樣的寡核苷酸的雜交反應(yīng)中互相競(jìng)爭(zhēng)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中熒光染料選自Cy5，Cy3，Alexa氟，Texas Red，熒光素和Lissanmine。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其中雜交反應(yīng)在充滿水蒸氣的45-60攝氏度的恒溫室進(jìn)行3-9小時(shí)。
全文摘要
由于本發(fā)明所述K－ras寡核苷酸微型陣列能夠通過將競(jìng)爭(zhēng)性DNA雜交方法應(yīng)用到點(diǎn)樣在一個(gè)固體矩陣上的寡核苷酸而檢測(cè)K－ras突變，而該方法不同于以前報(bào)道過的突變檢測(cè)方法，這樣就使得分析更加精確，而且可以減少實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間。因此，本發(fā)明所述K－ras寡核苷酸微型陣列可被用于檢測(cè)K－ras突變、解釋信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和有關(guān)K－ras基因的腫瘤發(fā)生的研究。再則，由于本發(fā)明所述微型陣列可被用于有突變熱點(diǎn)區(qū)域如K－ras的其他基因，該微型陣列具有廣泛的應(yīng)用范圍。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1957091SQ200480043145
公開日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月27日
發(fā)明者樸在甲, 金日鎮(zhèn), 姜曉貞, 樸在賢 申請(qǐng)人:國立癌中心