專利名稱:藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及制備一種中間體的方法,該中間體可用于制備具有抗病毒活性的化合物。
EP-A-141927(Beecham集團(tuán)公司)描述了化合物戊環(huán)佛爾(penciclovir)及其作為抗病毒劑的應(yīng)用;EP-A-182024(Beecham集團(tuán)公司)描述了其前藥芬環(huán)佛爾(fam-ciclovir)。戊環(huán)佛爾和芬環(huán)佛爾分別具有式(A)和式(B)
上述化合物的制備方法涉及式(C)的2-氨基-6-氯嘌呤與式(D)的側(cè)鏈中間體的反應(yīng)
其中Q是一個(gè)離去基團(tuán),例如羥基或鹵素(如碘或溴)。
式(D)的側(cè)鏈中間體不易得到,是用一種多步合成法制得的。如果式(D)化合物中Q被乙酰氧基置換,即成為式(Ⅰ)化合物,則該化合物可以由市售的1,1,2-乙烷三羧酸三乙酯用經(jīng)過修改的文獻(xiàn)方法(W.J.Bailey等,J.Org.Chem.,1962)來制備,但是不可能將三個(gè)乙酰氧基之一選擇性地轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán),因?yàn)檫@幾個(gè)乙酰氧基均處于相似的化學(xué)環(huán)境中,因此化學(xué)水解法不大可能區(qū)分這些官能團(tuán)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了一種用微生物水解酶將式(Ⅰ)的三乙酸酯化合物轉(zhuǎn)化成式(Ⅱ)的二乙酸酯的新方法。
因此,本發(fā)明提供一種制備如前面所限定的式(Ⅱ)化合物的方法,該方法包括用一種微生物水解酶處理如前面所限定的式(Ⅰ)化合物。
合適的微生物水解酶存在于包括青霉屬和桿菌屬在內(nèi)的微生物中,特別是?,F(xiàn)青霉(Penicilliumfrequentans)IMI92265。
根據(jù)所用微生物的本性,將微生物培養(yǎng)在營養(yǎng)肉湯或其它合適的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度為10-50℃,優(yōu)選20-40℃左右。反應(yīng)可在該培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行,也可在分離和轉(zhuǎn)移細(xì)胞后在替換培養(yǎng)基或鹽溶液中進(jìn)行。另外,也可以在將細(xì)胞破碎并分級(jí)分離后使用純化的或部分純化的酶。
進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的pH在3-10范圍內(nèi),優(yōu)選5.0-8.0,反應(yīng)溫度通常為10-40℃或20-40℃。
在硫酸銨(優(yōu)選1M)存在下,酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的產(chǎn)率可以得到改進(jìn)。
一般來說,細(xì)胞結(jié)合形式和無細(xì)胞形式的酶可進(jìn)行固定化和再利用。在使用?,F(xiàn)青霉IMI92265的情況下,可進(jìn)行多次再利用而不明顯失活。底物濃度可以提高到1%(W/V)或更高。因此可以設(shè)想出一種連續(xù)的生產(chǎn)方法,即,使底物通過裝在柱式環(huán)形反應(yīng)器或類似反應(yīng)器中的固定化酶。
通過用適宜的溶劑萃取來純化產(chǎn)物,而后可以視需要而進(jìn)行層析。
該方法的優(yōu)點(diǎn)在于,生成式(Ⅲ)副產(chǎn)物的量最小。
下列實(shí)施例說明本發(fā)明。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,通過用已知技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行菌株改良,可以提高反應(yīng)產(chǎn)率。
實(shí)施例1?,F(xiàn)青霉IMI92265的培養(yǎng)從常現(xiàn)青霉IMI 92265斜面取兩環(huán)菌絲體,混入4ml 0.02%吐溫80水溶液中,用2ml該懸浮液接種裝在250ml錐形瓶中的40ml種子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基含有(W/V)玉米漿(4%)、糖漿(2.6%)、CaCO3(0.5%)和酒糟(Scotafeed)(2%),該培養(yǎng)基用去離子水配制,調(diào)至pH5.2。于28℃下以240轉(zhuǎn)/分震蕩72小時(shí)后,用1.5ml種子培養(yǎng)液接種裝在250ml錐形瓶中的40ml生產(chǎn)培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基含有(W/V)葡萄糖(3%)、營養(yǎng)肉湯(0.8%)、酵母提取物(0.2%)和麥芽汁(0.3%),用去離子水配制,調(diào)至pH5.6。將這些錐形瓶于28℃下以240轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)72小時(shí)。
實(shí)施例2用完整?,F(xiàn)青霉IMI92265細(xì)胞進(jìn)行區(qū)域選擇性酯水解在實(shí)施例1得到的?,F(xiàn)青霉IMI92265培養(yǎng)搖瓶中,加入式(Ⅰ)的三乙酸酯,使底物最終濃度達(dá)到4mg/ml。然后于28℃下將搖瓶以240轉(zhuǎn)/分震蕩,離心,用氯仿萃取上清液,最后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。用高效液相色譜法分析有機(jī)相。
底物與微生物一起保溫6小時(shí)后,表明底物轉(zhuǎn)化為二乙酸酯產(chǎn)物(Ⅱ)的轉(zhuǎn)化率為15%,產(chǎn)物(Ⅱ)與其區(qū)域異構(gòu)體(Ⅲ)之比為91∶9。保溫9小時(shí)后,表明生成產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率為6%,產(chǎn)物(Ⅱ)與其區(qū)域異構(gòu)體(Ⅲ)之比為97∶3。
實(shí)施例3從?,F(xiàn)青霉IMI92265中提取和部分純化區(qū)域選擇性酯酶取1.6升實(shí)施例1得到的?,F(xiàn)青霉IMI92265培養(yǎng)液,冷卻至4℃后,離心(16,000×g,10分鐘,4℃)分離出菌絲體。將生物量重新懸浮于PH7.5的0.1MTris緩沖液中使體積為650ml,以60ml細(xì)胞漿為一批,將細(xì)胞分批用法式壓榨機(jī)(1250磅/平方英寸)破碎。離心(23,000×g,20分鐘,4℃)后,加入1M氫氧化鈉溶液將上清液調(diào)至PH7.1,并在攪拌下加入3.65g硫酸鏈霉素的5ml水溶液。在0℃下放置0.5小時(shí)后,將細(xì)胞提取液離心(39,000×g,20分,4℃),在分離出的上清液中于攪拌的同時(shí)加入固體硫酸銨,使硫酸銨飽和度達(dá)到60%。于0℃下放置15分鐘后離心(23,000×g,10分鐘,4℃),然后如上所述使分離出的上清液達(dá)到80%硫酸銨飽和。于0℃下放置15分鐘后如前所述再次離心,分離出上清液后留下一種沉淀物,將該沉淀物溶解于7.5ml25mMTris緩沖液(PH7.5)中。該溶液用葡聚糖凝膠PD10柱按制造廠家的說明書進(jìn)行脫鹽,用25mMTris緩沖液(PH7.5)洗脫。在脫鹽后的蛋白制備物中補(bǔ)加去離子水使體積達(dá)到20ml,并將其加到用25mMTris緩沖液(PH7.5)預(yù)平衡的陰離子交換樹脂柱(DEAE-Trisacryl,7.5×1.8cm)上。用該平衡緩沖液進(jìn)行洗脫,再用0-300mM硫酸銨在相同緩沖液中的溶液以線性梯度洗脫8小時(shí)。
用下列方法測定各柱級(jí)分的酯酶活性使250μl蛋白柱級(jí)分與250μl濃度為4mg/ml的三乙酸酯(Ⅰ)溶液一起保溫,三乙酸酯(Ⅰ)溶液用含有0.4M硫酸銨的0.2MTris緩沖液(PH7.5)配制。在室溫下保溫18小時(shí)后,將溶液用125μl氯仿萃取,氯仿萃取液用高效液相色譜法進(jìn)行分析。分離出兩個(gè)蛋白級(jí)分,其中由(Ⅰ)生成產(chǎn)物(Ⅱ)的轉(zhuǎn)化率為80%,并且在二乙酸酯(Ⅱ)和(Ⅲ)的混合物中區(qū)域異構(gòu)體(Ⅲ)的比例均未超過11%。蛋白柱級(jí)分根據(jù)需要用超濾法濃縮,用M.M.Bradford的方法(Anal.Biochem.,72248-254,1974)測定蛋白濃度。
實(shí)施例4用?,F(xiàn)青霉IMI92665的酶制備物進(jìn)行區(qū)域選擇性酯水解在125μl用1.2MTris緩沖液(PH7.5)配制的4mg/ml三乙酸酯(Ⅰ)溶液中,加入250μl實(shí)施例3所述的蛋白濃度為2.67mg/ml的酶制備物,以及125μl用12mMTris緩沖液(PH7.5)配制的4M硫酸銨溶液。小心混合后,將反應(yīng)液于20℃下保溫4小時(shí),然后用125μl氯仿萃取產(chǎn)物并用高效液相色譜法進(jìn)行分析。測得底物(Ⅰ)轉(zhuǎn)化為二乙酸酯(Ⅱ)的轉(zhuǎn)化率為97%,產(chǎn)物(Ⅱ)與其區(qū)域異構(gòu)體(Ⅲ)的比例為95∶5。
實(shí)施例5硫酸銨對(duì)酶促酯水解的影響用實(shí)施例3所述的步驟制得蛋白濃度為3.56mg/ml的酯酶制備物。從該制備物中取一份250μl的試樣,分別加到兩個(gè)5mg三乙酸酯(Ⅰ)和125μl4M硫酸銨在12mMTris緩沖液(PH7.5)中的溶液的混合物中,在另一個(gè)反應(yīng)液中加入125μl12mMTris緩沖液(PH7.5)。
于20℃下小心混合19小時(shí)后,各反應(yīng)液用250μl氯仿萃取,用高效液相色譜法分析有機(jī)相。在硫酸銨存在下進(jìn)行的反應(yīng)表明,三乙酸酯(Ⅰ)生成二乙酸酯(Ⅱ)的轉(zhuǎn)化率為71%,而在沒有硫酸銨存在時(shí)該轉(zhuǎn)化率為28%。在有硫酸銨存在時(shí),二乙酸酯(Ⅱ)與其區(qū)域異構(gòu)體(Ⅲ)的比例為94∶6,而在沒有硫酸銨存在時(shí),該比例為82∶18。
實(shí)施例6用溴化氰活化的瓊脂糖固定酯酶按實(shí)施例3的方法制備蛋白濃度為1.74mg/ml的酶制備物,取1.25ml該制備物與1.25ml“偶聯(lián)緩沖液”(0.1M碳酸氫鈉和0.5M氯化鈉的溶液,PH8.3)混合。將此溶液在葡聚糖凝膠PD10柱上進(jìn)行層析,得到3.5ml已去除Tris緩沖劑的酶溶液。
將此溶液加到0.6ml按制造廠商的說明書預(yù)先用溴化氰活化的瓊脂糖4B中。混合2小時(shí)后令凝膠沉降,棄去上清液。在凝膠中加入4ml用“偶聯(lián)緩沖液”配制的0.1M甘氨酸,該懸浮液在室溫下再混合1.5小時(shí)。然后將凝膠依次用“偶聯(lián)緩沖液”、含0.5M氯化鈉溶液的0.4M乙酸鹽緩沖液(PH4.0)和“偶聯(lián)緩沖液”洗滌。凝膠于4℃下懸浮貯存。
實(shí)施例7固定化區(qū)域選擇性酯酶的反復(fù)使用如實(shí)施例6所述制備凝膠固定化酶,每毫升凝膠固定5mg蛋白,取144ml固定化酶用等體積的含1M硫酸銨的0.1MTris緩沖液(pH7.5)洗滌。在凝膠中加入72ml4M硫酸銨溶液和600mg三乙酸酯(Ⅰ)在72ml0.4MTris緩沖液(pH7.5)中的溶液。
將反應(yīng)混合物于14℃下振蕩5小時(shí),然后離心并除去上清液。固定化酶制備物進(jìn)一步用含有1M硫酸銨的0.1MTris緩沖液(pH7.5)洗滌,上清液合并后用氯仿萃取,干燥并蒸發(fā)后得到403mg澄清油狀物。經(jīng)證實(shí),此油狀物中所含的(Ⅱ)和(Ⅲ)的比例為94∶6。
將固定化酶重新懸浮于含有1M硫酸銨的0.1MTris緩沖液(pH7.5)中,并于4℃下貯存。同一批固化定酶如上所述再使用8次,每一次都得出類似的結(jié)果。
取一份凝膠固定化酶試樣,在上述條件下使用16次,用高效液相色譜法檢測不到活性或區(qū)域選擇性的下降。
實(shí)施例8用苯基瓊脂糖固定酯酶在600μl固體苯基瓊脂糖CL-4B凝膠中,加入625μl4M硫酸銨溶液和625μl0.4MTris緩沖液(pH7.5)。向其中加入1.25ml如實(shí)施例3制備的蛋白濃度為1.74mg/ml的酶制備物。將該懸浮液在室溫下小心混合30分鐘,離心,凝膠用4ml1M硫酸銨在0.1MTris緩沖液(pH7.5)中的溶液洗滌兩次。
權(quán)利要求
1.一種制備式(Ⅱ)化合物的方法
該方法包括,用一種微生物水解酶處理式(Ⅰ)化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中微生物水解酶來自青霉屬和桿菌屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中微生物水解酶來自常現(xiàn)青霉IMI92265。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法,其中反應(yīng)在硫酸銨存在下進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法,其中酶被固定化并以連續(xù)生產(chǎn)方法再利用。
全文摘要
一種制備中間體的方法,該中間體可用于制備具有抗病毒活性的化合物。
文檔編號(hào)C12N11/10GK1070002SQ91108598
公開日1993年3月17日 申請日期1991年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1991年8月31日
發(fā)明者J·T·賽姆, S·R·沃羅涅基, T·J·格林特 申請人:比徹姆集團(tuán)公司