專利名稱：使用dna微陣列的核酸檢測(cè)方法以及核酸檢測(cè)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到使用在基因診斷、DNA序列解析、或基因多態(tài)性解析等生物技術(shù)領(lǐng)域、特別是在基因檢查領(lǐng)域中使用的DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法和核酸檢測(cè)裝置、以及DNA微陣列。
背景技術(shù)：
以人類基因組計(jì)劃為首的各種生物的基因堿基序列解析計(jì)劃急速進(jìn)展，龐大的堿基序列信息正在蓄積。人類基因組的全堿基序列已在決定中。今后，通過對(duì)生物體中基因的功能的闡明，在各種疾病的診斷、醫(yī)藥品的開發(fā)、農(nóng)作物的品種改良等范圍廣泛的領(lǐng)域中基因相關(guān)技術(shù)的開發(fā)會(huì)飛躍進(jìn)步。作為這些新領(lǐng)域發(fā)展基礎(chǔ)的是堿基序列信息和基因的表達(dá)以及功能信息。作為大規(guī)模進(jìn)行基因的功能和表達(dá)解析，發(fā)展為基因檢查的技術(shù)，Affymetrix公司、Nanogen公司等正在開發(fā)DNA芯片或DNA微陣列(以下將兩者總稱為DNA微陣列)。然而，現(xiàn)在的很多DNA微陣列由于是以熒光檢測(cè)作為基本原理的，需要激光或復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，系統(tǒng)大型化、且價(jià)格昂貴。
而現(xiàn)在開發(fā)的DNA微陣列是檢測(cè)樣品中有無基因的DNA微陣列。與此相對(duì)，能夠?qū)悠分谢蚨康腄NA微陣列很少。
因此，鑒于上述的實(shí)際狀況，本發(fā)明目的在于提供使用能夠高精度地對(duì)樣品中含有的核酸定量的DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法和核酸檢測(cè)裝置，以及DNA微陣列。

發(fā)明內(nèi)容
達(dá)到上述目的的本發(fā)明包含以下內(nèi)容。
(1)使用DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法，其特征是包括以下工序使含有核酸的樣品作用于備有包含可與所定核酸雜交的核酸探針的多個(gè)核酸探針部的DNA微陣列的工序，對(duì)于上述多個(gè)核酸探針部中的每一個(gè)，監(jiān)測(cè)核酸探針與所定核酸雜交的輸出，獲得有關(guān)上述多個(gè)核酸探針部中的每一個(gè)的輸出超過所定值的時(shí)間的次數(shù)分布的工序，和根據(jù)由在上述工序中得到的次數(shù)分布進(jìn)行規(guī)則化求得的最大值，對(duì)樣品中含有的上述所定核酸進(jìn)行定量的工序。
(2)權(quán)利要求1所述的使用DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法，其特征是上述DNA微陣列在柵絕緣物表面直接或借助于載體固定核酸探針，備有對(duì)應(yīng)于上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管，對(duì)來自該絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管的輸出進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
(3)權(quán)利要求1所述的使用DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法，其特征是在使含有上述核酸樣品作用的工序中，在上述DNA微陣列上以該核酸為模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
(4)權(quán)利要求3所述的使用DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法，其特征是上述核酸擴(kuò)增是通過恒溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行的。
(5)核酸檢測(cè)裝置，其特征是備有安裝DNA微陣列的測(cè)定部，該DNA微陣列配備含有可與所定核酸雜交的核酸探針的多個(gè)核酸探針部，對(duì)來自安裝在上述測(cè)定部的DNA微陣列的各個(gè)核酸探針部的輸出進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)部，和取得有關(guān)上述多個(gè)核酸探針部在上述檢測(cè)部檢測(cè)的輸出超過所定值的時(shí)間的次數(shù)分布，根據(jù)規(guī)則化求得的平均值，對(duì)樣品中含有的上述所定核酸進(jìn)行定量的演算部。
(6)權(quán)利要求5所述的核酸檢測(cè)裝置，其特征是上述DNA微陣列在柵絕緣物表面直接或借助于載體固定有核酸探針，備有對(duì)應(yīng)于上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管，上述檢測(cè)部對(duì)來自該絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管的輸出進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
(7)權(quán)利要求5所述的核酸檢測(cè)裝置，其特征是上述DNA微陣列配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，上述所定的核酸與上述核酸探針的雜交時(shí)間在各個(gè)區(qū)段是不同的。
(8)配備含有可與所定的核酸雜交的核酸探針的多個(gè)核酸探針部的DNA微陣列。
(9)權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是含有對(duì)應(yīng)于上述多個(gè)核酸探針部配設(shè)的、對(duì)所定核酸與核酸探針的雜交進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)部。
(10)權(quán)利要求9所述的DNA微陣列，其特征是上述檢測(cè)部是絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管。
(11)權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，在上述多個(gè)區(qū)段中，上述所定核酸與上述核酸探針的雜交時(shí)間不同。
(12)權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，在上述多個(gè)區(qū)段中，上述核酸探針部中的核酸探針的密度不同。
(13)權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，在上述多個(gè)區(qū)段中，上述核酸探針部的面積不同。
(14)權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，在上述多個(gè)區(qū)段中，上述核酸探針的長度不同。


圖1是表示適用本發(fā)明的DNA微陣列的模式斜視圖。
圖2是DNA微陣列的主要部分剖面圖。
圖3是表示適用本發(fā)明核酸檢測(cè)裝置的模式構(gòu)成圖。
圖4是流動(dòng)池主要部分剖面圖。
圖5是將流動(dòng)池分解表示的主要部分剖面圖。
圖6是表示來自多個(gè)核酸探針部的輸出的特性圖。
圖7是表示根據(jù)來自多個(gè)核酸探針部的輸出，在信號(hào)處理電路中處理結(jié)果的特性圖。
圖8是使用參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管，對(duì)來自多個(gè)核酸探針部的輸出測(cè)定時(shí)的電路構(gòu)成圖。
圖9是表示適用本發(fā)明的其他DNA微陣列例子的模式斜視圖。
圖10是表示在DNA微陣列上進(jìn)行核酸擴(kuò)增的各個(gè)工序模式的DNA微陣列的主要部分剖面圖。
圖11是表示由核酸探針開始單鏈核酸延伸狀態(tài)模式的DNA微陣列主要部分剖面圖。
圖12是表示由核酸探針延伸的單鏈核酸呈現(xiàn)的高級(jí)結(jié)構(gòu)模式的DNA微陣列主要部分剖面圖。
圖13是表示使用兩種探針在DNA微陣列上檢測(cè)時(shí)的各個(gè)工序模式的DNA微陣列主要部分剖面圖。
圖14是表示使嵌入劑作用的狀態(tài)的DNA微陣列主要部分剖面圖。
具體實(shí)施例方式
為了更詳細(xì)地?cái)⑹霰景l(fā)明，根據(jù)附圖進(jìn)行說明。在以下圖中，對(duì)于同樣功能部分附予同樣符號(hào)來進(jìn)行說明。
［實(shí)施例1]作為實(shí)施例1，對(duì)適用本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法，對(duì)所定基因(以下稱為靶基因)含有的單堿基多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)的方法進(jìn)行說明。
圖1是本方法中使用的DNA微陣列1的梗概斜視圖，圖2是該DNA微陣列1的主要部分剖面圖。DNA微陣列1就象圖1所表示的那樣，備有配置在基板上的多個(gè)核酸探針部2和與這些多個(gè)核酸探針部2對(duì)應(yīng)配置的絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管3。在本例DNA微陣列1中，多個(gè)核酸探針部2被分為兩部分(分別被定為第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b)，在第1區(qū)域3a中檢測(cè)靶基因中一方的多態(tài)性(以下有時(shí)稱為“第1多態(tài)性”)，在第2區(qū)域3b檢測(cè)靶基因中的另外一方的多態(tài)性(以下有時(shí)稱為“第2多態(tài)性”)。
核酸探針部2是在絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的柵電場(chǎng)絕緣物5的表面固定有核酸探針6的結(jié)構(gòu)。絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4備有例如配置在p形硅基板7上作為載波電流供給源的源極8以及取出載波電流的漏極9、配置在這些p形硅基板7、源極8以及漏極9上的柵絕緣物5。
核酸探針6由可與檢測(cè)對(duì)象靶基因雜交的寡核苷酸或cDNA或中間分支的DNA片段構(gòu)成。核酸探針6通常由300個(gè)以下的堿基構(gòu)成，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，可以與檢測(cè)對(duì)象靶基因雜交，對(duì)于寡核苷酸希望是80個(gè)以下堿基長的核酸片段。
在本例DNA微陣列1中，第1區(qū)域3a中的核酸探針6具有可與第1多態(tài)性靶基因雜交、而不與第2多態(tài)性靶基因雜交那樣的序列。另一方面，在第2區(qū)域3b中的核酸探針6具有可與第2多態(tài)性靶基因雜交、而不與第1多態(tài)性靶基因雜交那樣的序列。
柵絕緣物5單獨(dú)或組合使用氧化硅(SiO2)、氮化硅(SiN)、氧化鋁(Al2O3)、氧化鈦(Ta2O5)等材料，通常為了很好保持晶體管動(dòng)作，最好是在氧化硅(SiO2)上將氮化硅(SiN)、氧化鋁(Al2O3)、氧化鈦(Ta2O5)層疊的二層結(jié)構(gòu)。
為了將核酸探針6固定在柵絕緣物5表面，可以用氨基(NH2)、巰基(SH)、生物素等對(duì)核酸探針6的一端進(jìn)行化學(xué)修飾。使用由氨基化學(xué)修飾的核酸探針6時(shí)，用氨基丙基乙氧基硅烷、聚賴氨酸等對(duì)柵絕緣物5的表面進(jìn)行化學(xué)修飾后，將氨基導(dǎo)入絕緣膜表面，與戊二醛或苯二異氰酸酯(PDC)反應(yīng)，將用氨基化學(xué)修飾的核酸探針6固定在柵絕緣物5表面。將用巰基化學(xué)修飾的核酸探針6固定在柵絕緣物5表面時(shí)，在柵絕緣物5表面上形成金薄膜，利用巰基與金的親和性固定核酸探針。另外，在對(duì)用生物素化學(xué)修飾的核酸探針6進(jìn)行固定時(shí)，在柵絕緣物5表面上導(dǎo)入鏈霉抗生物素蛋白，利用生物素與鏈霉抗生物素蛋白的親和性將核酸探針6固定在柵絕緣物5表面。在實(shí)際固定時(shí)，是將含有核酸探針6的溶液只滴在或點(diǎn)在柵絕緣物5表面的所定區(qū)域，只在柵絕緣物5表面的所希望的區(qū)域上固定核酸探針6。
另一方面，也可以在柵絕緣物5表面形成固定化載體，將核酸探針6間接地固定在該固定化載體的表面或內(nèi)部。作為固定化載體的材料，可以使用瓊脂糖、聚丙烯酰胺、聚羥乙基甲基丙烯酸酯(pHEMA)等，用氨基或鏈霉抗生物素蛋白等對(duì)固定化載體進(jìn)行化學(xué)修飾，如上所述，分別利用與戊二醛或PDC、或生物素的親和性，可以將核酸探針固定在固定化載體上。這樣做也可以借助于固定化載體間接地將核酸探針6固定在絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的柵絕緣物5表面上。
在象以上那樣構(gòu)成的DNA微陣列1中，通過使檢查對(duì)象作用，該樣品中含有的靶基因和核酸探針6在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下進(jìn)行雜交。即，對(duì)應(yīng)于樣品中含有的靶基因的多態(tài)性，第1區(qū)域3a以及第2區(qū)域3b中任一方的核酸探針6與靶基因或形成復(fù)合體，或在第1區(qū)域3a以及第2區(qū)域3b的兩方核酸探針6與靶基因都形成復(fù)合體。
在使檢查對(duì)象樣品作用時(shí)使用的緩沖液的pH適當(dāng)條件下，核酸帶負(fù)電。因此，通過核酸探針6與靶基因形成復(fù)合體，在絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的柵絕緣物5附近電荷密度發(fā)生變化，柵絕緣物5的表面電位變化。該變化與一般的絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管的柵電壓變化具有同等的作用，可以使通道的導(dǎo)電率變化。因此，可以作為流過源極8和漏極9之間的漏電流變化，檢測(cè)各個(gè)核酸探針部2中的復(fù)合體的形成。
在對(duì)各個(gè)核酸探針部2中復(fù)合體的形成進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以使用例如圖3所表示的檢測(cè)裝置10。檢測(cè)裝置10備有載置在DNA微陣列1的流動(dòng)池12、用于向流動(dòng)池12供給各種溶液的流路13、與流路13的起端部連接的雜交液14以及洗滌液15、配設(shè)在雜交液14以及洗滌液15和流動(dòng)池12之間的流路13上，對(duì)向流路13供給的雜交液14和洗滌液15進(jìn)行切換的閥16、控制對(duì)流動(dòng)池12的溶液供給的泵17、借助于閥16用于向流路13供給樣品和嵌入劑等的分注器18、接在流路13的終端部的廢液瓶19、對(duì)來自配置在流動(dòng)池12的DNA微陣列1的輸出進(jìn)行處理/演算的信號(hào)處理電路20。
流動(dòng)池12就象圖4所表示的那樣，備有內(nèi)部流路21形成的筐體22、借助于作為信號(hào)線的導(dǎo)線24與DNA微陣列1電連接印刷電路基板25、將印刷電路基板25和信號(hào)處理電路20電連接的管腳26、將導(dǎo)線23與內(nèi)部流路21進(jìn)行隔離的保護(hù)罩27、用于連接內(nèi)部流路21和流路13的螺栓28。另外，圖5給出了流動(dòng)池12的分解剖面圖。
筐體22中的內(nèi)部流路21以例如直徑1mm的孔穿越筐體22內(nèi)部，在筐體22的靠近中心部與DNA微陣列1連接。而內(nèi)部流路21至少與DNA微陣列1的第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b連接。另外，內(nèi)部流路21通過將在內(nèi)部配設(shè)了流路13的螺栓28裝配在筐體22的裝螺栓部29與流路13連接?？痼w22的裝螺栓部29為了裝配螺栓28，形成與螺栓相配的螺紋。
在與流路13中的內(nèi)部流路21連接的端面中，實(shí)施平坦化處理。通過使與流路13中的內(nèi)部流路21連接的端面平坦化，在裝配螺栓28的狀態(tài)下，可以使流路13和內(nèi)部流路21密封，可以防止漏液。
印刷電路基板25借助導(dǎo)線24可以對(duì)對(duì)應(yīng)于多個(gè)核酸探針部2的多個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管3各個(gè)的輸出進(jìn)行檢測(cè)。
保護(hù)罩26可以由例如丙烯、聚丙烯或聚碳酸酯等構(gòu)成，配設(shè)在筐體22和印刷電路基板25之間。保護(hù)罩26由于配設(shè)在筐體22和印刷電路基板25之間，可防止導(dǎo)線24露出到內(nèi)部流路21內(nèi)。
在象以上那樣構(gòu)成的檢測(cè)裝置10中，使用載置在流動(dòng)池12的DNA微陣列，可以對(duì)檢查對(duì)象樣品中含有的靶基因的多態(tài)性進(jìn)行鑒定。具體來說，首先隨著切換閥16使得能夠向流路13只供給雜交液14，驅(qū)動(dòng)泵17。同時(shí)，利用分注器18借助閥16向流路13供給樣品。通過這樣操作，可以向流路13和流動(dòng)池12的內(nèi)部流路21供給含有樣品的雜交液14，可以使樣品作用于DNA微陣列1的第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b。
然后在第1區(qū)域3a或第2區(qū)域3b、或第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b中，樣品中含有的靶基因和具有基因互補(bǔ)序列的核酸探針6進(jìn)行雜交反應(yīng)。換而言之，樣品中含有的靶基因只與第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b中含有的核酸探針6之中的具有互補(bǔ)堿基序列的核酸探針6雜交。反應(yīng)后，供給流路13和內(nèi)部流路21的溶液通過泵17送到廢液瓶19中。
在檢測(cè)裝置10中，核酸探針6和靶基因進(jìn)行雜交(形成復(fù)合體)，絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管3中就出現(xiàn)漏電流變化。在檢測(cè)裝置10中，絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管3中的漏電流變化可以通過印刷電路基板進(jìn)行檢測(cè)，將信號(hào)輸送到信號(hào)處理電路20。在檢測(cè)裝置10中，特別是由于備有多個(gè)核酸探針部2，所以將來自多個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管3的各個(gè)信號(hào)輸送到信號(hào)處理電路20。
此時(shí)，在多個(gè)核酸探針部2中，核酸探針6和靶基因的雜交出現(xiàn)了時(shí)間差。因此，在來自絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的信號(hào)輸出液也產(chǎn)生了時(shí)間差。例如，來自3個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的信號(hào)就象圖6所表示的那樣，都分別帶著時(shí)間差輸出的。
在信號(hào)處理電路20中，對(duì)于來自帶有這樣時(shí)間差的多個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的多個(gè)信號(hào)，測(cè)定超過閾電壓值的時(shí)間，以時(shí)間作為橫軸，以測(cè)定超過閾電壓值的輸出的核酸探針部2的個(gè)數(shù)作為縱軸，獲得次數(shù)分布。另外，在信號(hào)處理電路20中將得到的次數(shù)分布中的平均值作為多個(gè)核酸探針部2中的輸出時(shí)間。
以測(cè)定時(shí)間作為橫軸，以測(cè)定超過閾電壓值的輸出的核酸探針部2的個(gè)數(shù)作為縱軸，獲得次數(shù)分布，例如就象圖7所表示的那樣，得到規(guī)則化分布。此時(shí)，信號(hào)處理電路20作為次數(shù)分布的平均值(此時(shí)為規(guī)則化分布的最大值)，將T3作為輸出時(shí)間。因此，通過信號(hào)處理電路20可以獲得由第1區(qū)域3a含有的多個(gè)核酸探針部2得到的輸出時(shí)間和由區(qū)域3b含有的核酸探針部2得到的輸出時(shí)間。
而在檢測(cè)裝置10中，根據(jù)來自第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b的各個(gè)輸出時(shí)間，可以判別靶基因中的多態(tài)性。即，當(dāng)靶基因是只含有第1多態(tài)性的純合型時(shí)，可以只從第1區(qū)域3a獲得輸出時(shí)間，相反，靶基因是只含有第2多態(tài)性的純合型時(shí)，可以只從第2區(qū)域3b獲得輸出時(shí)間。當(dāng)靶基因是含有第1多態(tài)性和第2多態(tài)性的雜合型時(shí)，可以得到來自第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b兩方的輸出時(shí)間。這樣一來，通過檢測(cè)裝置10就可以由來自第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b的輸出時(shí)間來判別靶基因的多態(tài)性。
通過檢測(cè)裝置10與通過單一核酸探針部判別多態(tài)性時(shí)相比，可以使測(cè)定誤差減小，能夠進(jìn)行更正確的判別。
另外，在檢測(cè)裝置10中，如前所述，不僅可以象上所那樣通過利用信號(hào)處理電路20得到輸出時(shí)間判別靶基因的多態(tài)性，也可以象以下那樣判別靶基因的多態(tài)性。即，信號(hào)處理電路20就第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b分別算出、并比較經(jīng)過所定時(shí)間后輸出信號(hào)的絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的比例。結(jié)果表明當(dāng)?shù)?區(qū)域3a中的比例比第2區(qū)域3b中的比例大時(shí)，可以判別靶基因是只具有第1多態(tài)性的純合型，相反，當(dāng)?shù)?區(qū)域3b中的比例比第1區(qū)域3a中的比例大時(shí)，可以判別靶基因是只具有第2多態(tài)性的純合型。而當(dāng)?shù)?區(qū)域3a中的比例和第2區(qū)域3b的比例同等時(shí)，可以判別靶基因是具有第1多態(tài)性和第2多態(tài)性的雜合型。
另一方面，例如在希望迅速檢測(cè)第1多態(tài)性存在時(shí)，在第1區(qū)域3a含有的核酸探針部2中，通過在獲得來自至少一個(gè)以上核酸探針部2的輸出的時(shí)候的檢測(cè)，也可以判定第1多態(tài)性的存在。通過進(jìn)行這樣判定，可以迅速判定樣品中是否含有第1多態(tài)性。
另外，檢測(cè)裝置10就象圖8所表示的那樣，也可以備有參照電極30以及參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31、獲取來自絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的輸出以及參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的輸出的差分的差分測(cè)定電路32。此時(shí)，在參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物表面固定著不含有與靶基因互補(bǔ)的堿基序列的核酸33。因此，固定在參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物表面的核酸不能與靶基因雜交。
參照電極30，將銀/氯化銀電極或甘汞電極浸漬在例如所定組成·濃度的內(nèi)部溶液中，配設(shè)在由內(nèi)部流路21供給的溶液中攝入的位置。參照電極30可以配設(shè)在例如流動(dòng)池21內(nèi)部。
在這樣構(gòu)成的檢測(cè)裝置10中，絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4中的漏電流變化以表面電位由驅(qū)動(dòng)電路34檢測(cè)，參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31中的漏電流變化以表面電位由驅(qū)動(dòng)電路35檢測(cè)。差分測(cè)定電路32獲得驅(qū)動(dòng)電路34以及驅(qū)動(dòng)電路35各個(gè)表面電位的差分，差分作為來自絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的信號(hào)輸出到信號(hào)處理電路20。
通過進(jìn)行這樣的差分測(cè)定，輸出來自絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的信號(hào)，可以補(bǔ)償各個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的電特性的差別以及由于周圍溫度或光的變化引起的輸出值的變化，另外，可以抵消樣品中的荷電粒子非特異性吸附在柵絕緣物5上引起輸出值的變化。這樣一來，通過檢測(cè)裝置10可以高精度只檢測(cè)到由于靶基因和核酸探針6的雜交引起的輸出變化。
另外，參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31最好集成在與絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4同一基板。通過將參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31集成在與絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4同一基板，可以使絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4和參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31中的電特性一致。
還有，在檢測(cè)裝置10中，在不需要與絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管同樣數(shù)目的參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31，獲得來自多個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的輸出時(shí)，由于可以共同使用一個(gè)參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31，所以只要有一個(gè)以上的參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31就可以。
另外，參照用電極30由于可作為電位測(cè)定基準(zhǔn)使用，所以可以穩(wěn)定地測(cè)定參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31和絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的表面電位。
還有，利用上述檢測(cè)裝置10也可以對(duì)樣品中的靶基因進(jìn)行定量。在對(duì)樣品中的靶基因進(jìn)行定量時(shí)，使用含有預(yù)先濃度已知的靶基因多個(gè)樣品進(jìn)行同樣測(cè)定，預(yù)先求出關(guān)于這些多個(gè)樣品的輸出時(shí)間。然后通過對(duì)測(cè)定對(duì)象樣品的輸出時(shí)間和多個(gè)樣品的輸出時(shí)間進(jìn)行比較，可以對(duì)測(cè)定對(duì)象樣品中含有的靶基因進(jìn)行定量。
此時(shí)，特別是由于使用多個(gè)核酸探針部2可以測(cè)定輸出時(shí)間，所以可以對(duì)由于例如起因于靶基因的非特異的雜交的噪音成分引起的定量誤差進(jìn)行校正。因此，利用測(cè)定裝置10可以對(duì)測(cè)定對(duì)象樣品中含有的靶基因進(jìn)行高精度地定量。
另外，檢測(cè)裝置10就象圖9所表示的那樣，也可以使用備有由第1區(qū)域3a和第2區(qū)域3b構(gòu)成的第1區(qū)段、由第3區(qū)域3c和第4區(qū)域3d構(gòu)成的第2區(qū)段、由第5區(qū)域3e和第6區(qū)域3f構(gòu)成的第3區(qū)段、由第7區(qū)域3g和第8區(qū)域3h構(gòu)成的第4區(qū)段的DNA微陣列。從第1區(qū)域3a至第8區(qū)域3h這些區(qū)域都各有多個(gè)核酸探針部2。第1區(qū)域3a、第3區(qū)域3c、第5區(qū)域3e以及第7區(qū)域3g固定著于靶基因中的第1多態(tài)性雜交的核酸探針6。第2區(qū)域3b、第4區(qū)域3d、第6區(qū)域3f以及第8區(qū)域3h固定著于靶基因中的第2多態(tài)性雜交的核酸探針6。
另外，在第1區(qū)段、第2區(qū)段、第3區(qū)段以及第4區(qū)段中，含有靶基因的核酸與核酸探針6在進(jìn)行雜交之前的時(shí)間被調(diào)節(jié)為相互都不一樣。具體來說，通過將第1區(qū)段中的核酸探針6的固定化密度、第2區(qū)段中的核酸探針6的固定化密度、第3區(qū)段中的核酸探針6的固定化密度以及第4區(qū)段中的核酸探針6的固定化密度做成各不相同的密度，在各個(gè)區(qū)段中進(jìn)行雜交的時(shí)間就變得各不相同了。另外，通過將第1區(qū)段中的核酸探針部2的面積、第2區(qū)段中的核酸探針部2的面積、第3區(qū)段中的核酸探針部2的面積以及第4區(qū)段中的核酸探針部2的面積做成各不相同的面積，在各個(gè)區(qū)段中進(jìn)行雜交的時(shí)間就變得各不相同了。另外，通過將第1區(qū)段中的核酸探針6的長度(堿基長度)、第2區(qū)段中的核酸探針6的長度(堿基長度)、第3區(qū)段中的核酸探針6的長度(堿基長度)以及第4區(qū)段中的核酸探針6的長度(堿基長度)做成各不相同的長度(堿基長度)，在各個(gè)區(qū)段中進(jìn)行雜交的時(shí)間就變得各不相同了。
當(dāng)使用圖9所表示的DNA微陣列時(shí)，對(duì)于第1區(qū)段至第4區(qū)段各個(gè)區(qū)段，測(cè)定來自信號(hào)處理電路20的輸出時(shí)間。由于在第1區(qū)段至第4區(qū)段進(jìn)行雜交的時(shí)間不同，所以作為測(cè)定的輸出時(shí)間可以選擇最適的區(qū)段。換而言之，含有靶基因的核酸和核酸探針6直至雜交的時(shí)間無論過短，還是過長，定量時(shí)的誤差都變得很大。因此，通過選擇最適區(qū)段，使用來自選擇區(qū)段含有的核酸探針部2的信號(hào)測(cè)定輸出時(shí)間，可以高精度地進(jìn)行定量。
另外，在使用圖9所示的DNA微陣列1時(shí)，也要想迅速檢測(cè)第1多態(tài)性的存在時(shí)，在第1區(qū)域3a、第3區(qū)域3c、第5區(qū)域3e以及第7區(qū)域3g任一個(gè)區(qū)域含有的核酸探針部2中通過獲得來自至少一個(gè)以上的核酸探針部2的輸出時(shí)候檢測(cè)，也可以判定第1多態(tài)性的存在。使用圖9所示的DNA微陣列1，可以更迅速地判定樣品中是否含有第1多態(tài)性。
［實(shí)施例2]作為實(shí)施例2就檢測(cè)樣品中是否含有靶基因的系統(tǒng)進(jìn)行說明，同時(shí)，就樣品中含有靶基因時(shí)對(duì)靶基因進(jìn)行定量的系統(tǒng)進(jìn)行說明。
在實(shí)施例2中，作為DNA微陣列1，使用將在3’末端至少含有與檢測(cè)對(duì)象的靶基因互補(bǔ)的堿基序列的核酸探針6的5’末端固定于柵絕緣物2表面的微陣列。
在本例中，作為樣品可以使用從組織片段或白血球提取的含有人染色體的溶液。特別是在本例中，以固定化的核酸探針6作為引物，該樣品中含有的人染色體作為模板，在多個(gè)核酸探針部2上分別進(jìn)行擴(kuò)增，通過對(duì)應(yīng)的多個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4監(jiān)測(cè)該核酸擴(kuò)增。
具體來說，首先在對(duì)閥16切換為可以向流路13供給核酸擴(kuò)增需要的試劑的同時(shí)，驅(qū)動(dòng)泵17。同時(shí)，通過分注器18借助閥16向流路13供給含有人染色體的溶液。由此可以向流路13以及流動(dòng)池12的內(nèi)部流路21供給含有人染色體的溶液以及核酸擴(kuò)增需要的試劑。
其次，在DNA微陣列1上進(jìn)行核酸擴(kuò)增。具體如圖10(a)～(d)所表示的那樣，當(dāng)在含有人染色體的溶液中含有包含靶基因的DNA片段38時(shí)，進(jìn)行以核酸探針6作為引物的核酸擴(kuò)增。即，首先象圖10(a)所示的那樣，通過將柵絕緣物2控制在所定溫度，核酸探針6與DNA片段38中的靶基因的一部分進(jìn)行雜交(退火)。然后就象圖10(b)所示的那樣，當(dāng)將柵絕緣物2控制在所定溫度，通過核酸擴(kuò)增需要的試劑中含有的酶(DNA聚合酶等)，可以進(jìn)行以DNA片段38作為模板，從核酸探針6的3’末端開始的延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)后，當(dāng)將柵絕緣物2控制在所定溫度時(shí)，熱變性后可以使DNA片段38脫離。然后再次通過將柵絕緣物2控制在所定溫度，就象圖10(c)所示那樣，不同的核酸探針6與DNA片段38中的靶基因的一部分進(jìn)行雜交(退火)。然后就象圖10(d)所示的那樣，當(dāng)再次將柵絕緣物2控制在所定溫度時(shí)，通過核酸擴(kuò)增需要的試劑中含有的酶(DNA聚合酶等)，可以進(jìn)行以DNA片段38作為模板，從核酸探針6的3’末端開始的延伸反應(yīng)。
象上述那樣，通過柵絕緣物2的溫度控制，可以依次進(jìn)行從核酸探針6的3’末端開始的延伸反應(yīng)。當(dāng)測(cè)定對(duì)象的樣品中含有包含靶基因的DNA片段38時(shí)，在核酸探針部2進(jìn)行延伸反應(yīng)，結(jié)果在對(duì)應(yīng)于該核酸探針部2的絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的柵絕緣物5附近電荷密度發(fā)生變化，柵絕緣物5的表面電位也發(fā)生變化。該變化變得與一般的絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管的柵電壓變化同等的作用，使通道的導(dǎo)電率變化。因此，通過檢查裝置10可以以流過源極8和漏極9之間的漏電流變化檢測(cè)各個(gè)核酸探針部2中的延伸反應(yīng)的進(jìn)行。
在本例中，通過與使用單一的核酸探針部檢測(cè)靶基因時(shí)進(jìn)行比較，由于使用多個(gè)核酸探針部2也可以將誤差減小，即使在樣品中的靶基因的量少時(shí)，也可以正確進(jìn)行檢測(cè)。
另外，通過上述檢測(cè)裝置10也可以對(duì)樣品中的靶基因進(jìn)行定量。當(dāng)對(duì)樣品中的靶基因進(jìn)行定量時(shí)，使用含有預(yù)先濃度已知的靶基因的多個(gè)樣品進(jìn)行同樣測(cè)定，預(yù)先求出關(guān)于這些多個(gè)樣品的輸出時(shí)間。然后通過對(duì)測(cè)定對(duì)象樣品的輸出時(shí)間和多個(gè)樣品的輸出時(shí)間進(jìn)行比較，可以對(duì)測(cè)定對(duì)象樣品中含有的靶基因進(jìn)行定量。
此時(shí)，特別是由于使用多個(gè)核酸探針部2可以測(cè)定輸出時(shí)間，所以可以對(duì)例如由于起因于靶基因的非特異的雜交的噪音成分引起的定量誤差進(jìn)行校正。因此，利用測(cè)定裝置10可以對(duì)測(cè)定對(duì)象樣品中含有的靶基因進(jìn)行高精度地定量。
以下給出具體例子。
首先作為第1個(gè)具體例子，為了用一種探針研究B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)是否存在，將對(duì)5’末端進(jìn)行氨基修飾的以下核酸探針6固定于絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的柵絕緣物5上。HBV探針(i)5’-gcg gat ccg tgg agt tac tct cgt ttt tgc-3’在參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物上固定具有與HBV探針(i)不同的序列核酸33、例如全部由A構(gòu)成的30堿基長度的核酸33。該核酸33也可以是不固定在參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物上的5’末端用氨基修飾的核酸。
樣品使用由試劑盒(Qiagen Viral DNA Kit)從血清中提取的B型肝炎DNA的樣品。通過分注器18將含有B型肝炎DNA、1×PCR緩沖液(加Mg2+)(Takara公司生產(chǎn))，0.4μM的dNTP、5U的Taq聚合酶(Takara)的樣品溶液100μl導(dǎo)入流動(dòng)池12，通過以下的(1)～(3)工序?qū)沤^緣物5進(jìn)行加熱·冷卻。
(1)熱變性94℃×3分鐘(2)熱變性將94℃×30秒、退火55℃×30秒以及延伸反應(yīng)72℃×30秒作為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
(3)延伸反應(yīng)72℃×10分鐘上述(1)～(3)工序結(jié)束后，使柵絕緣物5的溫度上升，或通過分注器18將堿性溶液導(dǎo)入到流動(dòng)池12后使雙鏈核酸變性為單鏈核酸。然后，將洗滌液由分注器18導(dǎo)入流動(dòng)池12，將沒有固定在基板上的核酸、未反應(yīng)的核酸以及各種成分從DNA微陣列1中除去。然后將緩沖液由分注器18導(dǎo)入流動(dòng)池12，通過信號(hào)處理電路20測(cè)定絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的輸出值。
在第1個(gè)具體例子中，信號(hào)處理電路20中的輸出值是通過核酸擴(kuò)增由HBV探針(i)的3’末端開始單鏈聚核酸延伸的結(jié)果的輸出值，與固定于參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物的核酸33比較，由于堿基數(shù)多，可進(jìn)行檢測(cè)。圖11中示出了單鏈聚核酸由核酸探針6延伸的狀態(tài)模式以及固定于參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物的核酸33的模式。
在第1個(gè)具體例子中，當(dāng)使用含有B型肝炎DNA的樣品時(shí)，絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4和參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31中的表面電位的差分輸出是2.8mV。另一方面，使用不含有B型肝炎DNA的樣品時(shí)，進(jìn)行同樣測(cè)定的差分輸出是0.4mV。由該結(jié)果可以在含有B型肝炎DNA的樣品和不含有B型肝炎DNA的樣品中獲得有意義差值。
以下作為第2個(gè)具體例子，為了高靈敏度地檢測(cè)B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)是否存在，通過利用樣品中存在的靶基因進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)，將呈現(xiàn)高級(jí)結(jié)構(gòu)那樣的核酸探針6固定在絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的柵絕緣物5上。在第2個(gè)具體例子中使用的核酸探針6使用具有與B型肝炎DNA互補(bǔ)的堿基序列，而且對(duì)5’末端進(jìn)行了氨基化修飾的以下核酸探針6。
HBV探針(ii)5’-cat agc agc agg atg aag agg aat atg ata ggatgt gtc tgc ggc gtt t-3’另外，在本例中，在參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物上固定與HBV探針(ii)不同的序列的核酸33、例如全部由A構(gòu)成的30堿基長度的核酸33。
在第2個(gè)具體例子中也在與第1個(gè)具體例子同樣的試劑和條件下進(jìn)行上述(1)～(3)工序。然后，同樣在將沒有固定在基板上的核酸、未反應(yīng)的核酸以及各種成分從DNA微陣列1中除去的同時(shí)通過信號(hào)處理電路20測(cè)定輸出值。
在第2個(gè)具體例子中，輸出值是通過核酸擴(kuò)增由HBV探針(ii)的3’末端開始單鏈聚核酸延伸的同時(shí)形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果的輸出值，與固定于參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物的核酸33比較，由于堿基數(shù)多、而且高級(jí)結(jié)構(gòu)不同可進(jìn)行檢測(cè)。圖12中給出了單鏈聚核酸由核酸探針6延伸的狀態(tài)模式以及固定于參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物的核酸33的模式。在第2個(gè)具體例子中，就象圖12所示的那樣，當(dāng)使用含有B型肝炎DNA的樣品時(shí)，進(jìn)行延伸反應(yīng)的結(jié)果，獲得核酸探針6的3’末端呈現(xiàn)出高級(jí)結(jié)構(gòu)、此時(shí)為莖環(huán)結(jié)構(gòu)認(rèn)及環(huán)結(jié)構(gòu)。該莖結(jié)構(gòu)是由于通過延伸反應(yīng)合成的單鏈核酸與HBV探針(ii)的5’末端開始直至30個(gè)堿基互補(bǔ)形成的。而環(huán)結(jié)構(gòu)是由HBV探針(ii)的3’末端側(cè)開始通過19個(gè)堿基形成的。
在第2個(gè)具體例子中，當(dāng)使用含有B型肝炎DNA的樣品時(shí)，絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4和參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31中的表面電位的差分輸出是4.8mV。另一方面，使用不含有B型肝炎DNA的樣品時(shí)，也進(jìn)行同樣測(cè)定的差分輸出是0.5mV。由該結(jié)果可以在含有B型肝炎DNA的樣品和不含有B型肝炎DNA的樣品中獲得有意義差值。另外，與第1具體例子比較，在第2具體例子中，由于核酸探針6作為延伸反應(yīng)的結(jié)果形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，可以更高靈敏度地獲得輸出值。
以下作為第3個(gè)具體例子，為了用兩種探針檢測(cè)B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)是否存在，將5’末端進(jìn)行了氨基化修飾的以下核酸探針6固定在絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的柵絕緣物5上。
HBV探針(i)5’-gcg gat ccg tgg agt tac tct cgt ttt tgc-3’HBV探針(iii)5’-gca agc ttt cta aca aca gta gtt tcc gg-3’另外，在本例中，也在參照用場(chǎng)效應(yīng)晶體管31的柵絕緣物上固定具有與HBV探針(ii)不同的序列的核酸33、例如全部由A構(gòu)成的30堿基長度的核酸33。
在第3個(gè)具體例子中也在與第1個(gè)具體例子同樣的試劑和條件下進(jìn)行上述(1)～(3)工序。圖13(a)～(d)給出了第3具體例子中的核酸擴(kuò)增。圖13(a)～(d)中，將HBV探針(i)表示為核酸探針6a，將HBV探針(iii)表示為核酸探針6b。當(dāng)檢查對(duì)象樣品含有B型肝炎DNA時(shí)，就象圖13(a)所示那樣，通過將柵絕緣物2控制在所定溫度，含有B型肝炎DNA的DNA片段38與核酸探針6a進(jìn)行雜交(退火)。然后就象圖13(b)所示的那樣，當(dāng)將柵絕緣物2控制在所定溫度，通過核酸擴(kuò)增需要的試劑中含有的酶(DNA聚合酶等)，可以進(jìn)行以DNA片段38作為模板，從核酸探針6a的3’末端開始的延伸反應(yīng)。然后就象圖13(c)所示的那樣，當(dāng)將柵絕緣物2控制在所定溫度時(shí)，熱變性后可以使DNA片段38脫離，從核酸探針6a的3’末端開始延伸的區(qū)域的一部分與核酸探針6b進(jìn)行雜交(退火)。然后就象圖13(d)所示的那樣，再次將柵絕緣物2控制在所定溫度，以從核酸探針6a的3’末端延伸的區(qū)域作為模板，進(jìn)行從核酸探針6b開始的延伸反應(yīng)，最后核酸探針6a和核酸探針6b之間形成核酸雙鏈。
然后，通過分注器18借助閥16向流路13導(dǎo)入緩沖液，除去DNA微陣列1上未反應(yīng)的樣品等。然后，通過分注器18借助閥16向流路13導(dǎo)入含有溴乙錠或Hoechst 33258等嵌入劑39的溶液。通過導(dǎo)入嵌入劑，就象圖14所示那樣，在核酸探針6a和核酸探針6b之間形成核酸雙鏈中插入了嵌入劑39。嵌入劑39只與雙鏈的核酸反應(yīng)、結(jié)合，不結(jié)合單鏈核酸。嵌入劑插入核酸雙鏈后，與第1個(gè)具體例子同樣，通過信號(hào)處理電路20測(cè)定輸出值。
結(jié)果，當(dāng)使用含有B型肝炎DNA樣品時(shí)，差分輸出是5.6mV。而使用不含有B型肝炎DNA的樣品時(shí)，差分輸出是0.4mV。象上述那樣，在第3個(gè)具體例子中在含有B型肝炎DNA的樣品和不含有B型肝炎DNA的樣品中也獲得有意義差值。另一方面，不使用嵌入劑39在圖13(d)所示的核酸雙鏈的狀態(tài)下測(cè)定時(shí)，差分輸出是2.2mV。該結(jié)果表明，由于嵌入劑39帶有電荷，所以通過使含有嵌入劑39的溶液作用，可以謀求約2倍的高靈敏度。
以下作為第4個(gè)具體例子，為了用兩種探針檢測(cè)B型肝炎DNA(Hepatatis B Virus)是否存在，將5’末端進(jìn)行了氨基化修飾的以下核酸探針6固定在絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管4的柵絕緣物5上。
HBV探針(ii)5’-cat agc agc agg atg aag agg aat atg ata ggatgt gtc tgc ggc gtt t-3’HBV探針(iV)5’-tcc tct aat tcc agg atc aac aac aac cag aggttt tgc atg gtc ccg ta-3’
另外，在本例中，將含有B型肝炎DNA、0.1mM的dNTP、0.5mM的MgCl2、32U的Bst聚合酶(New England Biolab公司生產(chǎn))的樣品溶液100μl由分注器18導(dǎo)入流動(dòng)池12，通過于65℃對(duì)柵絕緣物5進(jìn)行溫育，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。另外，該恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)與圖10(a)～(d)所示情況同樣進(jìn)行。還有，在本例中也與第3個(gè)具體例子同樣，將嵌入劑39插入到核酸雙鏈后通過信號(hào)處理電路20測(cè)定輸出值。
結(jié)果，當(dāng)使用含有B型肝炎DNA的樣品時(shí)，差分輸出是5.8mV。另一方面使用不含有B型肝炎DNA的樣品時(shí)，差分輸出是0.3mV。象上述那樣，在第4個(gè)具體例子中也在含有B型肝炎DNA的樣品和不含有B型肝炎DNA的樣品中都獲得有意義差值。另一方面，不使用嵌入劑39的狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)定時(shí)，差分輸出是2.4mV。該結(jié)果表明，通過使含有嵌入劑39的溶液發(fā)揮作用，可以謀求約2倍的高靈敏度。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性就象以上詳細(xì)說明的那樣，在本發(fā)明中，通過對(duì)來自多個(gè)核酸探針部的輸出進(jìn)行監(jiān)測(cè)，獲得對(duì)于輸出超過所定的值的核酸探針部的個(gè)數(shù)的每一時(shí)間分布，在對(duì)目的核酸進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)也可以進(jìn)行定量。利用本發(fā)明在對(duì)目的核酸進(jìn)行高精度檢測(cè)的同時(shí)，也可以進(jìn)行高精度定量。
序列表<110>株式會(huì)社日立高新技術(shù)<120>使用DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法以及核酸檢測(cè)裝置<130>PH-1503-PCT<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>1gcggatccgt ggagttactc tcgtttttgc<210>2<211>49<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>2catagcagca ggatgaagag gaatatgata ggatgtgtct gcggcgttt 49<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>3gcaagcttt c taacaacagt agtttccgg<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>4tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccag aggttttgca tggtcccgta 50
權(quán)利要求
1.使用DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法，其特征是包括以下工序使含有核酸的樣品作用于備有包含可與所定核酸雜交的核酸探針的多個(gè)核酸探針部的DNA微陣列的工序，對(duì)基于各個(gè)上述多個(gè)核酸探針部的每一個(gè)，監(jiān)測(cè)核酸探針與所定核酸雜交的輸出，獲得有關(guān)上述各個(gè)多個(gè)核酸探針部的輸出超過所定值的時(shí)間的次數(shù)分布的工序，和根據(jù)由在上述工序中得到的次數(shù)分布進(jìn)行規(guī)則化求得的最大值，對(duì)樣品中含有的上述所定核酸進(jìn)行定量的工序。
2.權(quán)利要求1所述的使用DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法，其特征是上述DNA微陣列在柵絕緣物表面直接或借助于載體固定核酸探針，備有對(duì)應(yīng)于上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管，對(duì)來自該絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管的輸出進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
3.權(quán)利要求1所述的使用DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法，其特征是在使含有上述核酸的樣品作用的工序中，在上述DNA微陣列上以該核酸為模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
4.權(quán)利要求3所述的使用DNA微陣列的核酸檢測(cè)方法，其特征是上述核酸擴(kuò)增是通過恒溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行的。
5.核酸檢測(cè)裝置，其特征是備有安裝DNA微陣列的測(cè)定部，該DNA微陣列配備含有可與所定核酸雜交的核酸探針的多個(gè)核酸探針部，對(duì)來自安裝在上述測(cè)定部的DNA微陣列的各個(gè)核酸探針部的輸出進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)部，和取得有關(guān)上述多個(gè)核酸探針部在上述檢測(cè)部檢測(cè)的輸出超過所定的值的時(shí)間次數(shù)分布，根據(jù)規(guī)則化求得的最大值，對(duì)樣品中含有的上述所定核酸進(jìn)行定量的演算部。
6.權(quán)利要求5所述的核酸檢測(cè)裝置，其特征是上述DNA微陣列在柵絕緣物表面直接或借助于載體固定核酸探針，備有對(duì)應(yīng)于上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管，上述檢測(cè)部對(duì)來自該絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管的輸出進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
7.權(quán)利要求5所述的核酸檢測(cè)裝置，其特征是上述DNA微陣列配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，上述所定核酸與上述核酸探針的雜交時(shí)間在各個(gè)區(qū)段不同。
8.DNA微陣列，配備含有可與所定的核酸雜交的核酸探針的多個(gè)核酸探針部。
9.權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是含有對(duì)應(yīng)于上述多個(gè)核酸探針部配設(shè)的，對(duì)所定核酸與核酸探針的雜交進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)部。
10.權(quán)利要求9所述的DNA微陣列，其特征是上述檢測(cè)部是絕緣柵場(chǎng)效應(yīng)晶體管。
11.權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，在上述多個(gè)區(qū)段中，上述所定核酸與上述核酸探針的雜交時(shí)間不同。
12.權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，在上述多個(gè)區(qū)段中，上述核酸探針部中的核酸探針的密度不同。
13.權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，在上述多個(gè)區(qū)段中，上述核酸探針部的面積不同。
14.權(quán)利要求8所述的DNA微陣列，其特征是配備含有上述多個(gè)核酸探針部的多個(gè)區(qū)段，在上述多個(gè)區(qū)段中，上述核酸探針的長度不同。
全文摘要
對(duì)樣品中含有的核酸進(jìn)行高精度定量。包括使含有上述核酸的樣品作用于配備含有可與所定核酸雜交的核酸探針的多個(gè)核酸探針部的DNA微陣列的工序，對(duì)來自各個(gè)上述多個(gè)核酸探針部的輸出進(jìn)行監(jiān)測(cè)、取得有關(guān)各個(gè)上述多個(gè)核酸探針部在上述檢測(cè)部檢測(cè)的輸出超過所定的值的時(shí)間的規(guī)則化分布的工序，和根據(jù)由在上述工序中得到的規(guī)則化分布求得的最大值，對(duì)樣品中含有的上述所定核酸進(jìn)行定量的工序。
文檔編號(hào)G01N27/414GK1703623SQ0282935
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2002年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月12日
發(fā)明者松井拓也, 宮原裕二, 服部久美子 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立高新技術(shù)