專利名稱：用于預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的評(píng)定體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的評(píng)定體系。更具體地，本發(fā)明涉及選擇基因和/或蛋白，通過測量人腫瘤組織中基因和/或蛋白的表達(dá)，并將它們的表達(dá)模式與具有癌癥復(fù)發(fā)以及沒有癌癥復(fù)發(fā)的患者的人原發(fā)性腫瘤中該基因和/或蛋白的表達(dá)模式進(jìn)行比較，利用所選的基因和/或蛋白產(chǎn)生用于預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的公式。
本發(fā)明還涉及一種用于實(shí)施本發(fā)明的方法的試劑盒，包含DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、肽、抗體、探針和引物，這些是實(shí)現(xiàn)DNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白陣列、Northern印跡、原位雜交、核糖核酸酶保護(hù)分析、Western印跡、ELISA、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(以下稱之為RT-PCR)，以檢測指示癌癥復(fù)發(fā)的至少2個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白，優(yōu)選4個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白，更優(yōu)選6個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白，并且最優(yōu)選12個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白的表達(dá)所必需的。
背景技術(shù)：
癌癥是世界上引起死亡的主要原因之一。癌癥總體流行率大約占人口的1％，并且年發(fā)病率大約為0.5％。大約十分之一從醫(yī)院遣返的患者被初步診斷為癌癥。主要的現(xiàn)有治療模式是外科手術(shù)切除術(shù)、放射療法、化學(xué)療法以及包括激素療法在內(nèi)的生物療法。此外，新近發(fā)展的生物技術(shù)提供了新的治療模式，例如基因療法。盡管如此，癌癥是可怕的疾病，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下實(shí)際上不存在有效的治療。癌癥治療的主要困難之一是癌細(xì)胞變得對(duì)藥物具有抗性的能力，并且擴(kuò)散到組織其它部位，在那里它們可以產(chǎn)生新的腫瘤，這常常導(dǎo)致復(fù)發(fā)。如果癌癥復(fù)發(fā)在發(fā)生復(fù)發(fā)前可預(yù)測，則這種癌癥通過用外科手術(shù)局部治療是可醫(yī)治的。
在各種腫瘤中，肝細(xì)胞癌(以下稱之為HCC)是世界上最為常見的致命癌癥之一，并且發(fā)病數(shù)目在許多國家包括美國、日本、中國和歐洲國家是漸增的。乙型肝炎病毒(以下稱之為HBV)和丙型肝炎病毒(以下稱之為HCV)感染都可以是引起HCC的原因。事實(shí)上，HCC患者的增加與慢性HCV感染的增加是對(duì)應(yīng)的(El-Serag，H.B.& Mason，A.C.Rising incidence of hepatocellularcarcinoma in the United States，N.Engl.J.Med.340，745-750(1999)以及Okuda，K.Hepatocellular carcinoma，J.Hepatol.32，225-237(2000))。盡管HCC發(fā)病率提高，對(duì)于這種疾病沒有有前景的治療。治療HCC的主要問題是肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。在30到50％接受肝臟切除術(shù)的HCC患者中觀察到復(fù)發(fā)(Iizuka，N.等.NM23-H1 and NM23-H2 messenger RNA abundance in human hepatocellularcarcinoma，Cancer Res.55，652-657(1995)，Yamamoto，J.等Recurrence ofhepatocellular carcinoma after surgery，Br.J.Surg.83，1219-1222(1996)，以及Poon，R.T.等Different risk factors and prognosis for early and late intrahepaticrecurrence after resection of hepatocellular carcinoma，Cancer 89，500-507(2000))。盡管病理學(xué)TNM分類系統(tǒng)已用于HCC的治療，這個(gè)系統(tǒng)只能拙劣地預(yù)測經(jīng)受肝臟切除術(shù)患者的復(fù)發(fā)(Izumi，R.等Prognostic factors ofhepatocellular carcinoma in patient undergoing hepatic resection，Gastroenterology 106，720-727(1994))。也已經(jīng)提出了許多分子作為HCC的預(yù)測性標(biāo)志，沒有任何一個(gè)被證明臨床上可用(Iizuka，N.等NM23-H1 andNM23-H2 messenger RNA abundance in human hepatocellular carcinoma，Cancer Res.55，652-657(1995)，Hsu，H.C.等Expression of p53 gene in 184unifocal hepatocellular carcinomasassociation with tumor growth andinvasiveness，Cancer Res.53，46914694(1993)，以及Mathew，J.等CD44 isexpressed in hepatocellular carcinomas showing vascular invasion，J.Pathos179，74-79(1996))。因此，任何預(yù)測復(fù)發(fā)的方法對(duì)于理解癌癥機(jī)制以及對(duì)于建立新的癌癥療法將是非常有價(jià)值的。然而，由于存在著傳統(tǒng)方法對(duì)預(yù)測復(fù)發(fā)的技術(shù)局限，而且更多的局限可歸于高度的患者間腫瘤異質(zhì)性，有必要設(shè)計(jì)新的方法描述腫瘤特征并預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)。
最近發(fā)展的允許人們對(duì)大量基因進(jìn)行平行的表達(dá)分析的微陣列技術(shù)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開拓了一個(gè)新的紀(jì)元(Schena，M.等Quantitative monitoring of geneexpression patterns with a complementary DNA microarray，Science 270，467-470(1995)，以及DeRisi，J.等Use of a cDNA microarray to analyze geneexpression patterns in human cancer，Nature Genet.14，457-460(1996))。尤其是，cDNA微陣列對(duì)腫瘤基因表達(dá)的研究已經(jīng)對(duì)惡性腫瘤的性質(zhì)例如預(yù)后和藥物敏感性提供了重要的深刻見解(Alizadeh，A.A.等Distinct types of diffuselarge B-cell lymphoma identified by gene expression profiling，Nature403，503-511(2000)，以及Scherf，U.等A gene expression database for themolecular pharmacology of cancer，Nature Genet.24，236-244(2000))。
最近，監(jiān)控記憶被引入基因表達(dá)分析中(Brazma，A.& Vilo，J.Geneexpression data analysis，F(xiàn)EBS Lett.480，17-24(2000)以及Kell，D.B.& King，R.D.On the optimization of classes for the assignment of unidentified readingframes in functional genomics programsthe need for machine learning，TrendsBiotechnol.18，93-98(2000))。利用分類的樣品，監(jiān)控記憶具有很好的關(guān)于數(shù)據(jù)性質(zhì)的演繹知識(shí)的決定性優(yōu)勢(Duda，R.O.等Pattern classification，JohnWiley & Sons(2001)，以及Jain，A.K.等Statistical pattern recognitionA review，IEEE Trans.Pattern Analysis and Machine Intelligence.22，4-37(2000))。然而，沒有任何一種以前公開的監(jiān)控記憶方法直接地評(píng)價(jià)基因的組合從而能夠利用有關(guān)統(tǒng)計(jì)特征的信息，即基因分布結(jié)構(gòu)(Golub，T.R.等Molecularclassification of cancerclass discovery and class prediction by gene expressionmonitoring，Science 286，531-537(1999)，以及Brown，M.P.等Knowledge-based analysis of microarray gene expression data by using supportvector machines，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，262-267(2000))。
預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的評(píng)定體系是用統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別中的監(jiān)控記憶(superviseedlearning in statistical pattern recognition)通過分析DNA微陣列數(shù)據(jù)創(chuàng)建的(Duda，R.O.等Pattern classification，John Wiley & Sons(2001))。
統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別的監(jiān)控記憶已經(jīng)被成功地用于解決諸如文獻(xiàn)分類、語音識(shí)別、生物統(tǒng)計(jì)分析、以及遙感等大量問題(Jain，A.K.等Statistical patternrecognitionA review，IEEE Trans，Pattern Analysis and MachineIntelligence.22，4-37(2000))。
在本發(fā)明中，發(fā)明人提供了一種通過分析人原發(fā)性腫瘤基因和/或蛋白的表達(dá)而預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的評(píng)定體系。也就是說，本發(fā)明涉及一種預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的方法，其包括檢測人原發(fā)性腫瘤組織基因和/或蛋白的表達(dá)，并將它與具有癌癥復(fù)發(fā)以及沒有癌癥復(fù)發(fā)的患者的人原發(fā)性腫瘤基因和/或蛋白的表達(dá)進(jìn)行比較。


圖1圖示了基因選擇的程序(步驟1-7)以及用最佳的基因子集對(duì)評(píng)定體系的評(píng)價(jià)(步驟8-10)。
圖2圖示了最佳的基因數(shù)目。
圖3圖示了被選擇用于早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)預(yù)測的基因的mRNA的平均差異。比較了A組(顯示為A)和B組(顯示為B)之間12個(gè)基因的mRNA的平均差異。
圖4圖示了用于早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)預(yù)測的病毒類型、TNM階段、以及分值(T值)之間的關(guān)系。利用12個(gè)基因的最佳子集，用3個(gè)測試樣品評(píng)價(jià)通過30個(gè)訓(xùn)練樣品創(chuàng)建的評(píng)定體系。這一操作獨(dú)立重復(fù)10次。計(jì)算所有測試樣品的T值。在T值低于0時(shí)預(yù)測到早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)。不管階段和病毒類型，T為負(fù)值的所有HCC具有早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)，而T為正值的所有HCC沒有復(fù)發(fā)。填充的，A組(具有早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的患者)；空白的，B組(沒有早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的患者)；○，I期；◇，II期；△，III期；□，IVA期；B；HBV-陽性，C；HCV-陽性，N；HBV-HCV-雙陰性。
圖5圖示了評(píng)定體系。
發(fā)明的詳細(xì)說明在本發(fā)明中，利用了來自包括腦、肺、乳房、胃、肝、胰腺、膽囊、結(jié)腸、直腸、腎臟、膀胱、卵巢、子宮、前列腺以及皮膚的那些腫瘤的人組織。在外科手術(shù)期間切除人組織后，優(yōu)選它們立即在液氮或含有干冰的丙酮中冷凍，并貯存于-70和-80℃之間備用，包埋或不包埋在O.C.T.化合物中(Sakura-Seiki，Tokyo，Japan，目錄號(hào)4583)。
測試癌癥復(fù)發(fā)可能性的患者的腫瘤組織中基因和/或蛋白的表達(dá)是通過測量RNA和/或蛋白的水平來分析的。在許多情況下，RNA和/或蛋白的水平是通過測量包括熒光素和羅丹明在內(nèi)的底物的熒光、發(fā)光氨(lumenole)的化學(xué)發(fā)光、放射性物質(zhì)包括3H，14C，35S，33p，32p和125I的放射活性、以及光學(xué)密度確定的。RNA和/或蛋白的表達(dá)是通過已知的方法包括DNA微陣列(Schena，M.等Quantitative monitoring of gene expression patterns with acomplementary DNA microarray，Science 270，467-470(1995)，以及Lipshutz，R.J.等High density synthetic oligonucleotide arrays，Nature Genet.21，20-24(1999))、RT-PCR(Weis，J.H.等Detection of rare mRNAs via quantitativeRT-PCR，Trends Genetics 8，263-264(1992)，以及Bustin，S.A.Absolutequantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chainreaction assays，J.Mol.Endocrinol.25，169-193(2000))、NORTHERN印跡和原位雜交(Parker，R.M.& Barnes，N.M.mRNAdetection in situ and northernhybridization，Methods Mol.Biol.106，247-283(1999))、核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)(Hod，Y.A.Simplified ribonuclease protection assay，Biotechniques 13，852-854(1992)，Saccomanno，C.F.等A faster ribonuclease protection assay，Biotechniques 13，846-850(1992))、Western印跡(Towbin，H.等Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulosesheets，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，43504354(1979)，Burnette，W.N.WesternblottingElectrophoretic transfer of proteins form sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radioiodinatedprotein A，Anal.Biochem.112，195-203(1981))、ELISA分析(Engvall，E.&Perlman，P.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)Quantitative assay ofimmunoglobulin G，Immunochemistry 8871-879(1971))、以及蛋白陣列(Merchant，M.& Weinberger，S.R.ReviewRecent advancements insurface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，Electrophoresis 21，1164-1177(2000)，Paweletz，C.P.等Rapid protein displayprofiling of cancer progression directly from human tissue using a protein biochip，Drug Development Research 49，34-42(2000))確定的。
已有和沒有早期復(fù)發(fā)的癌癥患者腫瘤中基因和/或蛋白的表達(dá)以與測試復(fù)發(fā)可能性的患者相同的方式確定。
雖然癌癥的早期復(fù)發(fā)在不同癌癥類型中有差異，但通常是在切除后一到兩年內(nèi)發(fā)生。所以在切除后一到兩年內(nèi)已有復(fù)發(fā)的癌癥患者的腫瘤可以被用作為早期復(fù)發(fā)患者的腫瘤，而在切除后一到兩年內(nèi)沒有復(fù)發(fā)的癌癥患者的腫瘤可以用作沒有早期復(fù)發(fā)的患者的腫瘤。
有早期復(fù)發(fā)和沒有早期復(fù)發(fā)的癌癥患者之間，腫瘤基因和/或蛋白的表達(dá)水平或模式的差別，可通過已知的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法予以分析和檢測。統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別中的監(jiān)控記憶可用于腫瘤基因和/或蛋白表達(dá)模式的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別中的監(jiān)控記憶，從所檢測的基因和/或蛋白中挑選出其表達(dá)可指示癌癥復(fù)發(fā)的2個(gè)或多個(gè)基因和/或蛋白。
首先通過一維的判據(jù)(criteria)挑選一些可指示癌癥復(fù)發(fā)的基因和/或蛋白。然后，用能夠?qū)⒒蚝?或蛋白所有可能的組合考慮在內(nèi)的“排除一個(gè)”的方法通過詳盡的研究，從這些基因和/或蛋白中挑選出基因和/或蛋白的最佳子集。
預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的公式是通過利用可指示癌癥復(fù)發(fā)的至少2個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白，優(yōu)選4個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白，更優(yōu)選6個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白，最優(yōu)選12個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白的最佳子集創(chuàng)建的。即使是在樣品數(shù)目比基因和/或蛋白數(shù)目少時(shí)也能較好地工作的簡單分類程序例如線性分類程序被用來創(chuàng)建公式(Duda，R.O.等Pattern classification，JohnWiley & Sons(2001)，及Jain，A.K.等Statistical pattern recognitionA review，IEEE Trans.Pattern Analysis and Machine Intelligence.22，4-37(2000))。
本發(fā)明還涉及實(shí)施本發(fā)明的方法的試劑盒。檢測可指示癌癥復(fù)發(fā)的2個(gè)或多個(gè)基因和/或蛋白的表達(dá)模式的試劑盒由包括RNA提取試劑、用于合成cDNA和cRNA的酶、DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、分析用的探針和引物、對(duì)照基因的DNA片斷、以及各種蛋白的抗體在內(nèi)的組分組成。試劑盒的組分很容易從市場上獲得。例如，寡核苷酸芯片、胍-酚試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA聚合酶以及taq聚合酶可以購買并組裝為本發(fā)明的試劑盒。
下列實(shí)施例僅僅闡釋了本發(fā)明優(yōu)選的用于預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的方法，而不應(yīng)當(dāng)解釋為局限于此。
實(shí)施例實(shí)施例1.選擇病人用于早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)分析據(jù)報(bào)道外科手術(shù)后的早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)(在一年之內(nèi))主要是因肝內(nèi)轉(zhuǎn)移引起的，而晚期復(fù)更可能是多發(fā)源點(diǎn)發(fā)生(Poon，R.T.等Different risk factors andprognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection ofhepatocellular carcinoma，Cancer 89，500-507(2000))。而且，公知肝內(nèi)復(fù)發(fā)的患者比多發(fā)源點(diǎn)發(fā)生的患者的結(jié)果更嚴(yán)重(Yamamoto，J.等Recurrence ofhepatocellular carcinoma after surgery，Br.J.Surg.83，1219-1222(1996)，and Poon，R.T.等Different risk factors and prognosis for early and late intrahepaticrecurrence after resection of hepatocellular carcinoma，Cancer 89，500507(2000))。因此研究了外科手術(shù)后的一年內(nèi)與早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)模式。
33個(gè)患者在1997年3月和2000年1月之間在Yamaguchi Univers的醫(yī)院經(jīng)受過HCC外科手術(shù)治療。在外科手術(shù)前從所有的病例中都得到了書面的公告同意。研究方案在1996年5月得到了Yamaguchi大學(xué)醫(yī)學(xué)院人類用途制度審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。在外科后術(shù)后在所有患者中進(jìn)行了HCC組織病理學(xué)診斷。組織病理學(xué)檢查同樣揭示了在所有33個(gè)HCC樣品中沒有殘余腫瘤(R0)。表1顯示了基于Union Internationale Contre le Cancer(UICC)TNM分類的33個(gè)患者的臨床病理學(xué)特征(Sobin，L.H.& Wittekind，C.TNM classification of MalignantTumors，5th ed.，UICC，Wiley-Liss，74-77(1997))。在血清學(xué)上，7個(gè)患者是乙型肝炎表面抗原陽性，22個(gè)患者是抗-HCV抗體陽性，而其余4個(gè)患者兩者均為陰性。這33個(gè)患者繼肝切除之后每3個(gè)月通過超聲照相法、計(jì)算機(jī)X線斷層攝影術(shù)、和甲胎蛋白水平來追蹤癌癥復(fù)發(fā)。必要時(shí)，增加磁共振成象和肝血管造影術(shù)。這33個(gè)HCC患者患者中，有12人(36％)發(fā)現(xiàn)早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)。在這12個(gè)患者的11人中，復(fù)發(fā)的HCC在殘余的肝臟內(nèi)檢測為多小結(jié)或者彌漫性擴(kuò)散。在一個(gè)患者中，在外科手術(shù)后9個(gè)月在鄰近切除的原發(fā)性病變的部位檢測到作為單個(gè)小結(jié)的新腫瘤。然后，觀察到多發(fā)性肺轉(zhuǎn)移。其余的21個(gè)患者沒有一個(gè)在外科手術(shù)后一年之內(nèi)發(fā)生肝內(nèi)復(fù)發(fā)及其它遠(yuǎn)距離的轉(zhuǎn)移。這些患者被分成兩組；在一年之內(nèi)具有肝內(nèi)復(fù)發(fā)的患者在A組(n＝12)而那些沒有復(fù)發(fā)的在B組(n＝21)(表1)。使用x2檢驗(yàn)和Fisher′s exact檢驗(yàn)闡明這2組之間臨床病理學(xué)因素方面的差異。
實(shí)施例2.自組織中提取RNA組織碎片(大約125mm3)被懸浮在TRIZOL(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目錄號(hào)15596-018)或Sepasol-RNAI(Nacalai tesque，Kyoto，Japan，目錄號(hào)306-55)中，并用Polytron勻漿兩次(Kinematica，Littau，Switzerland)(以最大速度勻漿5秒)。加入氯仿之后，將組織勻漿物以15,000×g離心10分鐘，并回收含RNA的水相。用異丙醇沉淀細(xì)胞總RNA，用70％乙醇洗滌1次，并懸浮在DEPC-處理的水中(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目錄號(hào)10813-012)。RNA在用1.5單位DNase I(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目錄號(hào)18068015)處理之后，用TRIZOL/氯仿再抽提，用乙醇沉淀，并溶在DEPC-處理的水中。之后，根據(jù)廠家的操作說明書，利用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN，Hilden，Germany，目錄號(hào)74104)除去小分子量核苷酸?？俁NA的質(zhì)量依據(jù)瓊脂糖凝膠電泳后28S與18S核糖體RNA的比率判斷。純化的總RNA在70％乙醇溶液中貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3.cDNA和標(biāo)記的cRNA探針的合成利用逆向SuperScript選擇系統(tǒng)(Life Technologies，Gaithersburg，USA，目錄號(hào)18090-019)根據(jù)廠家的操作說明書合成cDNA。5μg純化的總RNA與含有T7啟動(dòng)子序列的寡聚-dT引物(Sawady Technology，Tokyo，Japan)和200單位SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶雜交，并在42℃溫育1小時(shí)。產(chǎn)生的cDNA用酚/氯仿提取并用Phase Lock Gel Light(Eppendorf，Hamburg，Germany，目錄號(hào)0032 005.101)純化。
還利用MEGAscript T7試劑盒(Ambion，Austin，USA，目錄號(hào)1334)，并以所述cDNA作為模板，根據(jù)廠家的操作說明書合成cRNA。大約5μg cDNA與2μl含有T7聚合酶、腺苷三磷酸(ATP)和鳥苷三磷酸(GTP)各7.5mM、胞苷三磷酸(CTP)和尿苷三磷酸(UTP)各5.625mM、Bio-11-CTP和Bio-16-UTP(ENZO Diagnostics，F(xiàn)armingdale，USA，目錄號(hào)分別為42818和42814)各1.875mM的酶混合物在37℃溫育6小時(shí)。單核苷酸和短寡核苷酸通過CHROMA SPIN+STE-100柱(Clontech，Palo Alto，USA，目錄號(hào)K1302-2)柱層析除去，洗脫物中的cRNA通過添加乙醇而沉淀。cRNA的質(zhì)量依據(jù)瓊脂糖凝膠電泳后cRNA的長度判斷。純化的cRNA在70％乙醇溶液中貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例4.有復(fù)發(fā)和沒有復(fù)發(fā)的患者的腫瘤基因表達(dá)分析來自肝癌患者的人原發(fā)性腫瘤的基因表達(dá)通過高密度寡核苷酸微陣列檢測(HuGeneFL array，Affymetrix，Santa Clara，USA，目錄號(hào)510137)(Lipshutz，R.L.等High density synthetic oligonucleotide arrays，NatureGenet.21，20-24(1999))。為與芯片上的寡核苷酸雜交，cRNA于95℃在含有40mM Tris(Sigma，St.Louis，USA，目錄號(hào)T1503)-乙酸(Wako，Osaka，Japan，目錄號(hào)017-00256)(pH8.1)、100mM乙酸鉀(Wako，Osaka，Japan，目錄號(hào)160-03175)、和30mM乙酸鎂(Wako，Osaka，Japan，目錄號(hào)130-00095)的緩沖液中片斷化35分鐘。雜交在200μl含有0.1M 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)(Sigma，St.Louis，USA，目錄號(hào)M-3885)(pH6.7)、1M NaCl(Nacalai tescque，Tokyo，Japan，目錄號(hào)313-20)、0.01％聚氧烯(polyoxylene)(10)辛基酚醚(Wako，Osaka，Japan，目錄號(hào)168-11805)、20μg鯡魚精DNA(Promega，Madison，USA，目錄號(hào)D181B)、100μg乙?；Ｑ灏椎鞍?Sigma，St.Louis，USA，目錄號(hào)B-8894)、10μg片斷化的cRNA、以及生物素標(biāo)記的對(duì)照寡核苷酸，生物素-5′-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3′(Sawady technology，Tokyo，Japan)的緩沖液中于45℃進(jìn)行12小時(shí)。在用含有0.01M MES(pH6.7)、0.1MNaCl、0.001％聚氧烯(10)辛基酚醚緩沖液的緩沖溶液洗滌芯片后，芯片與生物素標(biāo)記的抗-鏈抗生物素蛋白抗體(Funakoshi，Tokyo，Japan，目錄號(hào)BA0500)溫育，并用鏈抗生物素蛋白R(shí)-藻紅蛋白著色(Molecular Probes，Eugene，USA，目錄號(hào)S-866)，以便提高雜交信號(hào)，正如操作說明書中所述的那樣(Affymetrix，Santa Clara，USA)。用激光掃描儀(Affymetrix，Santa Clara，USA)收集每個(gè)像素水平，并且用Affymetrix GeneChip ver.3.3和AffymetrixMicroarray Suite ver.4.0軟件計(jì)算每種cDNA的表達(dá)水平和可信度(Present/Absent call)。從這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，測定了肝癌患者的人原發(fā)性腫瘤中6000個(gè)基因的表達(dá)。
實(shí)施例5.動(dòng)態(tài)RT-PCR分析基因的表達(dá)還通過動(dòng)態(tài)RT-PCR來測定。動(dòng)態(tài)RT-PCR通過實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)進(jìn)行。利用LightCycler儀(LightCycler system，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目錄號(hào)2011468)，在20μl由主混合物和緩沖液(LightCycler DNA Master hybridization probes，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目錄號(hào)2158825)，4mM氯化鎂(Nacalai tescque，Tokyo，Japan，目錄號(hào)7791-18-6)，10皮摩爾PCR引物(Sawady Technology，Tokyo，Japan)，4皮摩爾熒光雜交探針(Nihon Genome Research Laboratories，Sendai，Japan)(其被設(shè)計(jì)成在擴(kuò)增產(chǎn)物鏈上以頭對(duì)尾的排列與靶序列雜交)，以及2μl模板cDNA組成的反應(yīng)混合物中、在LightCycler毛細(xì)管(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目錄號(hào)1909339)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。供體探針在3′-端由熒光標(biāo)記，而受體探針在5′-端由LC-Red640標(biāo)記并且在3′-端進(jìn)行磷酸化修飾以阻斷延伸。供體探針3′-端與受體探針5′-端間的缺口有1-3個(gè)堿基。擴(kuò)增前，向反應(yīng)混合物中加入0.16μl TaqStart抗體(Clontech，Palo Alto，USA，目錄號(hào)5400-1)，接著室溫下溫育10分鐘以阻斷引物延伸。然后，在95℃溫育90秒使抗體失活，擴(kuò)增在LightCycler中按照95℃溫育0秒變性，在57-60℃溫育3-10秒退火，以及在72℃溫育90秒延伸進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，其中溫度斜率為20℃/秒。通過在每一擴(kuò)增循環(huán)的退火期終止時(shí)測量熒光信號(hào)來實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測。為使分離的RNA的完整性合格并使靶序列的拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，還利用雜交探針進(jìn)行了甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的動(dòng)態(tài)RT-PCR分析。靶mRNA和GAPDH mRNA的外標(biāo)物由質(zhì)粒DNA的10-倍系列稀釋物(103到108)制備。每個(gè)樣品中mRNA的定量通過參考在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)LightCycler軟件自動(dòng)進(jìn)行(LightCycler software version 3，RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)。
實(shí)施例6.鑒定基因集合，其表達(dá)能夠區(qū)分具有早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的肝癌患者和不具有早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的肝癌患者早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)往往與原發(fā)性腫瘤的數(shù)目和TNM階段相關(guān)聯(lián)，p值分別為0.041和0.006，但是與其它臨床病理學(xué)因素?zé)o關(guān)(表1)。外科手術(shù)時(shí)原發(fā)性腫瘤的數(shù)目僅在有限的靈敏度和特異性方面將A組和B組區(qū)分開來(分別為62％和75％)。TNM分期對(duì)于分開A組和B組同樣具有有限的靈敏度(67％)和特異性(83％)。因此，顯然這些傳統(tǒng)的分類法不能夠預(yù)測早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)。
統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別中的監(jiān)控記憶被用來分析高密度寡核苷酸微陣列的數(shù)據(jù)。評(píng)定體系用訓(xùn)練樣品設(shè)計(jì)并用測試樣品驗(yàn)證其功效(圖1)。為保持訓(xùn)練和測試樣品的獨(dú)立性，采取了交換訓(xùn)練和測試樣品的交叉驗(yàn)證法。33個(gè)可用樣品通過交叉驗(yàn)證法被分成30個(gè)訓(xùn)練樣品和3個(gè)測試樣品(圖1，步驟1)。根據(jù)先驗(yàn)概率，建立了由A組的11個(gè)樣品和B組的19個(gè)樣品組成的10組訓(xùn)練樣品。結(jié)果，建立了10組3個(gè)測試樣品，由A組的一個(gè)樣品和B組的兩個(gè)樣品組成。
利用Fisher判據(jù)，從所有的檢測基因中選擇在A組和B組之間具有大于兩倍的中值均差的50個(gè)基因來建立預(yù)測評(píng)定體系(圖1，步驟2-3)，該判據(jù)由下列公式(I)給出。
F(i)=(μA(i)-μB(i))2P(A)σA2(i)+P(B)σB2(i)]]>
其中，μA(i)是A組樣品均值向量μA的第i個(gè)分量，σA2(i)是A組樣品協(xié)方差矩陣∑A的第i個(gè)對(duì)角元素，而P(A)是A組的先驗(yàn)概率。
然后，如下所述鑒定用于評(píng)定體系的最佳基因子集。
Fisher線性分類程序依下列公式(II)將測試樣品x分配到A組。
如果FA(x)＜FB(x)其中FA(x)=12(x-μA)TΣW-1(x-μA)-InP(A)]]>∑W＝(P(A)∑A+P(B)∑B)在排除一個(gè)的方法中，樣品均值向量、樣品協(xié)方差矩陣、以及先驗(yàn)概率是通過利用29個(gè)樣品作為訓(xùn)練樣品估計(jì)的。然后，將剩余的樣品作為假測試樣品對(duì)所生成的Fisher線性分類程序進(jìn)行測試。重復(fù)這一操作30次。計(jì)算每一種可能的基因子集的錯(cuò)誤率。例如，當(dāng)從50個(gè)基因中選擇5個(gè)時(shí)，待檢測的子集數(shù)目為二百萬。
下一步，選擇錯(cuò)誤率最小化了的侯選基因子集(圖1，步驟4)。這個(gè)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)10次(圖1，步驟5)。
在這些侯選基因子集中，選擇在10次試驗(yàn)中自始至終出現(xiàn)最為頻繁的基因子集作為區(qū)分兩組的最佳基因子集(圖1，步驟6)。利用所選擇的最佳基因子集，分值T可通過下列公式(III)給出。
T(x)＝FA(x)-FB(x)在這個(gè)評(píng)定體系中，具有負(fù)T值的所有HCC被歸為A組(早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)組)，而具有正T值的所有HCC被歸為B組(無復(fù)發(fā)組)。
最佳基因數(shù)目根據(jù)由下列公式(IV)給出的判據(jù)J確定(圖1，步驟7)。
J=130[Σx∈BT(x)-Σx∈AT(x)]]]>判據(jù)J衡量A組和B組的可分性。針對(duì)不同基因數(shù)目計(jì)算10個(gè)不同訓(xùn)練集中J值的平均數(shù)和95％可信度間隔(圖2)。可分性隨著基因數(shù)目的增加而變得更好。當(dāng)基因數(shù)目達(dá)到10和12時(shí)，95％可信度間隔變得幾乎類似，表明12對(duì)于兩組的可分性而言是最為適當(dāng)?shù)幕驍?shù)目(圖2)。
實(shí)施例7.12個(gè)基因的最佳子集，其表達(dá)可指示早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)根據(jù)上述算法，鑒定了區(qū)分A組和B組的12個(gè)基因的最佳子集。最佳基因子集包括血小板衍生生長因子受體α(PDGFRA)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)蛋白A20、溶酶體相關(guān)多跨膜蛋白(LAPTm5)、HLA-DRα重鏈(II類抗原)、rel原癌基因、Staf50、公認(rèn)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、MADS/MEF2-家族轉(zhuǎn)錄因子(MEF2C)、來自3p21.3的HUMLUCA19人粘粒克隆LUCA19、DEAD-盒蛋白p72、波形蛋白和KIAK0002的基因(表2)。在所選的12個(gè)基因中，有11個(gè)的表達(dá)在A組中是下調(diào)的；A組中這些基因的均差中值比B組的一半還少(圖3)。相反，HUMLUCA19基因的表達(dá)在A組中是上調(diào)的；A組中HUMLUCA19基因的均差中值比B組增加了3倍多(圖3)。早期肝內(nèi)預(yù)測分值的準(zhǔn)確性是用每組3個(gè)測試樣品的10組不同集合評(píng)估的(圖4)。HCC早期復(fù)發(fā)是通過計(jì)算來自HCC患者的12個(gè)基因的T值預(yù)測的。當(dāng)T值低于0時(shí)，在外科手術(shù)后一年之內(nèi)復(fù)發(fā)是很有可能的，而當(dāng)T值大于0時(shí)，在外科手術(shù)后一年之內(nèi)復(fù)發(fā)的可能性很小。這個(gè)評(píng)定體系在全部10個(gè)試驗(yàn)中可以完美地預(yù)測3個(gè)測試樣品的早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)(圖4)。該評(píng)定體系不依賴于病毒感染模式，并且比TNM分期系統(tǒng)更加準(zhǔn)確(圖4)。基于全部33個(gè)HCC以及上述12個(gè)基因的評(píng)定體系(圖5)包括下列公式(V)。
公式(V)T(x)＝0.053862x1+0.038848x2+0.030176x3+0.001824x4+0.096997x5+0.017259x6+0.015908x7+0.103081x8-0.093746x9+0.024031x10-0.005417x11-0.119177x12-11.046007，其中X1，x2，X3，X4，X5，x6，X7，X8，X9，X10，X11，X12為血小板衍生生長因子受體α(PDGFRA)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)蛋白A20、溶酶體相關(guān)多跨膜蛋白(LAPTm5)、HLA-DRα重鏈、rel原癌基因、Staf50、公認(rèn)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、MADS/MEF2-家族轉(zhuǎn)錄因子(MEF2C)、來自3p21.3的HUMLUCA19人粘?？寺UCA19、DEAD-盒蛋白p72、波形蛋白和KIAK0002基因的mRNAs的校準(zhǔn)均差(表2)。
本發(fā)明所選擇的12個(gè)基因參與廣范圍的生物學(xué)過程。其中，免疫應(yīng)答相關(guān)基因例如HLA-DRα重鏈、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白A20和Staf50，在具有早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的HCC中是下調(diào)的。由于HLA-DRα重鏈被認(rèn)為在巨噬細(xì)胞的抗原遞呈中起著重要作用(Tissot，C.& Mechti，N.Molecular cloning ofa new interferon-induced factor that represses human immunodeficiency virustype 1 long terminal repeat expression，J.Biol.Chem.270，14891-14898(1995))，它在腫瘤組織中的下調(diào)可能幫助腫瘤細(xì)胞逃脫宿主的免疫監(jiān)視。Rel原癌基因與NF-xB一樣參與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，它在具有早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的HCC中也是下調(diào)的。此外，rel/NF-xB的表達(dá)據(jù)報(bào)道與T細(xì)胞激活相關(guān)(Mora，A等NF-kappa B/Rel participation in the lympholdne-dependent proliferation of Tlymphoid cells，J.Immunol.166，2218-2227(2000))。因此，看起來本發(fā)明所選擇的用于預(yù)測早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的許多基因參與削弱宿主抗高轉(zhuǎn)移潛力HCC細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
還通過寡核苷酸微陣列分析了其他跟蹤期最近達(dá)到1年的HCC患者的基因表達(dá)模式，并根據(jù)上述公式計(jì)算了12個(gè)基因的表達(dá)分值。存活并且外科手術(shù)一年多以后沒有復(fù)發(fā)的患者的T值為陽性(正值)，而其他在外科手術(shù)后一年內(nèi)具有肝內(nèi)復(fù)發(fā)的患者的T值為陰性(負(fù)數(shù))。因此，由從6000個(gè)基因中獲得的12個(gè)基因的子集構(gòu)成的評(píng)定體系能夠準(zhǔn)確地預(yù)測早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)。將統(tǒng)計(jì)學(xué)模式識(shí)別中的監(jiān)控記憶應(yīng)用到臨床標(biāo)本上，可以預(yù)先提供預(yù)防、診斷、以及治療其它疾病和HCC的關(guān)鍵信息。此外，不僅僅DNA微陣列，而且其它方法例如RT-PCR也可用來測定基因的最佳集合的表達(dá)。
表1用于早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的HCC臨床病理學(xué)因素因素 A組(n＝12)B組(n＝21) P值性別 N.S.
男8 16女4 5年齡 N.S.
≤60 5 7＞60 7 14病毒感染 N.S.
HBV 3 4HCV 8 14非-B非-C 1 3原發(fā)病灶 0.041單發(fā)腫瘤 3 13多發(fā)腫瘤 9 8腫瘤大小(cm) N.S.
＜2.0 0 52.0-5.0 8 14＞5.0 4 2分期*0.006I/II 2 14IIIA/IVA 10 7組織學(xué)分級(jí)*N.S.
G10 2G29 17G33 2靜脈入侵*N.S.
(-) 7 18(+) 5 3非腫瘤性肝 N.S.
非特異性改變 1 1慢性肝炎 2 10肝硬化9 10*，基于UICC的TNM分類進(jìn)行的評(píng)定HBV乙型肝炎病毒，HCV丙型肝炎病毒，非-B非-C既不是HBV也不是HCVA組早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)(+)，B組早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)(-)N.S.不顯著表2預(yù)測早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的公式和12個(gè)基因

GB*基因庫登錄號(hào)
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的評(píng)定體系，其使用以具有癌癥復(fù)發(fā)和沒有復(fù)發(fā)的人類癌癥患者癌組織中基因和/或蛋白的表達(dá)水平或模式為基礎(chǔ)由統(tǒng)計(jì)分析選擇的2個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的評(píng)定體系，其中由統(tǒng)計(jì)分析選擇的基因和/或蛋白的數(shù)目為4個(gè)或更多個(gè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的評(píng)定體系，其中由統(tǒng)計(jì)分析選擇的基因和/或蛋白的數(shù)目為6個(gè)或更多個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的評(píng)定體系，其中由統(tǒng)計(jì)分析選擇的基因和/或蛋白的數(shù)目為12個(gè)或更多個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的評(píng)定體系，其中癌組織是肝癌組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的評(píng)定體系，其中人癌組織中基因和/或蛋白的表達(dá)以及具有癌癥復(fù)發(fā)以及沒有復(fù)發(fā)的患者的人原發(fā)性癌組織中基因和/或蛋白的表達(dá)是通過DNA微陣列、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或蛋白陣列檢測的。
7.一種實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1-6的評(píng)定體系的試劑盒，包含實(shí)現(xiàn)DNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白陣列、Northern印跡、核糖核酸酶保護(hù)分析、Western印跡以及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而檢測根據(jù)權(quán)利要求1-6的評(píng)定體系所選出的基因和/或蛋白的表達(dá)所必需的DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、探針以及引物。
8.一種預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的方法，包含以下步驟(a)檢測自患者癌組織制備的樣品中的基因和/或蛋白的表達(dá)水平或模式，其中所述基因和/或蛋白是由根據(jù)權(quán)利要求1-6的評(píng)定體系選擇的；和，(b)通過將步驟(a)中檢測的基因和/或蛋白的表達(dá)水平或模式應(yīng)用到根據(jù)權(quán)利要求1-6的評(píng)定體系中，預(yù)測患者的癌癥復(fù)發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的評(píng)定體系。更具體地，本發(fā)明涉及選擇基因和/或蛋白，并通過測量人腫瘤組織中基因和/或蛋白的表達(dá)，以及對(duì)它們的表達(dá)模式與具有癌癥復(fù)發(fā)以及沒有癌癥復(fù)發(fā)的患者的人原發(fā)性腫瘤中基因和/或蛋白的表達(dá)模式進(jìn)行比較，利用所選的基因和/或蛋白產(chǎn)生用于預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的公式。本發(fā)明還涉及一種用于實(shí)施本發(fā)明的方法的試劑盒，包含DNA芯片、寡核苷酸芯片、蛋白芯片、肽、抗體、探針和引物，這些是實(shí)現(xiàn)DNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白陣列、NORTHERN印跡、原位雜交、核糖核酸酶保護(hù)分析、蛋白質(zhì)印跡、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(以下稱之為RT－PCR)，以檢測指示癌癥復(fù)發(fā)的至少2個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白，優(yōu)選4個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白，更優(yōu)選6個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白，并且最優(yōu)選12個(gè)或更多個(gè)基因和/或蛋白的表達(dá)所必需的。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1549864SQ01823658
公開日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2001年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月23日
發(fā)明者岡正朗, 彥, 浜本義彥, 岡部尚文, 文 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司