本發(fā)明涉及生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

化學(xué)防腐劑對(duì)人體健康的影響，已經(jīng)受到人們的高度關(guān)注，而天然防腐劑以其安全高效、對(duì)人體無(wú)毒副作用的優(yōu)點(diǎn)受到人們推崇。ε-聚賴氨酸是日本學(xué)者于1977年從放線菌培養(yǎng)過(guò)濾液中提取出有25~30個(gè)賴氨酸殘基的同型單體聚合物，它是由l-賴氨酸殘基通過(guò)α-羧基和ε-氨基形成的酰胺鍵連接而成，故稱為ε-聚賴氨酸。ε-聚賴氨酸作為一種天然的生物代謝產(chǎn)品，具有廣譜抗菌性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌、噬菌體等均有良好的抑制作用，是目前天然防腐中具有優(yōu)良防腐性能和巨大商業(yè)潛力的微生物類食品防腐劑，相比于山梨醇等傳統(tǒng)化學(xué)食品防腐劑，ε-聚賴氨酸具有抑菌譜廣、抑菌能力強(qiáng)、耐熱、水溶性好、不影響食品風(fēng)味、使用量低和安全性高等優(yōu)點(diǎn)。

ε-聚賴氨酸的合成是1947年由klephraim首先完成的，直到現(xiàn)在，除了化學(xué)合成法以外，還有酶法和生物合成等幾種方法，其中，采用白色鏈霉菌(streptomyeesalbulus)以葡萄糖為原料發(fā)酵制得的方法較為理想。白色鏈霉菌通過(guò)變異育種，可獲得以葡萄糖為碳源高效率生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的菌種，進(jìn)而完成ε-聚賴氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。但ε-聚賴氨酸產(chǎn)量過(guò)低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高，價(jià)格昂貴，限制了ε-聚賴氨酸的廣泛應(yīng)用。因此，近些年來(lái)人們也致力于通過(guò)改善發(fā)酵添加和發(fā)酵用添加劑來(lái)提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，但是其效果都不夠顯著。進(jìn)而又逐漸致力于創(chuàng)新從發(fā)酵液中提取和提純?chǔ)?聚賴氨酸的方法上，以希望能夠提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，如中國(guó)專利cn101701069a公開(kāi)了一種提取ε-聚賴氨酸及其鹽的方法，依次通過(guò)將發(fā)酵液酸化、堿化、吸附、解吸、脫色、濃縮的方式得到ε-聚賴氨酸，然而利用這種方式從發(fā)酵液中提取出的ε-聚賴氨酸大多都結(jié)合了氯離子，也就是說(shuō)實(shí)際提取得到的是ε-聚賴氨酸鹽酸鹽，而不是ε-聚賴氨酸，實(shí)際得到的ε-聚賴氨酸的純度低，而且ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的抑菌活性明顯低于ε-聚賴氨酸，最終使得使用上述方法從發(fā)酵液中提取得到的ε-聚賴氨酸產(chǎn)品的防腐性能不理想。

為了獲得純度高的ε-聚賴氨酸，中國(guó)專利201610641559.1公開(kāi)了一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，將發(fā)酵液依次經(jīng)過(guò)過(guò)濾、簡(jiǎn)化、吸附、鹽酸解吸、脫色處理后，調(diào)節(jié)清液的ph為堿性，并且再結(jié)合納濾的方式，將鹽酸解吸后生成的ε-聚賴氨酸鹽酸鹽轉(zhuǎn)化為ε-聚賴氨酸，提高制備的ε-聚賴氨酸的純度。但是該方法在脫色處理后需要再額外調(diào)節(jié)洗脫液的ph，而且如果ph控制不當(dāng)有可能會(huì)引起產(chǎn)品的變質(zhì)，同時(shí)又需要進(jìn)行納濾操作，增加了操作成本，操作過(guò)程繁瑣，效率低。

因此，針對(duì)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)方法進(jìn)行進(jìn)一步的創(chuàng)新和研究，提高ε-聚賴氨酸的純度和產(chǎn)量的同時(shí)，提高其生產(chǎn)效率，降低其生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化工藝流程，成為了推動(dòng)ε-聚賴氨酸工業(yè)化發(fā)展過(guò)程中亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，提高ε-聚賴氨酸的純度和收率的同時(shí)，簡(jiǎn)化工藝流程，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，包括將制得的含有ε-聚賴氨酸的發(fā)酵液采用陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附后依次經(jīng)過(guò)氨水解吸和減壓濃縮處理。

可選的，所述氨水解吸為將完成吸附的陽(yáng)離子樹(shù)脂加入過(guò)量的氨水進(jìn)行洗脫，得洗脫液，為ε-聚賴氨酸溶液。加入過(guò)量的氨水是為了確保能夠?qū)㈥?yáng)離子樹(shù)脂上吸附的ε-聚賴氨酸完全洗脫下來(lái)，多余的氨水溶解在含有ε-聚賴氨酸的洗脫液中。

進(jìn)一步可選的，所述氨水的摩爾濃度為0.1~0.5mol/l。

可選的，所述減壓濃縮的壓力為-0.3~-0.6mpa，溫度為60~70℃。采用減壓濃縮使得洗脫液在達(dá)到60~70℃時(shí)，其中溶解的氨水即可以氨氣的形式排出，提高ε-聚賴氨酸的純度，同時(shí)避免過(guò)高的溫度造成的色素顏色加深和蛋白變性。

可選的，所述含有ε-聚賴氨酸的發(fā)酵液采用陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附的具體方法為：將發(fā)酵液經(jīng)d155樹(shù)脂上柱吸附至樹(shù)脂達(dá)到飽和狀態(tài)，之后用純水洗滌吸附飽和的樹(shù)脂，至洗滌液體澄清。

可選的，所述減壓濃縮后還包括脫色處理；所述脫色處理為將減壓濃縮后的ε-聚賴氨酸濃縮液升溫至60±5℃，加入活性炭進(jìn)行脫色，再進(jìn)行板框過(guò)濾，得清液。

可選的，所述脫色處理后還包括噴霧干燥處理；所述噴霧干燥處理過(guò)程中設(shè)定進(jìn)口溫度為140±10℃，出口溫度為83±15℃，流速為80~120l/h。

可選的，所述含有ε-聚賴氨酸的發(fā)酵液采用陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附前還包括將含有ε-聚賴氨酸的發(fā)酵液依次經(jīng)過(guò)過(guò)濾、堿化處理；所述過(guò)濾為向發(fā)酵液中加入珍珠巖，然后進(jìn)行板框過(guò)濾，得過(guò)濾液；所述堿化為將過(guò)濾后的發(fā)酵液的ph調(diào)整為堿性。其中珍珠巖在發(fā)酵液中的質(zhì)量百分含量為1.5~2.5%。

可選的，所述含有ε-聚賴氨酸發(fā)酵液的具體制備方法為：取發(fā)酵用菌種配置菌液進(jìn)行發(fā)酵15~22h后，調(diào)整發(fā)酵菌液的ph為4.1±0.2，之后持續(xù)不斷的向發(fā)酵菌液中加入葡萄糖和生物素，并控制葡萄糖的質(zhì)量百分含量為0.2~2%，生物素的濃度為700μg/l，發(fā)酵7~9天，即完成。

可選的，上述制備發(fā)酵液的過(guò)程中發(fā)酵起始配置菌液的質(zhì)量濃度大于15%。

可選的，上述制備發(fā)酵液所用的菌種為鏈霉菌屬白色鏈霉菌。

本發(fā)明ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，將含有ε-聚賴氨酸的發(fā)酵液采用陽(yáng)離子吸附樹(shù)脂吸附后，加入氨水進(jìn)行洗脫，銨根離子與ε-聚賴氨酸離子在吸附樹(shù)脂上產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，其中銨根離子更易吸附在吸附樹(shù)脂上，從而是ε-聚賴氨酸從吸附樹(shù)脂上脫離，溶解在洗脫液中，為了確保將ε-聚賴氨酸完全從吸附樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，通常會(huì)采用過(guò)量的氨水，多余的氨水會(huì)溶解在洗脫液中，然后在后續(xù)的減壓濃縮過(guò)程中，溶解在洗脫液中的氨水以氨氣的形式隨著水蒸氣揮發(fā)去除，同時(shí)采用氨水洗脫不會(huì)引入其他干擾離子，不用增加相應(yīng)的除鹽設(shè)備，簡(jiǎn)化工藝流程，降低成本，提高所生產(chǎn)的ε-聚賴氨酸的純度，使其純度達(dá)到98%以上，ε-聚賴氨酸的收率提高24%以上，成本減少30%。

另外，采用減壓濃縮的方式，可以降低洗脫液中氨氣的揮發(fā)溫度，避免過(guò)高的溫度造成色素顏色加深和蛋白變性。

進(jìn)一步的，本發(fā)明通過(guò)在發(fā)酵15~22h后，在發(fā)酵菌液中持續(xù)不斷的加入生物素，進(jìn)一步提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，使得ε-聚賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量提高一倍。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

下述實(shí)施例中ε-聚賴氨酸發(fā)酵液由下述方法制備而得，具體操作步驟為：

（1）種子培養(yǎng)：種子罐經(jīng)水清洗干凈后，開(kāi)始進(jìn)行空消，之后將溶氧和ph電極校正準(zhǔn)確后裝入種子罐內(nèi)，配種子培養(yǎng)基至種子罐，之后進(jìn)行實(shí)消，降溫至30℃，并將實(shí)消后降溫至30℃的糖并至種子罐中；調(diào)節(jié)好種子培養(yǎng)所需控制的各參數(shù)，溫度自動(dòng)控制在30±1℃，溶氧大于30%，罐壓在0.01-0.03mpa，ph調(diào)至6.8-7.0，之后用氨水自動(dòng)控制在6.0；之后，將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)好的斜面白色鏈霉菌菌種接種至種子罐中，培養(yǎng)14-22h，得發(fā)酵用菌種；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵罐經(jīng)水清洗干凈后，開(kāi)始進(jìn)行空消，之后將溶氧和ph電極校正準(zhǔn)確后裝入發(fā)酵罐內(nèi)，配發(fā)酵培養(yǎng)基至發(fā)酵罐，之后進(jìn)行實(shí)消，降溫至30℃，并將實(shí)消后降溫至30℃的糖并至發(fā)酵罐中；調(diào)節(jié)好發(fā)酵培養(yǎng)所需控制的各參數(shù)，溫度自動(dòng)控制在30±1℃，溶氧大于30%，罐壓在0.01-0.03mpa，ph調(diào)至6.0-6.2用氨水進(jìn)行自動(dòng)控制；將步驟1）制備的發(fā)酵用菌種移種至發(fā)酵罐中，使得菌種質(zhì)量濃度達(dá)到15%以上，發(fā)酵15-22h，之后用氨水自動(dòng)調(diào)整發(fā)酵液的ph為4.1±0.2，以無(wú)菌操作的方式一定速度連續(xù)流加葡萄糖和生物素，葡萄糖的殘留量控制在0.2%-2%，生物素控制在500μg/l，發(fā)酵7-9天，即制得發(fā)酵液。

利用上述方法制備的發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸的濃度達(dá)到50g/l，相對(duì)于未采用連續(xù)流加生物素的發(fā)酵方法，ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量提高一倍。

實(shí)施例1

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，具體操作步驟為：

1）取上述制備的發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入2%珍珠巖，進(jìn)行板框過(guò)濾，得到過(guò)濾液，調(diào)整過(guò)濾液的ph為堿性，將堿性過(guò)濾液經(jīng)d155樹(shù)脂上柱吸附，吸附至飽和后用反滲透純化水洗滌至洗滌液體澄清，然后將洗滌后的飽和樹(shù)脂采用過(guò)量的摩爾濃度為0.3mol/l的氨水進(jìn)行洗脫，制得ε-聚賴氨酸溶液；

2）將步驟1）制備的ε-聚賴氨酸溶液在-0.45mpa壓力下，70℃溫度下進(jìn)行減壓濃縮至設(shè)定的體積，加入活性炭，升溫至60℃，進(jìn)行脫色，之后再經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾，得到清液；

3）將步驟2）制備的清液進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)口溫度為140±10℃，出口溫度83±15℃，料液流速100l/h，得到白色或黃色粉末狀產(chǎn)品，即為所述的ε-聚賴氨酸。

本實(shí)施例從發(fā)酵液中提取ε-聚賴氨酸的收率為78.9%，純度達(dá)到99%。

實(shí)施例2

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，具體操作步驟為：

1）取上述制備的發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入2.5%珍珠巖，進(jìn)行板框過(guò)濾，得到過(guò)濾液，調(diào)整過(guò)濾液的ph為堿性，將堿性過(guò)濾液經(jīng)d155樹(shù)脂上柱吸附，吸附至飽和后用反滲透純化水洗滌至洗滌液體澄清，然后將洗滌后的飽和樹(shù)脂采用過(guò)量摩爾濃度為0.5mol/l的氨水進(jìn)行洗脫，制得ε-聚賴氨酸溶液；

2）將步驟1）制備的ε-聚賴氨酸溶液在-0.6mpa壓力下，60℃溫度下進(jìn)行減壓濃縮，注意控制體積，加入活性炭，升溫至65℃，進(jìn)行脫色，之后再經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾，得到清液；

3）將步驟2）制備的清液進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)口溫度為140±10℃，出口溫度83±15℃，料液流速80l/h，得到白色或黃色粉末狀產(chǎn)品，即為所述的ε-聚賴氨酸。

本實(shí)施例從發(fā)酵液中提取ε-聚賴氨酸的收率為80.2%，純度達(dá)到98%。

實(shí)施例3

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，具體操作步驟為：

1）取上述制備的發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入1.5%珍珠巖，進(jìn)行板框過(guò)濾，得到過(guò)濾液，調(diào)整過(guò)濾液的ph為堿性，將堿性過(guò)濾液經(jīng)d155樹(shù)脂上柱吸附，吸附至飽和后用反滲透純化水洗滌至洗滌液體澄清，然后將洗滌后的飽和樹(shù)脂采用過(guò)量摩爾濃度為0.1mol/l的氨水進(jìn)行洗脫，制得ε-聚賴氨酸溶液；

2）將步驟1）制備的ε-聚賴氨酸溶液在-0.3mpa壓力下，65℃溫度下進(jìn)行減壓濃縮，注意控制體積，加入活性炭，升溫至55℃，進(jìn)行脫色，之后再經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾，得到清液；

3）將步驟2）制備的清液進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)口溫度為140±10℃，出口溫度83±15℃，料液流速120l/h，得到白色或黃色粉末狀產(chǎn)品，即為所述的ε-聚賴氨酸。

本實(shí)施例從發(fā)酵液中提取ε-聚賴氨酸的收率為79.8%，純度達(dá)到99%。

對(duì)比例1

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，具體操作步驟為：

1）取上述制備的發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入2%珍珠巖，進(jìn)行板框過(guò)濾，得到過(guò)濾液，調(diào)整過(guò)濾液的ph為堿性，將堿性過(guò)濾液經(jīng)d155樹(shù)脂上柱吸附，吸附至飽和后用反滲透純化水洗滌至洗滌液體澄清，然后將洗滌后的飽和樹(shù)脂采用摩爾濃度為0.3mol/l的氨水進(jìn)行洗脫，制得ε-聚賴氨酸溶液；氨水的用量同實(shí)施例1；

2）將步驟1）制備的ε-聚賴氨酸溶液加入活性炭，升溫至60℃，進(jìn)行脫色，之后再經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾，得到清液；

3）將步驟2）制備的清液進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)口溫度為140±10℃，出口溫度83±15℃，料液流速100l/h，得到白色或黃色粉末狀產(chǎn)品，即為所述的ε-聚賴氨酸。

本對(duì)比例從發(fā)酵液中提取得到的白色或黃色粉末狀產(chǎn)品存在結(jié)合了nh4⁺的ε-聚賴氨酸，ε-聚賴氨酸的純度僅達(dá)到80.2%，收率為54.3%。

結(jié)論：相比對(duì)比例在氨水洗脫后不進(jìn)行減壓濃縮，直接進(jìn)行脫色干燥，本發(fā)明方法中減壓濃縮后，氨水帶入的nh4⁺形成氨氣揮去，使產(chǎn)品中無(wú)其他干擾離子，使得ε-聚賴氨酸的純度由80.2%提高至98%以上，收率由54.3%提高至78.9%左右，收率提高了24.6%。