專利名稱：通過細(xì)胞巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體以及巨團(tuán)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程學(xué)。具體地，本發(fā)明涉及細(xì)胞三維組織樣組構(gòu)的產(chǎn)生。更具體地，本發(fā)明涉及可植入人體中作為對病態(tài)或受損狀況進(jìn)行治療的三維宏觀組織樣構(gòu)建體。

背景技術(shù)：
人體可以由于不同器官的病態(tài)或受損狀況而受折磨，對其的一種治療方法是使用外部獲得或培養(yǎng)的組織等效物代替受損部分。例如，可以通過應(yīng)用合適的皮膚等效物來處理皮膚燒傷或潰瘍，可以通過移植合適的骨代替物來處理在斷裂的骨頭中的不一致的斷口，可以通過合適的軟骨生成培植來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的損壞。
每年，外科醫(yī)生執(zhí)行外科方法來治療忍受器官衰竭或組織損失的病人。外科醫(yī)生/內(nèi)科醫(yī)生可以通過從一個人到另一人移植器官，執(zhí)行修復(fù)手術(shù)，或通過使用例如腎透析器、修復(fù)髖關(guān)節(jié)或機(jī)械心臟瓣膜的機(jī)械裝置來治療病人。盡管這些方法挽救了許多生命，但是它們也有局限性。例如心臟、肝和腎的器官移植的局限性不在于外科技術(shù)，而在于捐贈器官缺乏的可用性。
自然可用移植的可能種類包括從動物獲得的異種移植物、從人類捐贈者獲得的同種異體移植物和從病人本身健康部分獲得的自體移植物。異種移植物具有免疫不相容性和包括逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的傳染病原體的傳播的問題。同種異體移植物具有免疫排斥和難以得到捐贈者的問題。自體移植物具有所需合適組織的數(shù)量不足和增加病人損傷的問題。
對于外科修復(fù)，可以將組織從病人的一部分移到另一部分。這些自體移植物(來自病人的組織移植物)包括用于燒傷的皮膚移植物、心臟搭橋手術(shù)和用于面部及手部修復(fù)的神經(jīng)移植。使用自體移植物的缺點也包括需要多次手術(shù)和移植區(qū)的功能損失。另外，外科修復(fù)經(jīng)常涉及為了非最初計劃的目的而使用身體組織，并且可以導(dǎo)致長期并發(fā)癥。
由于現(xiàn)有治療選擇的這些缺陷，人們需要制造的組織等效物，并且組織工程學(xué)作為新學(xué)科出現(xiàn)了。其目標(biāo)是在培養(yǎng)物中產(chǎn)生組織，其不僅用作基礎(chǔ)研究的模型系統(tǒng)，而且更為重要地是用作對于損傷或病態(tài)身體部分的替代組織。盡管產(chǎn)生用于人類治療的生物人工組織和器官的努力可以追溯到至少三十年前，但是這種努力只是在最近十年中接近臨床上的成功。這些由于在分子和細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和材料科學(xué)的重大進(jìn)步而變?yōu)榭赡堋?br> 術(shù)語“組織工程學(xué)”是相對新的，并且在最近五年中更廣泛地用于描述為生物人工組織和器官的發(fā)展而應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)原理的跨學(xué)科領(lǐng)域。
為實驗室培養(yǎng)組織的產(chǎn)生而采用的主要策略之一是在三維模板或支架(基體)上并在使細(xì)胞生長為功能組織的條件下的單個細(xì)胞的生長。在移植時，此人工生物組織應(yīng)變得在結(jié)構(gòu)和功能上與身體結(jié)合為一體?；w可以由例如膠原質(zhì)的自然物質(zhì)或例如塑膠的人造聚合體形成。最后，支架材料隨著時間的過去應(yīng)是生物可降解的，并且用作組織生長的初始三維模板。
隨著細(xì)胞在支架上生長和分化，它們會產(chǎn)生重造組織所需要的多種蛋白質(zhì)。支架的分解保證只有自然組織保留在體內(nèi)。也有不同種類的為了用細(xì)胞來構(gòu)造組織的任務(wù)而結(jié)合了不同技術(shù)的生物反應(yīng)器。
事實上，在身體中的每個組織都是生物工程學(xué)的潛在目標(biāo)，并且在許多方向上快速發(fā)生進(jìn)展。對于作為器官的皮膚，不同種類的制成替代物已經(jīng)發(fā)展出來——采用幾種不同的方法來重新制造皮膚已經(jīng)獲得不同程度地成功。
美國專利第5489304號說明了具有與來自真皮模擬層的膠原質(zhì)——軟骨素硫酸鹽——相結(jié)合的人造外層的非細(xì)胞移植。在應(yīng)用培養(yǎng)的上皮自體移植物之前，此替代物最初置于傷口上，其具有這樣的缺點，它缺乏對于皮膚傷口愈合重要的生長因子或可以產(chǎn)生這些因子的細(xì)胞。
美國專利第5460939號說明了另一種的細(xì)胞移植。成纖維細(xì)胞在生物可再吸收的乳酸/羥基乙酸共聚物網(wǎng)中生長以形成薄片。在此移植中，支架網(wǎng)不是自然源的。
Eaglstein & Falanga(1997)說明了一種皮膚移植，其包括具有在牛膠原質(zhì)基體中生長的成纖維細(xì)胞的真皮層。在此移植中，在外部將細(xì)胞外基體提供給細(xì)胞，盡管其制造人膠原質(zhì)，但是在實施移植時外加組分保留下來。
美國專利第5613982號說明了一種的細(xì)胞移植，其中處理人類尸體皮膚以除去抗原細(xì)胞成分，留下免疫惰性真皮層。這種方法具有非細(xì)胞和人類尸體皮膚不易獲得的局限性。
在以上所有的實例中，生產(chǎn)等效物的技術(shù)要求是相當(dāng)復(fù)雜的，因此會增加產(chǎn)品成本。使用抗壞血酸鹽的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞片已經(jīng)發(fā)展出來，但是這種片的形成需要大約35天(Michel等人，1999；L′Heureux等人，1998)。
因此，人們需要開發(fā)組織等效物，其材料可以容易得到，其沒有可能導(dǎo)致在一些病人中發(fā)炎反應(yīng)的人工或自然的外源基體，其是細(xì)胞的，從而它可以產(chǎn)生生長因子和其它蛋白質(zhì)，其可以在相對較短時間中制備，并且其制備在技術(shù)上簡單從而產(chǎn)品更有成本效益。
在制造的組織產(chǎn)品領(lǐng)域中需要注意的方面是對于骨折沒有愈合留下不一致缺口的病人的骨替代物。自體骨移植增加病人的損傷。在骨工程學(xué)中正在試驗不同的方法(Service，2000)。已經(jīng)試驗了注入可引起骨形成的生長因子的例如膠原質(zhì)基體的生物材料，但是這種結(jié)構(gòu)缺乏細(xì)胞成分，并且結(jié)合所要求的大量生長因子使其成為非常昂貴的選擇。將間質(zhì)干細(xì)胞種在陶瓷或羥磷灰石基體上是另外的方法，但是這種支架的使用對于人體可能不是理想的。因此，人們需要會導(dǎo)致骨愈合的有成本效益的細(xì)胞植入。
在制造的組織產(chǎn)品領(lǐng)域中要求注意的另一方面是軟骨修復(fù)。關(guān)節(jié)軟骨具有在受傷后有限的完全修復(fù)能力是公知的事實。自體軟骨細(xì)胞移植的細(xì)胞基礎(chǔ)療法已經(jīng)表現(xiàn)出良好的臨床效果(McPherson & Tubo，2000)，但是由于完全修復(fù)時間非常長，仍有充足的改進(jìn)空間?？赡艿?，預(yù)先形成的組織比細(xì)胞懸浮液對移植有更好的效果。再者，預(yù)先形成的組織對于外科移植優(yōu)于游離細(xì)胞。因此，人們正在使用細(xì)胞和支架來制造軟骨樣構(gòu)建體中嘗試不同的方法，但是在移植中允許細(xì)胞逼真仿制自然軟骨形成過程的理想支架基本仍面臨挑戰(zhàn)(Ilim & Han，2000)。因此，人們需要在植入受傷點時可以有效地開始軟骨修復(fù)的預(yù)先形成的組織，并且其也有成本效益。
總之，人們需要發(fā)展用于治療目的的相對便宜的活細(xì)胞組織替代物。前面所提到的用于發(fā)展三維組織的技術(shù)復(fù)合生物反應(yīng)器是昂貴的方法。另外，一般地，人們總是需要用新方法發(fā)展組織替代物，其在測試時會證明比現(xiàn)有替代物在一個或多個方面具有更好的性能。
注意到目前的需要，本發(fā)明的科學(xué)家已經(jīng)發(fā)展出具有用作人體中組織替代物的潛力的新三維宏觀組織樣構(gòu)建體。這些組織樣構(gòu)建體的新特性在于，對于組織生成不需要支架或外源基體，組織可以由完全細(xì)胞源形成。另外，沒有使用有助于組織形成(除了高細(xì)胞接種密度之外)的其它媒介，例如組織誘導(dǎo)化學(xué)品、組織誘導(dǎo)生長因子、特殊性質(zhì)的基質(zhì)、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)。對于組織樣結(jié)構(gòu)形成不要求特殊復(fù)雜的培養(yǎng)基。導(dǎo)致宏觀組織樣結(jié)構(gòu)形成的因素是在每單位面積或空間高細(xì)胞接種的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。
組織工程學(xué)的關(guān)鍵方面是如何使細(xì)胞聚集到組織或三維結(jié)構(gòu)中。本發(fā)明提供了實現(xiàn)它的新方法。
發(fā)明目的 依照上面所述，因而本發(fā)明的目的是提供使細(xì)胞聚集成三維組織樣組構(gòu)和組織樣結(jié)構(gòu)的新方法。
另外，依照上面所述，因而本發(fā)明的目的是提供用于治療病態(tài)或受損狀況可植入人體的三維宏觀組織樣構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一目的是提供在組織學(xué)上符合要求的宏觀組織樣構(gòu)建體。在組織學(xué)上符合要求的意思是，這些組織樣構(gòu)建體可以無損壞地容易地分割。
本發(fā)明的再一目的是提供細(xì)胞的三維組織樣組構(gòu)和由間充質(zhì)源性成纖維細(xì)胞(至少)組成的有成本效益的公認(rèn)的組織等效物，例如由真皮成纖維細(xì)胞組成的公認(rèn)真皮等效物、由脂肪基質(zhì)細(xì)胞衍生的生骨細(xì)胞組成或由造骨細(xì)胞組成的具有骨樣特性的公認(rèn)替代物和由軟骨細(xì)胞組成的用于軟骨修復(fù)的公認(rèn)替代物。本發(fā)明的相關(guān)目的是展示也提供其它組織的可能性，如果這些其它細(xì)胞類型具有使它們經(jīng)歷通過本發(fā)明所定義的巨團(tuán)培養(yǎng)的組織樣團(tuán)形成的特性，通過本發(fā)明的方法其由相應(yīng)類型細(xì)胞組成是可能的。
本發(fā)明的再一目的是提供細(xì)胞三維組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體而不使用支架或外部基體或用于組織生成的復(fù)合生物反應(yīng)器。
本發(fā)明的再一目的是提供細(xì)胞三維組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體而不使用有助于組織形成的任何媒介，例如組織誘導(dǎo)化學(xué)品、組織誘導(dǎo)生長因子、特殊性質(zhì)的基質(zhì)、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)等。
本發(fā)明的再一目的是提供細(xì)胞三維組織樣組構(gòu)和不同種類的宏觀組織樣構(gòu)建體，其是通過利用培養(yǎng)器皿的每單位面積或空間的高細(xì)胞接種密度而形成，而不使用有助于組織形成的任何其它媒介。
本發(fā)明的另一目的是提供在最終形態(tài)中具有高細(xì)胞密度的宏觀組織樣構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一目的是提供細(xì)胞三維組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體，其可以在不需要特殊復(fù)雜的培養(yǎng)基成分的條件下形成。
本發(fā)明的另一目的是提供細(xì)胞三維組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體，其特性可以通過在生長和/或組織形成培養(yǎng)基中合適變化來調(diào)制以包括期望的特性。
本發(fā)明的另一目的是提供細(xì)胞三維組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體，其可以依照要求在不同的相容生長表面上通過巨團(tuán)培養(yǎng)來形成。
本發(fā)明的另一目的是提供宏觀組織樣構(gòu)建體，其可以通過在它們形成所用的方法，也就是巨團(tuán)培養(yǎng)，的二維中的簡單放大來放大到更大的尺寸。
本發(fā)明的另一目的是在宏觀水平上產(chǎn)生三維組織樣組構(gòu)。


發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，提供了用于通過巨團(tuán)培養(yǎng)將細(xì)胞聚集成三維組織樣組構(gòu)的方法和巨團(tuán)培養(yǎng)的新方法。提供了在組織學(xué)上符合要求的并且由細(xì)胞巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的宏觀三維組織樣構(gòu)建體。本發(fā)明涉及組織工程學(xué)。更具體地，本發(fā)明涉及可能植入人體中作為對病態(tài)或受損狀況進(jìn)行治療的三維宏觀組織樣構(gòu)建體的形成。本發(fā)明給出了細(xì)胞組構(gòu)三維組織樣形式的方法，并且描述了組織樣形式本身。
組織的形成是人體中病態(tài)組織替代的重要目標(biāo)。對于組織工程學(xué)，人們正在努力探索和復(fù)原細(xì)胞的組織形成能力。
細(xì)胞移植的組織工程學(xué)方法包括下面兩個(2)主要步驟—— i.從合適的來源中得到細(xì)胞。得到的細(xì)胞可以要求例如分化的適當(dāng)制備，變成期望的細(xì)胞類型。
ii.使用適當(dāng)制備的細(xì)胞組成組織，以產(chǎn)生不同組織工程產(chǎn)品。
本發(fā)明專注于這些步驟中的第二步。發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)出簡單并且有成本效益的細(xì)胞三維組織樣組構(gòu)生成和活細(xì)胞的公認(rèn)組織替代物的形成的方法。
本發(fā)明的組織樣構(gòu)建體具有內(nèi)聚強(qiáng)度以能夠經(jīng)受物理操作和處理，這是在合適的支持和處理裝置或儀器的幫助下從擁有該構(gòu)建體的器皿中并且如外科手術(shù)般地將其放在身體需要部位的步驟所要求的。
在基于支架的組織替代物的產(chǎn)生中已經(jīng)做了大量的工作，其包括作為重要結(jié)構(gòu)和通常功能成分的支架。此支架要求具有生物相容性和生物降解能力(從而最終只有自然組織保留在體內(nèi))以及提供對于最佳細(xì)胞功能的許可環(huán)境的特性。在各種可能方面都是理想的支架的開發(fā)仍面對著挑戰(zhàn)。本發(fā)明的優(yōu)點在于，它避開了引入支架的要求，因為本發(fā)明產(chǎn)生的三維組織樣構(gòu)建體在不借助于支架的情況下制成的。通過本發(fā)明巨團(tuán)方法的在組織學(xué)上符合要求的組織樣結(jié)構(gòu)的形成不需要支架。因此，本發(fā)明的組織樣構(gòu)建體也消除了可能與在某一方面不太理想的支架的使用相關(guān)的任何不利影響和缺陷。在本發(fā)明中，細(xì)胞外基體是由細(xì)胞自己合成的，沒有使用外源基體成分。組織形成是通過在培養(yǎng)器皿的每單位面積或空間高細(xì)胞密度接種細(xì)胞來簡單地發(fā)生。這被稱做“巨團(tuán)”培養(yǎng)，其定義為用于細(xì)胞三維組織樣形成或組構(gòu)的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中以培養(yǎng)器皿的每單位面積或空間高密度接種細(xì)胞，其范圍是達(dá)到大約106個細(xì)胞每cm2，并且不需要有助于組織形成的任何其它媒介。巨團(tuán)培養(yǎng)的更廣泛的定義是由細(xì)胞產(chǎn)生宏觀或微觀的三維組織樣組構(gòu)的方法，其通過高密度細(xì)胞接種，將細(xì)胞在三維空間中依照一定有利范圍內(nèi)的細(xì)胞高密度緊密地放置，這有利于細(xì)胞粘著合為三維組織樣狀態(tài)，并且不需要有助于組織形成的任何其它媒介。在確定的空間中需要達(dá)到在有利范圍內(nèi)的細(xì)胞的一定高接種密度。在有利高細(xì)胞接種密度的巨團(tuán)范圍內(nèi)，當(dāng)將細(xì)胞一起放置在培養(yǎng)器皿底部由細(xì)胞占據(jù)的三維空間中時，它們變?yōu)榛ハ嗑o密接近狀態(tài)，這樣引發(fā)或激發(fā)細(xì)胞進(jìn)入組織形成模式，由此它們變得粘為一體。(可以說明的是，細(xì)胞接種密度的巨團(tuán)范圍可以在具有水平或彎曲底部的器皿中達(dá)到)。使用直徑約為0.75cm或更大的培養(yǎng)器皿的結(jié)果是宏觀的三維組織樣結(jié)構(gòu)的形成，其中“宏觀”意思是，組織的大小至少是這樣的，它可以由正常人類肉眼容易地在視覺上辨別出來。
作為以前公知的組織培養(yǎng)系統(tǒng)，高密度巨團(tuán)培養(yǎng)已經(jīng)用于細(xì)胞的軟骨細(xì)胞分化，并且這種培養(yǎng)的規(guī)模限制到10到20μl的點滴的細(xì)胞懸浮液(Yoon等人，2000)。傳統(tǒng)地，當(dāng)按照巨團(tuán)培養(yǎng)在生物體外培養(yǎng)肢芽間質(zhì)細(xì)胞時，其經(jīng)歷前軟骨濃縮或聚集的形成，作為覆蓋巨團(tuán)點滴區(qū)域的個體小結(jié)出現(xiàn)(Ahrens等人，1977)。因而形成的細(xì)胞結(jié)互相分離，沒有形成到小結(jié)中的細(xì)胞分布其間，并且是用顯微鏡可見的。如同下文提及的，需要將例如生長因子的特定成分添加到培養(yǎng)基中產(chǎn)生更大的但是微觀的球狀結(jié)構(gòu)，其中所有的細(xì)胞聚集在一起形成一集合體。但是，本發(fā)明產(chǎn)生的組織樣團(tuán)是宏觀的(并且不使用有助于組織形成的任何特定媒介)，并且從而擁有具有作為人體組織替代品的潛力所要求的理想質(zhì)量大小。在通過本發(fā)明巨團(tuán)培養(yǎng)的組織樣組構(gòu)中，所有細(xì)胞變?yōu)橥暾M織樣組構(gòu)的一部分，從而其為一整體；沒有個體小結(jié)。人們以前發(fā)現(xiàn)，通過巨團(tuán)培養(yǎng)，脛前軟骨間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生小結(jié)式樣(Downie & Newman，1994)。盡管通過巨團(tuán)培養(yǎng)翅前軟骨間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生片狀式樣；這是在無血清培養(yǎng)系統(tǒng)中，不同于本發(fā)明的巨團(tuán)培養(yǎng)系統(tǒng)。另外，脛前軟骨間質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生片樣式樣，但這是基于在無血清培養(yǎng)基中的TGFβ1，也不同于巨團(tuán)培養(yǎng)，其中對于組織樣片形成不需要有助于組織形成的任何特定媒介并且不需要無血清條件。
至今，通過高細(xì)胞接種密度培養(yǎng)而不使用有助于組織形成的任何特定媒介，細(xì)胞與細(xì)胞聚集導(dǎo)致整個組織樣團(tuán)形成是否會發(fā)生的問題仍沒有得到研究。但是，本發(fā)明人的工作已經(jīng)說明這個問題，并且本發(fā)明給出了肯定的回答。
高密度培養(yǎng)已經(jīng)用于通過微觀個體小結(jié)形成來促進(jìn)軟骨形成，但是還沒有在更大的宏觀規(guī)模上對于用于人體組織替代物的宏觀組織的產(chǎn)生進(jìn)行評估。并且甚至在微觀規(guī)模上，如上所述，只有在特定媒介幫助下才可形成整個集合體，不同于本發(fā)明的巨團(tuán)培養(yǎng)。
盡管術(shù)語“巨團(tuán)”初看起來意思是“微團(tuán)”的純粹擴(kuò)充，事實上它在重要方面是不同的，微團(tuán)已經(jīng)發(fā)展為用于細(xì)胞的軟骨細(xì)胞分化方法，并且也包括甚至對于微觀整體球狀集合體形成的特定復(fù)雜培養(yǎng)基要求(如下所述)，而巨團(tuán)是細(xì)胞的三維組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體的形成而沒有對于形成的特定復(fù)雜培養(yǎng)基要求的方法。
時至今日，人們已經(jīng)向細(xì)胞聚集的發(fā)展做出努力，其結(jié)果是稱為微團(tuán)的球狀體。球狀體是在有助于組織樣形成的多種媒介的幫助下由肝實質(zhì)細(xì)胞和其它細(xì)胞組成的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如無附著器皿(Takezawa等人，1993)，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)(Abu-Absi等人，2002)，例如Eudragit的聚合物(Yamada等人，1998)，Matrigel(Lang等人，2001)，Primarias器皿(Hamamoto等人，1998)，poly-D-Lysine鍍膜器皿(Hamamoto等人，1998)，蛋白多糖鍍膜(Shinji等人，1988)，培養(yǎng)基流(Pollok等人，1998)，旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)(Furukawa等人，2001)，液體覆蓋技術(shù)(Davies等人，2002)，例如胰島素、地塞米松和成纖維細(xì)胞生長因子的因子增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞粘附力(Furukawa等人，2001)，誘導(dǎo)聚集聚合縮氨酸配對(Baldwin & Saltzman，2001)，旋轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器(Baldwin & Saltzman，2001)等。不同于這些球狀體，在我們的操作中組織團(tuán)是在沒有有助于組織樣形成的任何這種媒介幫助下產(chǎn)生的。上述球狀體小得多，主要是在微米或亞毫米的范圍中。由于通過本發(fā)明所述的巨團(tuán)培養(yǎng)可形成宏觀組織團(tuán)是，它們用于放置在人體中需要的部位，具有明顯優(yōu)于球狀體的優(yōu)點。
本發(fā)明人在公開文獻(xiàn)中所發(fā)現(xiàn)的最大球狀體(直徑約1mm)是通過高密度小球培養(yǎng)的(Mackay等人，1998)。它們的形成是在無血清指定培養(yǎng)基存在下發(fā)生的，該培養(yǎng)基包括TGF-β3、地塞米松、抗壞血酸鹽2-磷酸鹽和胰島素-鐵傳遞蛋白-硒添加劑，然而這種無血清指定培養(yǎng)基對于通過巨團(tuán)培養(yǎng)的組織組構(gòu)是不需要的。在前述報告中采用骨髓導(dǎo)出間質(zhì)祖細(xì)胞的小球培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)球狀集合體形成沒有在DMEM+10％FCS培育的小球中發(fā)生(Johnstone等人，1998)，而由巨團(tuán)培養(yǎng)的組織樣構(gòu)建體在DMEM+10％FCS形成。通過多潛能間質(zhì)細(xì)胞的微團(tuán)培養(yǎng)的球狀體形成已經(jīng)公開；這里球狀聚集體形成的發(fā)生僅基于用TGFβ1或牛骨提取物的微團(tuán)培養(yǎng)處理(Denker等人，1995)。據(jù)報告微觀骨細(xì)胞球狀體在包含TGFβ1的無血清培養(yǎng)基存在下形成(Kale等人，2000；美國專利申請第20020127711號)，并且據(jù)報告在此方法中在沒有血清以及有TGFβ1的條件下的細(xì)胞培養(yǎng)對于骨細(xì)胞球狀體形成是必要的。在上述文獻(xiàn)中，說明了對于球狀體形成優(yōu)選大約1×103細(xì)胞/cm2到1×106細(xì)胞/cm2的密度。除了與上述文獻(xiàn)區(qū)別的本發(fā)明組織樣結(jié)構(gòu)的其它特征，即是宏觀的，對于形成不需要無血清并且不需要TGFβ1，優(yōu)選接種密度范圍也是不同的。在我們的發(fā)明中，組織樣構(gòu)建體不發(fā)生在1×105細(xì)胞/cm2或以下，而上述發(fā)明的1×103細(xì)胞/cm2低了100倍。骨胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞聚合體或結(jié)已經(jīng)形成(Buttery等人，2001)，但是，這些結(jié)是微觀的并且不是由本發(fā)明所述的高細(xì)胞密度培養(yǎng)形成的?？稍诖笠?guī)模進(jìn)行時由巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的本發(fā)明組織團(tuán)是宏觀的，因而大小遠(yuǎn)大于已經(jīng)發(fā)展出來的任何球狀體，并且對于形成沒有這種特定復(fù)雜培養(yǎng)基要求。例如DMEM+10％FCS的簡單培養(yǎng)基對于巨團(tuán)培養(yǎng)的組織樣結(jié)構(gòu)形成是足夠的。細(xì)胞的粘性栓以前是由軟骨細(xì)胞形成(美國專利第5,723,331號)，但是具有阻礙細(xì)胞附著從而使細(xì)胞失去固定位置的表面的預(yù)成形孔是對于它的關(guān)鍵要求，然而，在本發(fā)明中，對于組織樣構(gòu)建體形成不需要這種表面。
在本發(fā)明的一實施例中，組織樣片是由人類真皮成纖維細(xì)胞形成為潛在真皮替代物。由于眾所周知，人類真皮成纖維細(xì)胞在移植到同種異體接受者時是相對不產(chǎn)生免疫性的(美國專利第5460939號)，真皮成纖維細(xì)胞可以是同種異體源.此組織樣片具有作為真皮等效物的潛能，其材料容易得到，其沒有可能在一些病人中導(dǎo)致發(fā)炎反應(yīng)的人工或自然外源基體，其是細(xì)胞的，從而它可以產(chǎn)生生長因子或其它蛋白質(zhì)，其可以在相對短的時間中制備，其制備在技術(shù)上是簡單的，從而產(chǎn)品更有成本效益。
在本發(fā)明的另一實施例中，通過巨團(tuán)培養(yǎng)，從脂肪基質(zhì)細(xì)胞源生骨細(xì)胞產(chǎn)生具有骨樣性質(zhì)的組織樣團(tuán)，其作為公認(rèn)組織替代物可以具有致使在骨折中小的不一致缺口的愈合的潛能。這可以成為可能的自體療法。此組織樣團(tuán)可以具有成本效益的細(xì)胞移植的潛能，而不用外源支架，其可以致使在骨中小缺口的愈合。在本發(fā)明中，組織樣構(gòu)建體也由骨源造骨細(xì)胞制備。
在本發(fā)明的又一實施例中，組織樣片是由人類軟骨細(xì)胞生長出來，作為對有關(guān)節(jié)軟骨損傷的病人的公認(rèn)移植誘導(dǎo)軟骨修復(fù)。由于軟骨細(xì)胞可以從軟骨的小型活組織檢查中得到，自體軟骨細(xì)胞可以用于此組織療法。此組織樣片可具有成為預(yù)制組織的潛能，其當(dāng)移植到受傷處時可以有效地誘導(dǎo)軟骨修復(fù)，并且其有成本效益。
在本發(fā)明的另外實施例中，由巨團(tuán)培養(yǎng)在海綿膠中產(chǎn)生微觀三維組織樣組構(gòu)。
總之，由巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的本發(fā)明組織樣構(gòu)建體可具有成為活的、細(xì)胞的組織替代物的潛能，其不需要支架和外源細(xì)胞外基體，并且其在技術(shù)上簡單可行，因此有成本效益。詳細(xì)描述為治療目的的本發(fā)明組織樣結(jié)構(gòu)也可以同時發(fā)現(xiàn)其它用途，例如在試管中藥物測試等。
6.


在附圖中進(jìn)一步說明本發(fā)明的優(yōu)選實施例，說明如下—— 圖1，圖片表示在3.5cm器皿中通過巨團(tuán)培養(yǎng)由(a)真皮成纖維細(xì)胞(b)脂肪基質(zhì)細(xì)胞(c)軟骨細(xì)胞(d)造骨細(xì)胞形成的宏觀組織樣結(jié)構(gòu)。
圖2，細(xì)胞與細(xì)胞粘附作用導(dǎo)致在脂肪基質(zhì)細(xì)胞巨團(tuán)培養(yǎng)中發(fā)生的組織樣結(jié)構(gòu)形成(a)在巨團(tuán)培養(yǎng)開始之后一小時(b)在巨團(tuán)培養(yǎng)開始之后六小時。
圖3，由真皮成纖維細(xì)胞巨團(tuán)培養(yǎng)形成的組織片的組織學(xué)檢驗(a)蘇木精和曙紅著色表示三維組構(gòu)(b)Masson-Trichome著色表示膠原質(zhì)合成。
圖4，由來自脂肪基質(zhì)細(xì)胞的生骨細(xì)胞的巨團(tuán)培養(yǎng)形成的組織樣構(gòu)建體的組織學(xué)檢驗(a)蘇木精和曙紅著色表示三維組構(gòu)(b)Masson-Trichome著色。
圖5，由軟骨細(xì)胞的巨團(tuán)培養(yǎng)形成的組織樣結(jié)構(gòu)的組織學(xué)檢驗(a)蘇木精和曙紅著色表示三維組構(gòu)(b)Masson-Trichome著色。
圖6，由真皮成纖維細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體的組織切片的膠原質(zhì)類型I免疫著色，表示膠原質(zhì)類型I的陽性檢測。
圖7，用于評估存活能力的通過巨團(tuán)培養(yǎng)的由真皮成纖維細(xì)胞形成的分離組織片再生的細(xì)胞。
圖8，用Reverse Transcriptase-PCR化驗，通過巨團(tuán)培養(yǎng)由真皮成纖維細(xì)胞形成的組織片的基因表達(dá)分析。對應(yīng)公知對于皮膚傷口愈合重要的不同基因的RT-PCR產(chǎn)品電泳化地表現(xiàn)在2％瓊脂糖膠上(M)DNA分子大小標(biāo)記(1)膠原質(zhì)類型I(2)Syndecan 2(3)Tenascin-C(4)脈管內(nèi)皮生長因子(5)膠原質(zhì)類型III(6)Fibronectin(7)角化細(xì)胞生長因子(8)轉(zhuǎn)化生長因子1β。
圖9，由來自脂肪基質(zhì)細(xì)胞的生骨細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體中的基因表達(dá)。RT-PCR產(chǎn)品電泳化地表現(xiàn)在2％瓊脂糖膠上(M)DNA分子大小標(biāo)記(1)膠原質(zhì)類型I(2)Osteopontin(3)副甲狀腺激素受體(4)骨形態(tài)蛋白2(5)骨形態(tài)蛋白質(zhì)4(6)骨形態(tài)蛋白質(zhì)受體IA(7)骨形態(tài)蛋白質(zhì)受體IB。
圖10，由軟骨細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體中的基因表達(dá)。RT-PCR產(chǎn)品電泳化地表現(xiàn)在2％瓊脂糖膠上(M)DNA分子大小標(biāo)記(1)Aggrecan(2)膠原質(zhì)類型II(3)膠原質(zhì)類型X。
圖11，在條件性生骨培養(yǎng)基存在下由來自脂肪基質(zhì)細(xì)胞的生骨細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體中的組織學(xué)分析，表示(a)在組織樣構(gòu)建體中病灶真骨形成(Masson-Trichome)以及(b)病灶鈣沉積(Von Kossa)，證明了由巨團(tuán)培養(yǎng)形成的組織樣構(gòu)建體的特性可以由培養(yǎng)基中的變化來調(diào)節(jié)。
圖12，在(a)DMEM+10％FCS(b)軟骨形成培養(yǎng)基存在下，由軟骨細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體的組織切片(甲苯胺藍(lán)著色)，表示在(b)中特定軟骨細(xì)胞外基體的形成，證明了由巨團(tuán)培養(yǎng)形成的組織樣構(gòu)建體的特性可以由培養(yǎng)基中的變化來調(diào)節(jié)。
圖13，由真皮成纖維細(xì)胞和膠原質(zhì)+血纖維蛋白膠形成的組織樣片組成的合成物的組織切片(Masson-Trichome著色)，證明了由巨團(tuán)培養(yǎng)形成的組織樣組構(gòu)可以作為物體的成分。
圖14，在海綿膠中巨團(tuán)培養(yǎng)的組織切片(蘇木精和曙紅著色)，表示形成的微觀三維組織樣組構(gòu)群。
在下面部分中將更詳細(xì)地說明本發(fā)明的其它多方面。
7.材料和方法 本發(fā)明的發(fā)明人闡明了，在本發(fā)明的整個說明全文和附加的權(quán)利要求中，盡管培養(yǎng)器皿的面積是按照圓形培養(yǎng)器皿的直徑來表示的，所述的方面實際上包括任何形狀的培養(yǎng)器皿，其面積與所述直徑的圓形器皿相同。再者，盡管在此說明書中所述的操作涉及具有平底的器皿，巨團(tuán)培養(yǎng)可以在具有平底或非平底部的培養(yǎng)器皿中實現(xiàn)。
7.1.細(xì)胞分離、培養(yǎng)基和培養(yǎng)—— 在本發(fā)明中，人類真皮成纖維細(xì)胞是從人類皮膚活組織檢查中分離。通過用Dispase處理將真皮與表皮分開(Sigma，St.Louis，美國)。
將真皮切碎并用0.01％膠原酶在DMEM+10％FCS中過夜消化，然后使細(xì)胞附著。將細(xì)胞在37℃的DMEM+10％FCS中并在5％CO2中培養(yǎng)，并用胰島素-EDTA溶液繼代培養(yǎng)。依照Zuk等人(2001)描述的方案，從人類吸脂物質(zhì)中分離脂肪基質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞保留在DMEM+10％FCS中。依照Zuk等人(2001)描述的方案，誘導(dǎo)這些細(xì)胞生骨分化。在DMEM+10％FCS的維持培養(yǎng)基中培育之前，通過切碎軟骨并用膠原酶處理，將軟骨細(xì)胞從人類軟骨碎片中分離。通過類似步驟將造骨細(xì)胞從人骨中分離并且保留在含有50μg/ml的抗壞血酸維生素C的DMEM+10％FCS中。條件性生骨培養(yǎng)基是通過使用其中生長有生骨脂肪基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基作為生骨培養(yǎng)基的組成部分而制備的，該培養(yǎng)基用于相同細(xì)胞的繼代培養(yǎng)。依照Zuk等人(2001)制備軟骨形成培養(yǎng)基。
7.2.組織樣構(gòu)建體的形成 通過巨團(tuán)培養(yǎng)實現(xiàn)組織樣構(gòu)建體的形成，是前面在本發(fā)明的說明書中所定義的本發(fā)明的新方法。
培養(yǎng)的細(xì)胞是用胰島素-EDTA收獲的。它們在適當(dāng)量的培養(yǎng)基中重新懸浮并優(yōu)選在孔直徑3.5cm的培養(yǎng)器皿中以大約106細(xì)胞每cm2的接種密度或在巨團(tuán)有利范圍內(nèi)的組織形成細(xì)胞密度來接種。因此，優(yōu)選地，為形成單個組織，在六孔板(9.6cm2面積)的單個孔中接種總計107細(xì)胞。對于更小或更大的組織樣構(gòu)建體，調(diào)整接種的細(xì)胞總數(shù)從而達(dá)到對于組織樣組構(gòu)的有利接種密度。
7.3.組織學(xué)分析 在形成后，將組織樣構(gòu)建體固定并處理以進(jìn)行組織學(xué)檢驗。依照Zuk等人(2001)和Bancroft等人(1994)所述方法，在本發(fā)明的合適組織構(gòu)建體上進(jìn)行Von Kossa著色和Alcian藍(lán)著色。通過Bancroft等人(1994)所述方法進(jìn)行油紅O著色。甲苯胺藍(lán)著色按如下進(jìn)行——在切片的去石蠟作用和水合作用后，它們在2％甲苯胺藍(lán)水溶液中著色1分鐘，然后在水中洗2-3分鐘。其后切片在2次更換的100％丙酮中進(jìn)行脫水，然后在二甲苯中清洗并放好。
7.4.免疫組織化學(xué)—— 使用羊抗膠原質(zhì)類型I的抗體和Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，USA的ABC著色系統(tǒng)在石蠟包埋的組織的切片上進(jìn)行膠原質(zhì)類型I免疫著色。
7.5.在形成的組織樣構(gòu)建體中細(xì)胞的存活能力—— 將本發(fā)明的組織團(tuán)切碎，用0.5mg/ml膠原酶在無血清DMEM消化15分鐘，并且將釋放出的細(xì)胞重新懸浮在生長培養(yǎng)基中。用臺盼藍(lán)著色等分試樣。將細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中以評估存活能力。
7.6.基因表達(dá)分析 用Reverse Transcriptase-PCR分析在由真皮成纖維細(xì)胞、生骨脂肪基質(zhì)細(xì)胞和軟骨細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體中的基因表達(dá)。運(yùn)用Trizol(Gibco-BRL，Grand Island，USA)組織樣構(gòu)建體中提取RNA。應(yīng)用特用于各自基因的引物和Titan One-Tube RT-PCR系統(tǒng)(Roche，Mannheim，Germany)進(jìn)行RT-PCR。
7.7膠原質(zhì)+血纖維蛋白膠制備—— 對于膠原質(zhì)+血纖維蛋白膠的制備，將134μl的在0.1N乙酸中的3.33mg/ml鼠尾膠原質(zhì)類型I(Sigma，St.Louis，USA)、8μl的4N NaOH、165μl的28.8mg/ml纖維蛋白原(在1X DMEM中)和210μl的1.48mg/ml凝血酶(在1.66X DMEM中)混合。將混合物在37℃下膠化2小時。
7.8在明膠海綿中通過巨團(tuán)培養(yǎng)的組織形成 所用的海綿膠是AbGel(Sri Gopal Krishna Labs.Pvt.Ltd，Mumbai，India)。
8.結(jié)果和討論 8.1.三維組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體的形成—— 通過巨團(tuán)培養(yǎng)，在DMEM+10％FCS的存在下由真皮成纖維細(xì)胞形成片狀組織樣團(tuán)(圖1)，該片狀組織樣團(tuán)從生長面上自然地分離或通過用鈍器具輕剝來分離。脂肪基質(zhì)細(xì)胞也在DMEM+10％FCS中形成組織樣團(tuán)，其通過油紅O著色對脂類是陰性的。由于如此，為從脂肪基質(zhì)細(xì)胞中形成可用的組織，它們分化為生骨細(xì)胞，其通過巨團(tuán)培養(yǎng)形成相似的片，該片可以在分離后在進(jìn)一步培育中壓縮為緊密團(tuán)。從人軟骨分離的軟骨細(xì)胞在DMEM+10％FCS中巨團(tuán)培養(yǎng)時也形成了這樣的片。在洗去含有抗壞血酸維生素C的維持培養(yǎng)基之后，從人骨中分離的造骨細(xì)胞也通過在DMEM+10％FCS中巨團(tuán)培養(yǎng)形成這種組織片。如圖2所示，細(xì)胞的結(jié)合看起來在這種組織樣構(gòu)建體形成中起重要作用，如同從廣泛的細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)合延伸形成中所看到的。當(dāng)通過在8.5cm佩氏培養(yǎng)皿中以所述接種密度來接種細(xì)胞擴(kuò)大真皮成纖維細(xì)胞巨團(tuán)培養(yǎng)時，形成更大的片。因此，表明巨團(tuán)培養(yǎng)可以直接擴(kuò)大范圍以得到所希望的大組織。真皮成纖維細(xì)胞也通過巨團(tuán)培養(yǎng)在無血清DMEM中形成片，但形成時間比在含有10％FCS的DMEM中多，在含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基中過夜相當(dāng)于3-4小時。在含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，從真皮成纖維細(xì)胞、從源自它們的脂肪基質(zhì)細(xì)胞和生骨細(xì)胞的組織形成時間是大約4小時，而從軟骨細(xì)胞是大約18小時。當(dāng)清洗細(xì)胞以除去含抗壞血酸維生素C的生骨培養(yǎng)基之后，源自脂肪基質(zhì)細(xì)胞的生骨細(xì)胞在生骨培養(yǎng)基中和在DMEM+10％FCS中形成組織樣團(tuán)。已經(jīng)在直徑0.75cm到8.5cm的培養(yǎng)器皿中成功地實現(xiàn)了通過巨團(tuán)培養(yǎng)的組織樣構(gòu)建體的產(chǎn)生?？梢酝茢?，在直徑小于0.75cm和直徑大于8.5cm的培養(yǎng)器皿中會分別導(dǎo)致更小或更大的組織樣構(gòu)建體的形成。因此，三維組織樣構(gòu)建體的大小可以改變。
盡管這些組織樣構(gòu)建體不是全部形成組織，它們可能能夠以與下面的發(fā)現(xiàn)相似的方式誘導(dǎo)并參與身體的痊愈過程，即，完全干細(xì)胞(even stem cell)或部分分化細(xì)胞(其沒有全部形成組織而是處于組織形成的剛剛開始)的移植可以導(dǎo)致修復(fù)和再生(Kaji和Leiden，2001)。
據(jù)發(fā)現(xiàn)，通過巨團(tuán)培養(yǎng)的三維組織樣團(tuán)形成現(xiàn)象取決于細(xì)胞接種密度。為檢驗可否可在高密度下形成組織，將真皮成纖維細(xì)胞在每單位面積不同的細(xì)胞密度范圍內(nèi)接種。我們發(fā)現(xiàn)，實際片形成發(fā)生在3.33×105細(xì)胞每cm2，而在6.66×104細(xì)胞每cm2(小五倍)或更低的接種密度時，沒有形成組織片。同樣，組織片形成發(fā)生在3×106細(xì)胞每cm2(小五倍)或更低的接種密度，而不是7×106細(xì)胞每cm2或以上；在后者的接種密度下，細(xì)胞只是松散地叢生在一起，但沒有形成粘合的組織團(tuán)。因此，組織片形成發(fā)生在3.33×105細(xì)胞每cm2和3×106細(xì)胞每cm2以及位于該經(jīng)過檢驗過的二者之間的的所有密度。在檢驗過的大于或低于此范圍的密度，沒有發(fā)生組織形成。用天然脂肪基質(zhì)細(xì)胞和軟骨細(xì)胞做類似試驗，結(jié)果列于表1中。如同使用真皮成纖維細(xì)胞，對于這些細(xì)胞類型也有類似于真皮成纖維細(xì)胞的最小和最大組織樣構(gòu)建體形成接種密度。這些數(shù)據(jù)表明，對于通過巨團(tuán)培養(yǎng)的組織形成存在最小和最大細(xì)胞接種密度每單位面積。通過巨團(tuán)培養(yǎng)的組織形成的高細(xì)胞密度范圍對于未檢驗的其它細(xì)胞類型可能是不同的。
如表1所示，使用的細(xì)胞的較低接種密度導(dǎo)致較薄組織樣構(gòu)建體，也就是，具有較小的三維，而使用的細(xì)胞的較高接種密度導(dǎo)致較厚組織樣構(gòu)建體，也就是，具有較大的三維。因此，三維組織樣構(gòu)建體的大小是可以變化的。
表1.三維組織樣構(gòu)建體形成對細(xì)胞接種密度的依賴 8.2.組織學(xué)(圖3，4，5) 本發(fā)明的不同組織樣構(gòu)建體的切片的蘇木精和曙紅著色表示三維結(jié)構(gòu)的組構(gòu)和細(xì)胞外基體形成。由真皮成纖維細(xì)以及天生基質(zhì)細(xì)胞和生骨基質(zhì)細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體的Masson-Trichome著色表示膠原質(zhì)合成。由真皮成纖維細(xì)胞培育10天形成的組織樣構(gòu)建體的膠原質(zhì)類型I免疫著色表示對于膠原質(zhì)類型I的陽性著色(圖6)。因此，細(xì)胞外基體形成看起來正發(fā)生在通過巨團(tuán)培養(yǎng)方法的組織樣構(gòu)建體形成中。
8.3.在形成的組織樣構(gòu)建體中細(xì)胞的存活能力—— 通過臺盼藍(lán)著色從由真皮成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞形成的組織中再分離的細(xì)胞具有大于98％的存活能力；來自由脂肪基質(zhì)細(xì)胞形成的組織團(tuán)的細(xì)胞是大約90％可存活的。覆蓋分離的細(xì)胞和群以評估再生力，發(fā)現(xiàn)其在每種情況下是可存活的，如圖7所示，其表明細(xì)胞從解離的真皮成纖維細(xì)胞組織片群中長出。
8.4.組織樣構(gòu)建體的表達(dá)分析—— 為評估由真皮成纖維細(xì)胞形成的組織片是否具有作為真皮替代物的潛能，分析公知的在皮膚的傷口愈合中起重要作用的基因的表達(dá)(圖8)。在組織片中發(fā)現(xiàn)表達(dá)膠原質(zhì)類型I、膠原質(zhì)類型III、角化細(xì)胞生長因子、TGFβ1、纖連蛋白、脈管內(nèi)皮生長因子、tenascin-C和syndecan-2，因此證明了由真皮成纖維細(xì)胞形成的此組織樣片具有作為真皮替代物的潛能。為評估由生骨脂肪基質(zhì)細(xì)胞形成的組織片是否具有作為骨樣替代物的潛能，分析特定骨表達(dá)基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)組織樣構(gòu)建體表達(dá)膠原質(zhì)類型I、osteopontin、副甲狀腺激素受體、骨形態(tài)蛋白質(zhì)2、骨形態(tài)蛋白質(zhì)4、骨形態(tài)蛋白質(zhì)受體IA、IB和II，因此證明了其除了下面提及的病灶鈣化和實際骨針形成之外的骨樣性質(zhì)(圖9)。類似地，評估由軟骨細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體作為軟骨組織替代物的潛能。除了下面提及的特定軟骨細(xì)胞外基體的形成以外，發(fā)現(xiàn)表達(dá)了特異軟骨表達(dá)基因膠原質(zhì)類型II、aggrecan和膠原質(zhì)類型x，從而證明了其軟骨樣性質(zhì)(圖10)。
8.5.通過組織形成培養(yǎng)基的非固定性調(diào)節(jié)組織樣構(gòu)建體特性 在巨團(tuán)培養(yǎng)中，通過包含合適培養(yǎng)基成分或通過改變培養(yǎng)基來制定形成的組織特性是可能的，這是由于，至今被證明，只要阻礙巨團(tuán)組織樣組構(gòu)的東西沒有含在培養(yǎng)基中，組織形成不依賴于培養(yǎng)基條件。從對于在含血清和無血清培養(yǎng)基中由真皮成纖維細(xì)胞形成組織片，以及對于在DMEM+FCS和包含地塞米松和β-甘油磷酸的生骨培養(yǎng)基中由脂肪基質(zhì)細(xì)胞形成組織來看，這一點是明顯的。因此，可以通過改變組織形成培養(yǎng)基和/或細(xì)胞生長培養(yǎng)基來調(diào)節(jié)形成的組織特性以包含理想的特性。例如，如同本發(fā)明所述，通過在條件性生骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞并形成組織樣構(gòu)建體，在由脂肪基質(zhì)細(xì)胞形成的組織中誘導(dǎo)在實際骨形成的形狀中的骨樣特性，與在單獨的生骨培養(yǎng)基相比，其中沒有看到實際骨針(圖11)。在條件性生骨培養(yǎng)基存在下由生骨基質(zhì)細(xì)胞形成的組織團(tuán)的Von Kossa著色表明了鈣化的病灶區(qū)域，從而證明了骨樣特性，而在非條件性的生骨培養(yǎng)基中由生骨基質(zhì)細(xì)胞形成的組織構(gòu)建體沒有表現(xiàn)出這些特性。
這種調(diào)節(jié)的另一實例是在DMEM+10％FCS存在下或在含有1％FCS和胰島素的軟骨形成培養(yǎng)基存在下，由軟骨細(xì)胞形成組織樣構(gòu)建體；并且TGFβ1作為軟骨誘導(dǎo)劑。在由軟骨形成培養(yǎng)基形成的組織樣構(gòu)建體中產(chǎn)生具有軟骨表型的細(xì)胞外基體特征的性質(zhì)，而由DMEM+10％FCS形成的沒有這種性質(zhì)。這由在圖12中的甲苯胺藍(lán)著色說明。因此，正如它表明的，由巨團(tuán)培養(yǎng)的組織形成沒有特定復(fù)雜培養(yǎng)基要求，這種特定成分可以用于在培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)形成的組織的特性。組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體可以在不同培養(yǎng)基的存在下形成，這也符合上述結(jié)果，并且這里所述的不同培養(yǎng)基是例證，于此，本發(fā)明并不限制于這些例證。
8.6.對于巨團(tuán)培養(yǎng)的生長表面—— 由覆蓋在塑料表面的細(xì)胞形成的組織樣片具有自然分離和彎曲或卷起的傾向，因為片一旦卷起就不直，所以這是不希望的?，F(xiàn)開發(fā)的可用用作真皮替代物的組織要求保持平直。對此，在放在塑料器皿中的Hybond-N(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK)過濾器上進(jìn)行真皮成纖維細(xì)胞的巨團(tuán)培養(yǎng)。隨著此改裝，形成的片保持平直并且附著在過濾器上，所以，在將來，它可以過濾器在其上而應(yīng)用到皮膚傷口。此實驗證明了，通過在不同相容生長表面上巨團(tuán)培養(yǎng)可實現(xiàn)組織形成。因此，這樣，由巨團(tuán)培養(yǎng)形成的片變?yōu)楣J(rèn)移植物的成分，其包含用作支持層的尼龍過濾器，并且它不需要用于細(xì)胞組織樣組構(gòu)的支架。此支持層并不計劃與真皮樣片一起結(jié)合到身體中，所以它不是會變?yōu)樯眢w一部分的支架，而是對真皮樣片應(yīng)用的支持處理裝置。此支持層在愈合后要除去。
8.7.作為目的物的成分的組織樣構(gòu)建體—— 為證明組織樣構(gòu)建體可以引入變?yōu)?較大)目的物的成分或部分，接種真皮成纖維細(xì)胞，通過巨團(tuán)培養(yǎng)形成組織樣片，然后在除去培養(yǎng)基后，用膠原質(zhì)和血纖維蛋白膠混合物覆蓋它。然后可以放置該凝膠。現(xiàn)在，可以拿起凝膠并使組織樣片附著在其一側(cè)。圖13表示此組合物的組織切片，其中組織樣構(gòu)建體是其成分。除凝膠和組織樣片之外，例如海綿或膜的其它基體也可以通過附著組織樣構(gòu)建體從一側(cè)支持它們。因此，組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體可以與不同物體組合，例如片或膜、凝膠、海綿或其它基體。
8.8.通過巨團(tuán)培養(yǎng)的微觀三維組織樣組構(gòu)—— 將真皮成纖維細(xì)胞在DMEM+10％FCS中以約3×106細(xì)胞每cm2海綿面積的接種密度接種在直徑3.5cm的海綿膠上。如圖14所示，如同在海綿的組織切片中所看到的，此對于海綿膠的高細(xì)胞接種密度巨團(tuán)培養(yǎng)方法的應(yīng)用導(dǎo)致在海綿中三維組織樣組構(gòu)的微觀群的形成。因此，巨團(tuán)培養(yǎng)方法也可以用于產(chǎn)生在微觀水平上的細(xì)胞三維組織樣組構(gòu)，組織樣組構(gòu)變?yōu)檎麄€集合體的成分。
9.結(jié)束語 如同在此說明中詳述的，本發(fā)明的新穎性在于，高細(xì)胞接種密度培養(yǎng)可以產(chǎn)生細(xì)胞的完整三維組織樣組構(gòu)并且不需要有助于組織形成的任何媒介來誘導(dǎo)這種組構(gòu)，并且擴(kuò)大面積以產(chǎn)生不同種類的宏觀三維組織樣構(gòu)建體，此外還在于其它重要特性，例如，不使用支架材料或者不需要有助于組織形成的特定媒介/復(fù)雜培養(yǎng)基配方。本發(fā)明的發(fā)明人第一個提出，完整三維組織樣組構(gòu)和不同種類的宏觀三維組織樣構(gòu)建體可以僅靠高細(xì)胞接種密度培養(yǎng)產(chǎn)生。
其它中胚層細(xì)胞或者內(nèi)皮或外胚層源細(xì)胞也可以通過巨團(tuán)培養(yǎng)形成這種組織樣組構(gòu)是可能的。因此，通過巨團(tuán)培養(yǎng)由任何類型哺乳動物細(xì)胞形成的組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體，如果它們是可能的話，是在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其界定的特征是通過巨團(tuán)培養(yǎng)方法實現(xiàn)的組織樣組構(gòu)。
盡管宏觀組織樣構(gòu)建體是本發(fā)明的優(yōu)選實施例，顯然地，在培養(yǎng)面積上小于大約0.75cm直徑的任何東西中，較小規(guī)模的巨團(tuán)培養(yǎng)會產(chǎn)生較小組織樣組構(gòu)，隨著巨團(tuán)培養(yǎng)規(guī)模減小，其大小向微觀減小。在上述形式或其它形式中，例如在前述海綿膠中，通過高細(xì)胞接種密度巨團(tuán)培養(yǎng)的微觀組織樣組構(gòu)也因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)。同樣地，組織樣構(gòu)建體可以在大于8.5cm直徑的培養(yǎng)器皿中通過巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生。
因此，在前述中，已經(jīng)說明了本發(fā)明的具體實施例；對于不同細(xì)胞類型的使用，選擇的生長表面的使用，為調(diào)節(jié)形成的組織特性而改變培養(yǎng)基的使用，組織形成的擴(kuò)大，培養(yǎng)器皿的大小，組織形成高細(xì)胞密度的范圍，以及通過巨團(tuán)培養(yǎng)形成的組織作為其成分的公認(rèn)移植物的產(chǎn)生，已經(jīng)給出實例說明。盡管僅提出了所描述的實施例，它們只是為了例證和說明的目的，并不限制本發(fā)明。
仍然應(yīng)該理解，對于本發(fā)明可以進(jìn)行不同的修改和替代，這是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，發(fā)明人預(yù)期到，一種這樣的修改是將通過巨團(tuán)培養(yǎng)形成的組織團(tuán)封入或封裝到合適凝膠或基體中，或者另一種這樣的修改會是其中將多個組織團(tuán)或片通過一些方法結(jié)合或保持在一起的一種構(gòu)建體。在這樣的構(gòu)建體中，由巨團(tuán)培養(yǎng)形成的組織樣構(gòu)建體現(xiàn)在會成為整個替代物的成分。上面是不同于在結(jié)果中所說明的方法，通過這些方法，由巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的組織樣組構(gòu)和結(jié)構(gòu)可以是目的物的成分。如同在結(jié)果中所述，正如其堅持的，由巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞組織樣組構(gòu)不需要任何支架并且組織學(xué)上符合要求的組織樣構(gòu)建體，也在沒有支架的幫助下形成，可以提供支架用于巨團(tuán)培養(yǎng)，例如，作為選擇的生長表面，以至于支架變?yōu)檎麄€替代物的部分。因此，本發(fā)明的三維組織樣組構(gòu)和組織學(xué)上符合要求的組織樣構(gòu)建體可以發(fā)展為無支架的，但是，如果支架能賦予比單獨的組織樣構(gòu)建體有益的特性或優(yōu)點，其也可以與合適支架組合。其它修改可能是使用具有通過巨團(tuán)培養(yǎng)形成組織樣團(tuán)的特性的其它細(xì)胞類型，使用其它不同于所述的相容性生長表面，用于調(diào)節(jié)的其它培養(yǎng)基的變化和擴(kuò)大的大小等。因此，本發(fā)明的此說明書不是通過所揭示的精確的例證性實施例來限制本發(fā)明。
參考文獻(xiàn)
美國專利文獻(xiàn)
5489304February 1996 Orgill，et al.
5460939October 1995 Harsbrough，et al.
5613982March 1997Goldstein.
20020127711September 2002Kale，et al.
5723331March 1998Tubo，et al.
其它參考文獻(xiàn)
Abu-Absi SF，F(xiàn)riend JR，Hansen LK，Hu W (2002)Structural polarity andfunctional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids.Experimental Cell Research274，56-67.
Ahrens PB，Solursh M，Reiter RS (1977) Stage-related capacity for limbchondrogenesis in cell culture.Developmental Biology 60，69-82.
Baldwin SP，Saltzman WM (2001) Aggregation enhances catecholamine secretionin cultured cells.Tissue Engineering 7(2)179-190.
Bancroft JD，Cook HC (1994) Manual of Histological Techniques and theirDiagnostic Application，Churchill Livingstone，Edinburgh，UK.
Buttery LDK，Bourne S，Xynos JD，Wood H，Hughes FJ，Hughes SPF，Episkopou V，Polak JM (2001) Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation frommurine embryonic stem cells.Tissue Engineering 7(1)89-99.
Davies CdeL，Berk DA，Pluen A，Jain RK (2002) Comparison of IgG diffusion andextracellular matrix composition in rhabdomyosarcomas grown in mice versus invitro as spheroids reveals the role of host stromal cells.British Journal of Cancer86，1639-1644.
Denker AE，Nicoll SB，Tuan RS (1995) Formation of cartilage-like spheroids bymicromass cultures of murineC3HlOT1/2 cells upon treatment with transforminggrowth factor-beta 1.Differentiation 59(1)25-34.
Downie SA，Newman SA(1994) Morphogenetic differences between fore and hindlimb precartilage mesenchymeRelation to mechanisms of skeletal patternformation.Developmental Biology 162，195-208.
Eaglstein WH，F(xiàn)alanga V (1997) Tissue engineering and the developmentofApligrafE)，a human skin equivalent.Clinical Therapeutics 19(5)894-905.Furukawa KS，Ushida T，Sakai Y，Suzuki M，Tanaka J，Tateishi T (2001) Formation of human fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture.CellTransplantation 10，441-445.
Hamamoto R，Yamada K，Kamihira M，Iijima S(1998) Differentiation andproliferation of primary rat hepatocytes cultured as spheroids.Journal ofBiochemistry 124，972-979.
Johnstone B，Hering TM，Caplan AI，Goldberg VM，Yoo JU (1998) In vitrochondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells.Experimental Cell Research 238，265-272.
Kaii EH，Leiden JM (2001) Gene and stem cell therapies.Journal of the AmericanMedical Association 285(5)545-550.
Kale S，Biermann S，Edwards C，Tarnowski C，Morris M，Long MW(2000)Three-dimensional cellular development is essential for ex vivo formation ofhuman bone.Nature Biotechnology 18，954-958.
Kim HW，Han CD (2000) An overview of cartilage tissue engineering.YonseiMedical Journal 41(6)766-773.
Lang SH，Stark M，Collins A，Paul AB，Stower MJ，Maitland NJ(2001)Experimental prostate epithelial morphogenesis in response to stroma andthree-dimensional Matrigel culture.Cell Growth & Differentiation 12，631-640.
L′Heureux N，Paquet S，Labbe R，Germain L，Auger FA(1998) A completelybiological tissue-engineered human blood vessel.FASEB Journal 12，47-56.
Mackay AM，Beck SC，Murphy JM，Barry FP，Chichester CO，Pittenger MF(1998)Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells frommarrow.Tissue Engineering 4(4)415-428.
McPherson JM，Tubo R (2000) Articular cartilage injury.In Principles of TissueEngineering，2nd Edition，Academic Press，San Diego，USA，p.697-709.
Michel M，L′Heureux N，Pouliot R，Xu W，AugerFA，Germain L(1999)Characterization ofa new tissue-engineered human skin equivalent with hair.Invitro Cellular & Developmental Biology-Animal 35，318-326.
Pollok JM，Kluth D，Cusick RA，Lee H，Utsunomiya H，Ma PX，Langer R，BroelschCE，Vacanti JP (1998) Formation of spheroidal aggregates of hepatocytes onbiodegradable polymers under continuous flow bioreactor conditiohs.Journal ofPediatric Surgery 8，195-199.
Service RF(2000)Tissue engineers build new bone.Science 289，1498-1500.Shinji T，Koide N，Tsuji T(1988) Glycosaminoglycans partially substitute forproteoglycans in spheroid formation of adult rat hepatocytes in primary culture.Cell Structure & Function 13，179-188.
Takezawa T，Mori Y，Yonaha T，Yoshizato K (1993) Characterization ofmorphology and cellular metabolism during the spheroid formation by fibroblasts.Experimental Cell Research 208，430-441.
Yamada K，Kamihira M，Hamamoto R，Iijima S(1998) Efficient induction ofhepatocyte spheroids in a suspension culture using a water-soluble syntheticpolymer as an artificial matrix.Journal of Biochemistry 123，1017-1023.
Yoon Y，Oh C，Kim D，Lee Y，Park J，Huh T，Kang S，Chun J (2000) Epidermalgrowth factor negatively regulates chondrogenesis of mesenchymal cells bymodulating the protein kinase C-a，Erk-1，and p38 MAPK signaling pathways.
Journal of Biological Chemistry 275(16)12353-12359.
Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，Huang J，F(xiàn)utrell JW，Katz AJ，Benhaim P，Lorenz HP，Hedrick MH(2001) Multilineage cells from human adipose tissueimplications forcell-based therapies.Tissue Engineering 7(2)211-228.
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生細(xì)胞的活組織樣組構(gòu)的方法，也就是巨團(tuán)培養(yǎng)，該組構(gòu)包括三維組織樣構(gòu)建體，巨團(tuán)培養(yǎng)不需要支架或外源基體，該方法包括
培養(yǎng)系統(tǒng)，其中以培養(yǎng)器皿每單位面積的高密度接種細(xì)胞，該密度范圍達(dá)到每cm2大約106個細(xì)胞，從而形成細(xì)胞的三維組織樣組構(gòu)，無需任何有助于組織形成的其它媒介；以及
提供由中胚層細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體，并且可用于其它細(xì)胞類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括使用包含用于組織形成的培養(yǎng)系統(tǒng)的巨團(tuán)培養(yǎng)，其包括
通過高密度細(xì)胞接種，由細(xì)胞產(chǎn)生宏觀或微觀三維組織樣組構(gòu)；以及
在三維空間內(nèi)，以有利的高密度范圍將細(xì)胞緊密放置，這有利于細(xì)胞粘著一起成為三維組織樣狀態(tài)，并且不需要任何有助于組織形成的其它媒介。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其包括由包含人類間充質(zhì)源性成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形成組織樣片，該組織樣片不含會在一些患者體內(nèi)引起發(fā)炎反應(yīng)的人工或天然的外源基體，而且該組織樣片是細(xì)胞性的，因此，可產(chǎn)生生長因子和其它蛋白質(zhì)，并且可在較短時間內(nèi)制得。
4.由間充質(zhì)源性成纖維細(xì)胞形成的權(quán)利要求1所述的包括宏觀三維結(jié)構(gòu)的組織樣構(gòu)建體的細(xì)胞組織樣組構(gòu)，該組構(gòu)用作用于移植、傷口愈合、藥品試驗的體外模型等中的組織替代物，該組構(gòu)包括
工程學(xué)制造由真皮成纖維細(xì)胞形成的公認(rèn)的真皮等效物、由源自脂肪基體細(xì)胞的生骨細(xì)胞形成的具有骨樣特性的公認(rèn)替代物和由軟骨細(xì)胞形成的公認(rèn)的軟骨替代物，但不僅限于這些細(xì)胞類型；以及
產(chǎn)生細(xì)胞組織樣組構(gòu)，所形成的組構(gòu)可為多種形式。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其本質(zhì)上是三維狀，且包括三維宏觀組織樣構(gòu)建體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，為獲得多種特性或性質(zhì)，所形成的組構(gòu)可以是多種形式，所述多種形式包括
由其本身形成的三維宏觀組織樣構(gòu)建體，其中“宏觀”是指組織大小至少可通過正常人的視力在視覺上容易辨別，并且三維宏觀組織樣構(gòu)建體在組織學(xué)上符合要求；以及
將三維宏觀組織樣組構(gòu)與多種基體，如凝膠體、片、膜或海綿組合，或者與其它支架等組合；以及
所述組織樣組構(gòu)是微觀三維結(jié)構(gòu)的形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其包括可以完全僅用細(xì)胞和培養(yǎng)基產(chǎn)生的組織樣組構(gòu)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其中細(xì)胞的組織樣組構(gòu)可不使用任何有助于組織形成的媒介而產(chǎn)生，所述媒介包括
諸如抗壞血酸的組織誘導(dǎo)化學(xué)品；
組織誘導(dǎo)生長因子；以及
具有特別性質(zhì)的基質(zhì)；旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)基；復(fù)合生物反應(yīng)器；或者外源支架或基體或支撐物。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其包括可無需外源細(xì)胞外基體成分而產(chǎn)生的組織樣組構(gòu)。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其由多種細(xì)胞類型所產(chǎn)生，所述細(xì)胞類型包括
真皮成纖維細(xì)胞；
脂肪基質(zhì)細(xì)胞；
源自脂肪基質(zhì)細(xì)胞的生骨細(xì)胞；
軟骨細(xì)胞；以及造骨細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，為使其形成，從而存在有助于組織形成的一定接種密度范圍的細(xì)胞，對于不同細(xì)胞類型，形成組織的高細(xì)胞接種密度的準(zhǔn)確范圍可不同。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其中對于不同細(xì)胞類型或不同培養(yǎng)基條件，組構(gòu)形成的時間可不同。
13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其產(chǎn)生不需要特定培養(yǎng)基條件，所述條件包括
無血清培養(yǎng)基條件；以及
特定復(fù)雜的培養(yǎng)基組成。
14.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)及其多種形式，所述組構(gòu)為三維狀，并且大小不固定，其包括
多種三維尺寸；
通過擴(kuò)大或縮小巨團(tuán)培養(yǎng)形成的較大或較小的組織樣構(gòu)建體；以及
通過擴(kuò)大或縮小巨團(tuán)培養(yǎng)，在組織形成密度的有利巨團(tuán)范圍內(nèi)，通過改變所用細(xì)胞數(shù)量而獲得可變的大小和規(guī)模。
15.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其針對所用培養(yǎng)基具有可變性，包括
在不同培養(yǎng)基、不同的生長和/或組織形成培養(yǎng)基的存在下形成組織樣組構(gòu)；以及
通過在生長和/或組織形成培養(yǎng)基中加入一些成分，條件是這些成分的添加不會負(fù)面影響組織的形成，或者通過改變培養(yǎng)基，條件是培養(yǎng)基的改變不會負(fù)面影響組織的形成，來調(diào)節(jié)組織樣組構(gòu)的特性。
16.根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其包括在多種相容性生長表面或支架上獲得的組織替代物。
17.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其包括在具有水平或彎曲底部的任何形狀的培養(yǎng)器皿中制備組織樣構(gòu)建體。
18.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，其形成的形式可為多種，不同的形式是為了獲得不同的特性或性質(zhì)，所述多種形式包括
具有可以由正常人視力在視覺上容易辨別的大小尺寸的三維宏觀組織樣構(gòu)建體；
在組織學(xué)上符合要求的三維宏觀組織樣構(gòu)建體；
將三維宏觀組織樣構(gòu)建體與不同基體如凝膠體、片、膜或海綿組合，或者與其它支架等組合；以及
微觀三維結(jié)構(gòu)形式的組織樣組構(gòu)。
19.一種產(chǎn)生細(xì)胞的組織樣組構(gòu)的方法，包括構(gòu)成無支架幫助的三維組織樣構(gòu)建體，其包括
采用高細(xì)胞接種密度培養(yǎng)以產(chǎn)生細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，并且不需要使用有助于組織形成的特定媒介和支架；
提供由中胚層細(xì)胞形成的組織樣構(gòu)建體，但并不限于這些細(xì)胞類型；以及
通過產(chǎn)生細(xì)胞的組織樣組構(gòu)來構(gòu)建細(xì)胞的組織樣組構(gòu)以產(chǎn)生多種工程制造的組織產(chǎn)品和形成活的、細(xì)胞的、公認(rèn)的組織替代物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其包括使用培養(yǎng)器皿的每單位面積或空間的高細(xì)胞接種密度，并且無需其它媒介而形成細(xì)胞的組織樣組構(gòu)，并提供宏觀組織樣構(gòu)建體。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其包括通過以培養(yǎng)器皿的每單位面積或空間的高細(xì)胞密度接種細(xì)胞，使用巨團(tuán)培養(yǎng)來形成組織樣組構(gòu)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中巨團(tuán)培養(yǎng)包括組織形成的培養(yǎng)系統(tǒng)，該培養(yǎng)系統(tǒng)包括以培養(yǎng)器皿每單位面積的高密度接種細(xì)胞，該密度范圍達(dá)到每cm2大約106個細(xì)胞，無需任何有助于組織形成的其它媒介；巨團(tuán)培養(yǎng)進(jìn)一步包括在三維空間內(nèi)，以有利的高密度范圍將細(xì)胞緊密放置，且在無需任何有助于組織形成的其它媒介而由細(xì)胞產(chǎn)生宏觀或微觀的三維組織樣組通過將細(xì)胞一起放置在培養(yǎng)器皿底部由細(xì)胞占據(jù)的三維空間內(nèi)，達(dá)到有利的高細(xì)胞接種密度的巨團(tuán)范圍，從而使它們成為互相緊密接近狀態(tài)，這樣引發(fā)或激發(fā)其進(jìn)入組織形成模式，由此它們粘為一體；以及在具有水平或彎曲底部的器皿中達(dá)到細(xì)胞接種密度的巨團(tuán)范圍，由此，使用直徑至少約為0.75cm的培養(yǎng)器皿用于巨團(tuán)培養(yǎng)致使宏觀三維組織樣構(gòu)建體的形成，宏觀定義的組織大小是可以由正常人視力在視覺上容易地辨別出來。
23.一種用于植入人體或哺乳動物體內(nèi)的組織樣構(gòu)建體，其按照產(chǎn)生宏觀組織樣構(gòu)建體和細(xì)胞的全組織樣組構(gòu)的方法制備，不需要任何特定媒介誘導(dǎo)組構(gòu)，并且可以擴(kuò)大以產(chǎn)生宏觀組織樣構(gòu)建體，不需要支架材料和特定媒介/復(fù)合培養(yǎng)基配方，僅由高細(xì)胞接種密度培養(yǎng)而產(chǎn)生，也就是，由包括間充質(zhì)源細(xì)胞的巨團(tuán)培養(yǎng)而產(chǎn)生，其中，形成的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)和公認(rèn)的組織等效物是由間充質(zhì)源性細(xì)胞而形成，其包括由真皮成纖維細(xì)胞工程制造的公認(rèn)的真皮等效物、由源自脂肪基質(zhì)細(xì)胞的生骨細(xì)胞或造骨細(xì)胞形成的具有骨樣特性的公認(rèn)替代物和由軟骨細(xì)胞形成的用于軟骨修復(fù)的公認(rèn)軟骨替代物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組織樣構(gòu)建體，其中
細(xì)胞的組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體是在無需支架或外源基體或復(fù)合生物反應(yīng)器的情況下產(chǎn)生的，以產(chǎn)生作為對病態(tài)或受損狀況的治療而植入人體或哺乳動物體內(nèi)的三維組織樣構(gòu)建體；
組織樣構(gòu)建體的形成無需預(yù)成形的孔，該預(yù)成形的孔具有有害于細(xì)胞附著的表面；以及
所產(chǎn)生的細(xì)胞的組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體無需任何媒介，如組織誘導(dǎo)化學(xué)品、組織誘導(dǎo)生長因子、特殊性質(zhì)的基質(zhì)、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)等。
全文摘要
描述了通過稱作巨團(tuán)培養(yǎng)的高細(xì)胞接種密度培養(yǎng)產(chǎn)生的三維組織樣組構(gòu)。通過巨團(tuán)培養(yǎng)，可以在沒有支架的幫助下使得細(xì)胞將它們自己組織成組織樣形式，并且三維宏觀組織樣構(gòu)建體可以全部由細(xì)胞形成。三維組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體可以由間充質(zhì)源性成纖維細(xì)胞(至少)產(chǎn)生，其可以是分化細(xì)胞或者能產(chǎn)生多種效果的成體干細(xì)胞。在本發(fā)明中，組織樣組構(gòu)和宏觀組織樣構(gòu)建體是由真皮成纖維細(xì)胞、脂肪基質(zhì)細(xì)胞起源的生骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和造骨細(xì)胞形成。導(dǎo)致宏觀組織形成的因素是以每單位面積或三維空間的高細(xì)胞接種密度的大規(guī)模培養(yǎng)，也就是大規(guī)模進(jìn)行的巨團(tuán)培養(yǎng)。對于組織產(chǎn)生，沒有使用支架或外源基體，組織是全部細(xì)胞起源的。對于組織形成沒有使用有助于組織形成的其它媒介(除了高細(xì)胞接種密度之外)，例如組織誘導(dǎo)化學(xué)品、組織誘導(dǎo)生長因子、特殊性質(zhì)的基質(zhì)、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)等。通過高細(xì)胞接種密度的巨團(tuán)培養(yǎng)產(chǎn)生的組織樣組構(gòu)也可以在微觀水平上產(chǎn)生。
文檔編號C12N5/08GK1938419SQ20048004264
公開日2007年3月28日 申請日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月31日
發(fā)明者馬尼沙·沙拉德錢德拉·德什潘德, 馬諾耶·維諾依·莫扎達(dá)爾 申請人:利萊恩斯生命科學(xué)有限公司