本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域，具體涉及一種載體，尤其涉及一種基于octs技術(shù)的前列腺癌car-t治療載體。此外，本發(fā)明還涉及該載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)具有識別腫瘤相關(guān)抗原、調(diào)控機體攻擊腫瘤細胞(高度特異性的細胞溶解)的能力。1950年代，burnet和thomas提出了“免疫監(jiān)視”理論，認為機體中經(jīng)常會出現(xiàn)的突變的腫瘤細胞可被免疫系統(tǒng)所識別而清除，為腫瘤免疫治療奠定了理論基礎(chǔ)[burnetfm.immunologicalaspectsofmalignantdisease.lancet,1967；1:1171-4]。隨后，各種腫瘤免疫療法包括細胞因子療法、單克隆抗體療法、過繼免疫療法、疫苗療法等相繼應(yīng)用于臨床。2013年一種更先進的腫瘤免疫療法---car-t療法成功用于臨床，并表現(xiàn)了前所未有的臨床療效。car-t，全稱是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受體t細胞免疫療法。該療法是通過轉(zhuǎn)基因的手段，將啟動子、抗原識別區(qū)、共刺激因子、效應(yīng)區(qū)等共同組成的嵌合分子，導(dǎo)入t細胞基因組內(nèi)，從而使t細胞對靶細胞的識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、殺傷等功能融為一體，實現(xiàn)了對靶細胞的特異性殺傷[eleanorj.cheadle,etal.cartcells:drivingtheroadfromthelaboratorytotheclinic.immunologicalreviews2014.vol.257:91–106]。car-t療法在臨床上最領(lǐng)先的有諾華的clt019，采用clt019治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細胞白血病患者，六個月的腫瘤無進展生存率達到67％，其中最長的應(yīng)答時間達到兩年多?？偛课挥谥袊虾５纳虾?yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司與醫(yī)院合作，截止到2017年2月，共治療復(fù)發(fā)難治急性淋巴細胞白血病患者36例，其中完全24例，緩解比例達到66.6％。這是抗癌研究的顛覆性突破。car-t細胞療法可能是最有可能治愈癌癥的手段之一，并被《science》雜志評為2013年度十大科技突破之首。car-t目前在治療b-淋巴細胞白血病等幾種類型的血液腫瘤方面療效顯著，但是也存在一些局限性，目前一個嵌合抗原受體只能識別一種抗原靶標，腫瘤細胞是個復(fù)雜的群體，含有相應(yīng)抗原的腫瘤細胞被清除以后，不含相應(yīng)抗原的腫瘤細胞會迅速增殖，一段時間后導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。那么要使car-t識別能同時識別兩種抗原，就有兩個方案可選：一是將兩組嵌合抗原受體構(gòu)建進入一個慢病毒轉(zhuǎn)基因載體，一次性將兩組嵌合抗原受體轉(zhuǎn)導(dǎo)進入原代t淋巴細胞；二是用兩個慢病毒轉(zhuǎn)基因載體分兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)，將兩組嵌合抗原受體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)進入原代t淋巴細胞。方案一的缺點在于占用慢病毒轉(zhuǎn)基因載體的寶貴容量，不利于裝載其它功能元件；轉(zhuǎn)基因載體包裝效率低；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率非常低，很難轉(zhuǎn)導(dǎo)進入原代t淋巴細胞內(nèi)。方案二的缺點在于需要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)，兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)的綜合效率較低，轉(zhuǎn)導(dǎo)周期時間長，原代細胞容易衰老，導(dǎo)致增殖能力衰退，殺傷功能下降，影響腫瘤清除療效。psma在前腺癌中具有特異的高度表達。在用7ell-c5所檢測的所有184份前列腺標本中，bostwick等[bostwickdg，pacellia，blutem，etal.prostatespecificmembraneantigenexpressioninprostaticintraepithelialneoplasiaandadenocarcinoma.cancer.1998；82(11)：2256-2261]從中均發(fā)現(xiàn)了陽性免疫反應(yīng)，良性上皮組織和前列腺癌高度惡性細胞，陽性率分別為69.5％和80.2％，其中在癌組織中染色強度最強，他們還在另外200份前列腺標本的隊列研究中也獲得了類似結(jié)果。pd-l1在多數(shù)癌癥組織中過量表達，包括nsclc、黑色素瘤、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病及各種泌尿系腫瘤、消化道腫瘤、生殖系腫瘤等[intlekoferam,thompsoncb.atthebench:preclinicalrationaleforctla-4andpd-1blockadeascancerimmunotherapy[j].jleukocbiol,2013,94(1):25-39.].parsa在鼠和人的腫瘤細胞中，發(fā)現(xiàn)t細胞異常分泌的ifn-γ，ifn-γ可以誘導(dǎo)腫瘤細胞上的pd-l1高表達[dingh,wux,wuj,etal.deliveringpd-1inhibitorysignalconcomitantwithblockingicosco-stimulationsuppresseslupus-likesyndromeinautoimmunebxsbmice[j].clinimmunol,2006,118(2/3):258-267.]。pd-l1高表達，可以通過抑制ras及pi3k/akt信號通路，進而調(diào)控細胞周期檢查點蛋白和細胞增殖相關(guān)蛋白表達，最終導(dǎo)致t細胞增殖的抑制[11]。dong等體外實驗和小鼠模型還發(fā)現(xiàn)，pd-1/pd-l1信號通路的激活可以誘導(dǎo)特異性ctl調(diào)亡，使ctl的細胞毒殺傷效應(yīng)敏感性下降，促使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[dongh,stromese,salomaodr,etal.tumor-associatedb7-h1promotest-cellapoptosis:apotentialmechanismofimmuneevasion[j].natmed,2002,8(8):793-800.]。目前，尚未有克服上述缺點針對psma、pd-l1兩種抗原的car-t治療的相關(guān)報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種基于octs技術(shù)的前列腺癌car-t治療載體。首先，其僅需要一次轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，不影響car-t治療的療效；其次，其不占用慢病毒轉(zhuǎn)基因載體的寶貴容量，利于裝載其它功能元件。第三，能有效封閉pdl1，阻斷免疫負調(diào)節(jié)信號通路，臨床上可用于抑制腫瘤的免疫逃脫，提高car-t細胞免疫治療的療效。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供該載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供該載體的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：在本發(fā)明的一方面，提供一種基于octs技術(shù)的前列腺癌car-t治療載體，包括慢病毒骨架質(zhì)粒、人ef1α啟動子、octs嵌合受體結(jié)構(gòu)域和pdl1單鏈抗體；所述慢病毒骨架質(zhì)粒包括：用于目的菌株大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因ampr序列，如seqidno.1所示；用于質(zhì)粒復(fù)制的原核復(fù)制子pucori序列，如seqidno.2所示；用于增強真核細胞內(nèi)的復(fù)制的病毒復(fù)制子sv40ori序列，如seqidno.3所示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；zsgreen1綠色熒光蛋白，如seqidno.11所示；ires核糖體結(jié)合序列，如seqidno.12所示；用于增強轉(zhuǎn)基因的表達效率的ewpre增強型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，如seqidno.13所示；所述人ef1α啟動子的序列如seqidno.14所示；所述octs嵌合受體結(jié)構(gòu)域包括：如seqidno.15所示的cd8leader嵌合受體信號肽、如seqidno.16所示的psma單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.17所示的psma單鏈抗體重鏈vh、如seqidno.18所示的pdl1單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.19所示的pdl1單鏈抗體重鏈vh、如seqidno.20所示的抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker、如seqidno.21所示的單鏈抗體間鉸鏈inter-linker、如seqidno.22所示的cd8hinge嵌合受體鉸鏈、如seqidno.23所示的cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)、如seqidno.26所示的tcr嵌合受體t細胞激活域以及嵌合受體共刺激因子區(qū)域；所述嵌合受體共刺激因子區(qū)域選自4-1bb、icos、cd27、ox40、cd28、myd88、il1r1、cd70、tnfrsf19l、tnfrsf27、tnfrsf1od、tnfrsf13b、tnfrsf18、cd134等腫瘤壞死因子超家族(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamily，tnfrsf)中的任意一種或多種的組合。所述慢病毒包裝順式元件可以采用第二代慢病毒載體，也可以采用第三代慢病毒載體。所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag順式元件、如seqidno.8所示的rre順式元件、如seqidno.9所示的env順式元件、如seqidno.10所示的cppt順式元件。所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag順式元件、如seqidno.8所示的rre順式元件、如seqidno.9所示的env順式元件、如seqidno.10所示的cppt順式元件，以及如seqidno.4所示的rsv啟動子。本發(fā)明優(yōu)選采用第三代慢病毒載體。優(yōu)選的，所述如seqidno.16所示的psma單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.17所示的psma單鏈抗體重鏈vh、如seqidno.18所示的pdl1單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.19所示的pdl1單鏈抗體重鏈vh、如seqidno.20所示的抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker、如seqidno.21所示的單鏈抗體間鉸鏈inter-linker采用串聯(lián)連接方式或者轉(zhuǎn)角連接方式；所述串聯(lián)連接方式具體為：pdl1單鏈抗體輕鏈vl與psma單鏈抗體輕鏈vl采用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，pdl1單鏈抗體輕鏈vl與pdl1單鏈抗體重鏈vh采用抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker連接，psma單鏈抗體輕鏈vl與psma單鏈抗體重鏈vh采用抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker連接，即pocts-pdl1psmas(見圖4a和圖4c)；所述轉(zhuǎn)角連接方式具體為：psma單鏈抗體輕鏈vl與psma單鏈抗體重鏈vh采用抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker連接，pdl1單鏈抗體輕鏈vl與psma單鏈抗體重鏈vh采用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，pdl1單鏈抗體重鏈vh與psma單鏈抗體輕鏈vl采用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，即pocts-pdl1psmat(見圖4b和圖4c)。優(yōu)選的，所述pdl1單鏈抗體的序列如seqidno.27所示。優(yōu)選的，所述ewpre增強型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件有6個核苷酸的增強突變，具體為：g.396g>a、g.397c>t、g.398t>c、g.399g>a、g.400a>t、g.411a>t。優(yōu)選的，由所述人ef1α啟動子啟動整個octs結(jié)構(gòu)基因表達，所述cd8leader嵌合受體信號肽位于octs編碼序列的n端，用于引導(dǎo)octs蛋白定位于細胞膜；所述psma單鏈抗體輕鏈vl、psma單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh這兩組單鏈抗體組合成雙抗原識別區(qū)，用于識別相應(yīng)靶抗原；所述cd8hinge嵌合受體鉸鏈用于將scfv錨定于細胞膜外側(cè)；所述cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)用于將整個嵌合受體固定于細胞膜上；所述cd28嵌合受體共刺激因子用于刺激t淋巴細胞體外激活和體內(nèi)腫瘤細胞殺傷作用；所述cd134嵌合受體共刺激因子用于促進t淋巴細胞增殖和因子分泌，增強腫瘤免疫，有利于記憶t細胞的長期存活；所述tcr嵌合受體t細胞激活域用于激活下游信號通路的表達；所述pdl1單鏈抗體，能有效封閉pdl1，阻斷免疫負調(diào)節(jié)信號通路，臨床上可用于抑制腫瘤的免疫逃脫，提高car-t細胞免疫治療的療效；當(dāng)抗原識別區(qū)域與靶抗原結(jié)合時，信號通過嵌合受體傳遞至細胞內(nèi)，從而產(chǎn)生t細胞增殖、細胞因子分泌增加、抗細胞凋亡蛋白分泌增加、細胞死亡延遲、裂解靶細胞等一系列生物學(xué)效應(yīng)。優(yōu)選的，所述嵌合受體共刺激因子區(qū)域采用如seqidno.24所示的cd28嵌合受體共刺激因子以及如seqidno.25所示的cd134嵌合受體共刺激因子組合。優(yōu)選的，所述的pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體均經(jīng)過人源化改造。在本發(fā)明的第二方面，提供一種上述基于octs技術(shù)的前列腺癌car-t治療載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)將如seqidno.1所示的含氨芐青霉素抗性基因ampr序列、如seqidno.2所示的原核復(fù)制子pucori序列、如seqidno.3所示的病毒復(fù)制子sv40ori序列、用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件、如seqidno.11所示的zsgreen1綠色熒光蛋白、如seqidno.12所示的ires核糖體結(jié)合序列、如seqidno.13所示的ewpre增強型土撥鼠乙肝病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件存儲于慢病毒骨架質(zhì)粒上；(2)將如seqidno.14所示的人ef1α啟動子、所述octs嵌合受體結(jié)構(gòu)域以及如seqidno.27所示的pdl1單鏈抗體組合成octs嵌合受體設(shè)計方案，經(jīng)過酶切、連接、重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒中，得到第三代octs設(shè)計的重組慢病毒質(zhì)粒；(3)將得到的重組慢病毒質(zhì)粒分別與慢病毒包裝質(zhì)粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白質(zhì)粒penv-g共同轉(zhuǎn)染hek293t/17細胞，在hek293t/17細胞中進行基因轉(zhuǎn)錄表達后，包裝成功重組慢病毒載體會釋放到細胞培養(yǎng)上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液；(4)將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的柱純化方式進行純化，分別得到重組慢病毒載體。優(yōu)選的，步驟(4)中，所述抽濾步驟要控制上清體積在200ml～2000ml，控制真空度在-0.5mpa～-0.9mpa，防止由于堵孔帶來的載體損失；所述吸附步驟要控制溶液的ph值在6～8，防止ph的變化導(dǎo)致載體失活；所述洗脫步驟要控制洗脫液的離子強度在0.5m～1.0m，防止離子強度的變化導(dǎo)致洗脫不完全或者載體失活。在本發(fā)明的第三方面，提供所述的載體在制備治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明所采用的octs-car-t技術(shù)，是在目前傳統(tǒng)car-t細胞治療的基礎(chǔ)上，通過對嵌合抗原受體(car)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化改造，使得嵌合抗原受體能夠識別兩種抗原，大大拓展了car-t細胞的識別范圍，針對腫瘤群體的清除更徹底，療效更持久；避免分批培養(yǎng)car-t細胞，大大節(jié)約成本；避免患者多次回輸不同靶向car-t細胞，節(jié)約了患者的經(jīng)濟支出，降低復(fù)發(fā)的幾率，間接提高患者生存質(zhì)量。僅需要一次轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，不影響car-t治療的療效；不占用慢病毒轉(zhuǎn)基因載體的寶貴容量，利于裝載其它功能元件，轉(zhuǎn)基因載體包裝效率高，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。octs的全稱是onecarwithtwoscfvs，通過串聯(lián)octs(seriesocts)或者轉(zhuǎn)角octs(turnocts)的連接方式，將兩段scfv與整合成一個嵌合分子(如圖1所示)，賦予t淋巴細胞hla非依賴的方式識別兩種腫瘤抗原的能力，相對于傳統(tǒng)的car-t細胞能夠識別更廣泛的目標，進一步擴大了腫瘤細胞的清除范圍。octs的基礎(chǔ)設(shè)計中包括兩個腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associatedantigen，taa)結(jié)合區(qū)(通常來源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scfv段)，一個胞外鉸鏈區(qū)，一個跨膜區(qū)，兩個胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)和一個效應(yīng)元件區(qū)。scfv區(qū)域?qū)τ趏cts的特異性、有效性以及基因改造t細胞自身的安全性來說是關(guān)鍵的決定因素。隨著octs-car-t的即將進入臨床研究階段標志著car-t細胞治療即將進入2.0時代。本發(fā)明所采用的載體骨架可以應(yīng)用于第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)上，也可以應(yīng)用于第二代慢病毒載體結(jié)構(gòu)上。第二代和第三代慢病毒載體在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別如圖2b所示。本發(fā)明優(yōu)選第三代慢病毒載體(如圖2a所示)，3’sinltr去除了u3區(qū)域，消除了慢病毒載體自我復(fù)制的可能性，大大提高了安全性；增加了cppt和wpre元件，提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)基因的表達效率；采用rsv啟動子保證了慢病毒載體包裝時核心rna的持續(xù)高效轉(zhuǎn)錄；采用人自身的ef1α啟動子，使car基因能夠在人體內(nèi)長時間持續(xù)表達。本發(fā)明所述的pdl1單鏈抗體輕鏈vl、pdl1單鏈抗體重鏈vh、pdl1單鏈抗體均經(jīng)過人源化改造，能有有效減少體內(nèi)人抗鼠抗(humananti-mouseantibodies，hama)的產(chǎn)生，延長scfv的半衰期和作用效果，增加octs-car-t細胞的存在時間。本發(fā)明中使用的共刺激因子的一種或若干種組合，能夠增加轉(zhuǎn)導(dǎo)后細胞的增殖速率、存活時間、殺傷效率、免疫記憶等特性。本發(fā)明采用的octs-car-t細胞由gmp級別的車間生產(chǎn)后，可用于人體臨床實驗。本發(fā)明的重組慢病毒載體可以實現(xiàn)在人t淋巴細胞上表達psma、pdl1等組合的雙靶向嵌合抗原受體，引導(dǎo)并激活t淋巴細胞對psma、pdl1等陽性細胞的殺傷作用，在臨床上可用于前列腺癌、黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤的治療。本發(fā)明通過重組慢病毒載體骨架、octs結(jié)構(gòu)域、pd1配體(pd-l1)的singlechainantibody(單鏈抗體)構(gòu)建形成重組慢病毒載體，該方式得到的重組慢病毒載體可以實現(xiàn)在人t淋巴細胞內(nèi)表達細胞程式死亡配體1(programmedcelldeath1ligand1，pdl1)的單鏈抗體，能有效封閉pdl1，阻斷免疫負調(diào)節(jié)信號通路，臨床上可用于抑制腫瘤的免疫逃脫，提高car-t細胞免疫治療的療效?？梢?，本發(fā)明所述的octs-car-t細胞將給腫瘤細胞治療提供可靠的保障。附圖說明圖1是本發(fā)明所述的octs嵌合受體的示意圖，包含了串聯(lián)octs(seriesocts)和轉(zhuǎn)角octs(turnocts)示意圖；圖2本發(fā)明所述的慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖；其中圖2a是本發(fā)明采用的第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖，圖2b是第二代和第三代慢病毒載體結(jié)構(gòu)比較示意圖；圖3為本發(fā)明實施例1中構(gòu)建本發(fā)明所述的重組慢病毒載體的構(gòu)建流程圖。其中，(a)圖是慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic的結(jié)構(gòu)示意圖；(b)圖是2個octs質(zhì)粒的示意圖；(c)圖是ppac-gp質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；(d)圖是ppac-r質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；(e)圖是penv-g包裝質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明實施例1中octs結(jié)構(gòu)的元件順序示意圖，其中，a圖是串聯(lián)octs(seriesocts)的結(jié)構(gòu)示意圖，b圖是轉(zhuǎn)角octs(turnocts)的結(jié)構(gòu)示意圖，c圖是octs結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒編號(octssymbol)的列表示意圖；圖5是本發(fā)明實施例1中重組慢病毒質(zhì)粒pocts-pdl1psmas、pocts-pdl1psmat的酶切預(yù)測及酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；其中圖5a是pocts-pdl1psmas的酶切預(yù)測示意圖，圖5b是pocts-pdl1psmas的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5c是pocts-pdl1psmat的酶切預(yù)測示意圖，圖5d是pocts-pdl1psmat的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5a中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5a中的lane2是pocts-pdl1psmas的sacii酶切預(yù)測：條帶從上到下依次為：7158bp、2437bp、1863bp、557bp；圖5b中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；圖5b中的lane2是pocts-pdl1psmas的sacii酶切電泳結(jié)果；圖5c中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5c中的lane2是pocts-pdl1psmat的ecori酶切預(yù)測：條帶從上到下依次為：8988bp、1934bp、1355bp；圖5d中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結(jié)果；圖5d中的lane2是pocts-pdl1psmat的ecori酶切電泳結(jié)果；圖6是本發(fā)明實施例1中重組慢病毒載體的滴度檢測結(jié)果示意圖；圖7為本發(fā)明實施例1中所述的octs-car-t細胞構(gòu)建的步驟流程圖，包含分離培養(yǎng)、激活、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、octs-car-t細胞鑒定等階段；圖8是本發(fā)明實施例2中octs-car-t細胞的支原體檢測結(jié)果示意圖，其中，lane1為dl2000marker，從上到下條帶條帶從上到下依次為：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2為陽性對照；lane3為陰性對照；lane4為pbs；lane5為裂解液；lane6為octs-pdl1psmas-car-t細胞；lane7為octs-pdl1psmat-car-t細胞；圖9為本發(fā)明實施例2中流式檢測octs-car-t細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及免疫分型結(jié)果示意圖；其中，圖9a表示octs-pdl1psmas-car-t細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖9b表示octs-pdl1psmas-car-t細胞的免疫分型結(jié)果；圖9c表示octs-pdl1psmat-car-t細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率結(jié)果；圖9d表示octs-pdl1psmat-car-t細胞的免疫分型結(jié)果；圖10為本發(fā)明實施例3中不同效靶比條件下，octs-pdl1psmas-car-t細胞和octs-pdl1psmat-car-t細胞對不同靶細胞的殺傷結(jié)果比較示意圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例進一步闡述此發(fā)明。應(yīng)理解的是，在此描述的特定實施方式通過舉例的方式來表示，并不作為對本發(fā)明的限制。在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實施方式。材料1、慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic，慢病毒包裝質(zhì)粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白質(zhì)粒penv-g，hek293t/17細胞，同源重組酶，oligoannealingbuffer，支原體檢測試劑盒，內(nèi)毒素檢測試劑盒，psma+k562、pdl1+k562、pdl1+psma+k562、k562細胞購自世翱(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司；慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic的具體制備方法已經(jīng)公開在發(fā)明名稱為“一種基于復(fù)制缺陷性重組慢病毒的car-t轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用”，專利申請?zhí)枮?01610008360.5的專利申請說明書中；2、人新鮮外周血由健康供者提供；3、octs-pdl1psmas、octs-pdl1psmatdna序列組合由上海優(yōu)卡迪公司設(shè)計(參見圖4c)，交給上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸干粉或者質(zhì)粒形式保存；4、工具酶clai、ecori、sacii、t4dna連接酶均購自neb公司；5、0.22μm-0.8μmpes濾器購自millipore公司；6、d-pbs(-)、0.4％臺盼藍、篩網(wǎng)、各類型細胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)袋、培養(yǎng)板均購自corning公司；7、opti-mem、pen-srep、hepes、fbs、aim-v、rpmi1640、dmem、lipofectamine3000購自invitrogen公司；8、biotinylatedproteinl購自genescript公司；9、ldh檢測試劑盒購自promega公司；10、ficoll淋巴細胞分離液購自ge公司；11、20％人血白蛋白注射液購自杰特貝林公司；12、cryopremium凍存液、分選緩沖液來自上海優(yōu)卡迪公司；13、ril-2，ril-7，，ril-15，ril-21購自peprotech公司；14、cd3單克隆抗體，cd28單克隆抗體，cd3/cd28磁珠cd4/cd8磁珠購自德國miltenyi公司；15、冷凍離心機(美國thermoscientific公司；16、facs流式細胞儀購自thermo公司；17、熒光倒置顯微鏡購自olympus公司；18、cd4-fitc、cd8-apc購自biolegend公司；19、0.9％生理鹽水購自今邁公司；20、proteinlmagneticbeads購自biovision公司；21、primestar、retronectin購自takara公司；22、phycoerythrin(pe)-conjugatedstreptavidin購自bdbioscience公司；23、質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自mn公司；24、感受態(tài)細胞top10購自tiangen公司；25、nacl、kcl、na2hpo4.12h2o、kh2po4、trypsin、edta、cacl2、naoh、peg6000均購自上海生工；26、dneasy試劑盒購自上海捷瑞公司；27、sa-hrp購自上海翊圣公司；28、引物：根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計擴增dna片段和靶位點所需的引物，該引物由上海生物公司合成，具體為：ef1α-f：5’-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3’(seqidno.28)ef1α-r：5’-tcacgacacctgaaatggaaga-3’(seqidno.29)octs-f：catttcaggtgtcgtgaggatccgccaccatggcgctgccggtgac(seqidno.30)octs-r：ggggagggagaggggcttagcgcggcggcagcg(seqidno.31)ires-f：gcccctctccctccccc(seqidno.32)ires-r：attatcatcgtgtttttcaaaggaa(seqidno.33)pdl1scab-f：aaaacacgatgataatgccaccatgaactccttctccacaagcg(seqidno.34)pdl1scab-r：aatccagaggttgattgtcgacgaattctcatttgcccgggctcag(seqidno.35)wpre-qpcr-f：5’-cctttccgggactttcgcttt-3’(seqidno.36)wpre-qpcr-r：5’-gcagaatccaggtggcaaca-3’(seqidno.37)actin-qpcr-f：5’-catgtacgttgctatccaggc-3’(seqidno.38)actin-qpcr-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’(seqidno.39)29、本發(fā)明中，所述seqidno.1，seqidno.2，seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5，seqidno.6，seqidno.7，seqidno.8，seqidno.9，seqidno.10，seqidno.11，seqidno12，seqidno.13，seqidno.14，seqidno.15，seqidno.16，seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19，seqidno.20，seqidno.21，seqidno.22，seqidno.23，seqidno.24，seqidno.25，seqidno.26，seqidno.27所示dna片段由上海捷瑞生物工程有限公司根據(jù)本發(fā)明人提供的序列合成。實施例1octs-car-t細胞構(gòu)建一、重組慢病毒載體lvocts-pdl1psmas、lvocts-pdl1psmat的構(gòu)建、純化、檢測方法。參見圖3，本發(fā)明所述重組慢病毒載體的構(gòu)建方法如下：1、將人ef1α啟動子(seqidno.14)、octs結(jié)構(gòu)【octs-pdl1psmas、octs-pdl1psmat】(cd8leader嵌合受體信號肽(seqidno.15)、psma單鏈抗體輕鏈vl(seqidno.16)、psma單鏈抗體重鏈vh(seqidno.17)、pdl1單鏈抗體輕鏈vl(seqidno.18)、pdl1單鏈抗體重鏈vh(seqidno.19)、抗體內(nèi)鉸鏈inner-linker(seqidno.20)、單鏈抗體間鉸鏈inter-linker(seqidno.21)、cd8hinge嵌合受體鉸鏈(seqidno.22)、cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)(seqidno.23)、cd28嵌合受體共刺激因子(seqidno.24)、cd134嵌合受體共刺激因子(seqidno.25)、tcr嵌合受體t細胞激活域(seqidno.26))、pdl1單鏈抗體(seqidno.27)組合成octs嵌合受體設(shè)計方案，經(jīng)過酶切、連接、重組反應(yīng)克隆至慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic中，分別得到重組慢病毒質(zhì)粒pocts-pdl1psmas、pocts-pdl1psmat，元件順序和編號如圖4所示。(1)將慢病毒骨架質(zhì)粒plenti-3gbasic使用clai和ecori限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認5823bp的片段v1，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；1、溶膠按200μlnti/100mggel比例加入溶膠液，50℃水浴放置5-10分鐘。2、結(jié)合dna11000g離心30秒，棄去濾液。3、洗膜加入700μlnt3，11000g離心30秒，棄去濾液。4、洗膜重復(fù)第三步一次5、晾干11000g離心1分鐘，換新的收集管，室溫放置1分鐘。6、洗脫dna加入15-30μlne，室溫放置1分鐘，11000g離心1分鐘，收集濾液。表1瓊脂糖凝膠回收步驟(2)用引物ef1α-f和ef1α-r以合成的人ef1α啟動子(seqidno.14)為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認1208bp的片段a，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；表250μlpcr反應(yīng)體系(3)用引物octs-f和octs-r以合成的octs-pdl1psmas為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2352bp的片段b，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(4)用引物octs-f和octs-r以合成的octs-pdl1psmat為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2406bp的片段c，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(5)用引物ires-f和ires-r以合成的ires核糖體結(jié)合序列(seqidno.12)為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認575bp的片段d，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(6)用引物pdl1scab-f和pdl1scab-r以合成的pdl1單鏈抗體(seqidno.27)為模板，使用表2中的體系，pcr循環(huán)條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認1557bp的片段e，并割膠回收置于eppendorf管內(nèi)，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)的片段(見表1)，并測定產(chǎn)物的純度和濃度；(7)將重組慢病毒質(zhì)粒dna片段組合(見表3)以5μl總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入eppendorf管內(nèi)，加入同源重組酶反應(yīng)液15μl，混勻后在42℃孵育30分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上放置2-3分鐘，將反應(yīng)液加入50μltop10中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預(yù)加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻2-3分鐘，每管加900μllb培養(yǎng)液，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育1小時使細菌復(fù)蘇，取100μl的轉(zhuǎn)化菌液涂布于amplb瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，16小時。重組慢病毒質(zhì)粒片段組合pocts-pdl1psmasa、b、d、epocts-pdl1psmata、c、d、e表3重組慢病毒質(zhì)粒dna片段組合挑取克隆進行菌落pcr鑒定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質(zhì)粒pocts-pdl1psmas、pocts-pdl1psmat，對正確的克隆進行酶切鑒定(見圖5)，并送測序復(fù)核結(jié)果。2、重組慢病毒載體lvocts-pdl1psmas、lvocts-pdl1psmat的包裝。(1)完全培養(yǎng)基：取出預(yù)熱好的新鮮培養(yǎng)基，加入10％fbs+5mlpen-srep，上下顛倒混勻即可；(2)1xpbs溶液：稱量nacl8g，kcl0.2，na2hpo4.12h2o3.58g，kh2po40.24g置于1000ml燒杯中，加入900mlmilli-qgrade超純水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高溫濕熱滅菌20min；(3)0.25％trypsin溶液:稱量trypsin2.5g，edta0.19729g置于1000ml燒杯中，加入900ml1xpbs溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μm過濾除菌，長期使用可保存至-20℃冰箱；(4)0.5mcacl2溶液：稱量36.75gcacl2用400mlmilli-qgrade超純水溶解；用milli-qgrade超純水將總體積定容至500ml，混勻；0.22μm過濾除菌，分裝保存到50ml離心管中，每管45ml左右，4℃保存。(5)2xhbs溶液：稱量4.09gnacl，0.269gna2hpo4，5.96ghepes，用400mlmilli-qgrade超純水溶解；校準ph儀后，用2mnaoh溶液將hbs溶液的ph調(diào)到7.05。調(diào)整每瓶hbs的ph消耗2mnaoh為3ml左右；(6)從液氮罐中取出凍存的hek293t/17細胞，迅速轉(zhuǎn)移到37℃水浴中，1～2min后轉(zhuǎn)移到超凈臺中，無菌操作將凍存管中的液體全部轉(zhuǎn)移至10cm2培養(yǎng)皿中，補足含10％fbs的dmem至8ml/10cm2dish，24h后顯微鏡觀察細胞，細胞匯合的程度大于80％進行傳代；(7)選擇細胞狀態(tài)良好、無污染的hek293t/17細胞，每2-6個培養(yǎng)皿為一組，將細胞胰酶消化后，用電動移液器吸取4-12ml完全培養(yǎng)基，向每個消化后的培養(yǎng)皿中加2ml，避免培養(yǎng)皿變干；使用1ml移液器將所有細胞吹打成單細胞懸液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中；(8)將上述2-6個培養(yǎng)皿中的剩余細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基瓶中，并用培養(yǎng)基再沖洗一便培養(yǎng)皿；(9)蓋緊培養(yǎng)基瓶蓋，上下顛倒10次左右充分混勻細胞懸液，將細胞傳到8-24個10cm2培養(yǎng)皿中，每皿的細胞密度應(yīng)當(dāng)約4×106個/10ml完全培養(yǎng)基左右。如果細胞密度和預(yù)期的相差較大，則需要對細胞進行計數(shù)，然后按照4×106個/皿的量接種；(10)每6個培養(yǎng)皿整理為一摞，注意保持上下皿之間的配合。將培養(yǎng)皿左右，前后晃動數(shù)次，使細胞充分鋪開，然后放入5％co2培養(yǎng)箱。剩余細胞做同樣處理；(11)檢查所傳代細胞，細胞匯合度應(yīng)當(dāng)為70-80％，輪廓飽滿，貼壁良好，在細胞培養(yǎng)皿中均勻分布；(12)為細胞換液，將培養(yǎng)基替換為新鮮完全培養(yǎng)基,每皿9ml，并將培養(yǎng)箱的co2濃度設(shè)定值提高到8％；(13)按照n+0.5配dna/cacl2溶液。每皿hek293t/17細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量按照下列比例使用：重組慢病毒質(zhì)粒(20μg),ppac-gp(15μg)，ppac-r(10μg),penv-g(7.5μg)。取一個新的5ml離心管，加入0.5mcacl2：0.25ml，重組慢病毒質(zhì)粒20μg：ppac-gp15μg：ppac-r10μg：penv-g7.5μg，補充超純水至0.5ml蓋上蓋子，充分混勻；(14)另取一支5ml離心管，加入0.5mldna/cacl2溶液。打開渦旋振蕩器，一只手拿住5ml離心管的上端，使管底接觸振蕩頭，使液體在管壁上散開流動，另一只手拿一把1ml移液槍，吸取0.5ml2×hbs溶液，緩慢滴加進入離心管，控制流速，以半分鐘滴完為宜。2×hbs加入后，繼續(xù)振蕩5秒鐘，停止振蕩，可直接加入需要轉(zhuǎn)染的細胞中；(15)取一皿細胞，將離心管中的1ml鈣轉(zhuǎn)液滴加進去，盡可能使鈣轉(zhuǎn)試劑分布到整個培養(yǎng)皿中；(16)鈣轉(zhuǎn)液加入后，在皿蓋上做好標記，將培養(yǎng)皿放還到另一個5％co2培養(yǎng)箱中。確保培養(yǎng)皿水平放置，每摞培養(yǎng)皿不要超過6個。在5％co2培養(yǎng)箱中放置(6–8h)；(17)將第一個培養(yǎng)箱的co2濃度設(shè)定值調(diào)回到5％；(18)24小時后，檢查細胞狀態(tài)。細胞匯合度應(yīng)當(dāng)為80–85％左右，狀態(tài)良好。將培養(yǎng)基吸走，更換10ml新鮮的dmem完全培養(yǎng)基；(19)48小時后，觀察轉(zhuǎn)染效率。絕大多數(shù)細胞仍然是貼壁的?？梢钥吹匠^95％細胞都會帶有綠色熒光。將同一個病毒包裝上清液收集到一起，并向培養(yǎng)皿中繼續(xù)添加10ml新鮮培養(yǎng)基；(20)72小時后，再次將同一個病毒上清液收集到一起，兩次收集的病毒可以放在一起，丟棄培養(yǎng)皿；此時收集的上清里包含了重組慢病毒載體lvocts-pdl1psmas、lvocts-pdl1psmat。3、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體；(1)將收集的上清液使用thermo真空泵，經(jīng)0.22μm-0.8μm的pes濾器抽濾，除去雜質(zhì)；(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5mnacl250mmtris-hcl(ph6-8)；(3)將2個離子交換柱串聯(lián)放置，用4ml1mnaoh、4ml1mnacl、5ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液依次過柱；(4)將步驟2中獲得的溶液通過蠕動泵以1-10ml/min的速度給離子交換柱上樣；(5)全部上清液過柱后，使用10ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液清洗一遍；(6)根據(jù)上樣量使用1-5ml1.5mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)進行洗脫，收集洗脫液；(7)將洗脫液分成25到50μl一管，凍存到-80℃冰箱，進行長期保存；4、重組慢病毒載體滴度測定；(1)取24孔板接種293t細胞。每孔細胞為5×104個，所加培養(yǎng)基體積為500ul,不同種類的細胞生長速度有所差異，進行病毒感染時的細胞融合率為40％-60％；(2)準備3個無菌ep管，在每個管中加入90ul的新鮮完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)接種細胞24小時后，取兩個孔的細胞用血球計數(shù)板計數(shù)，確定感染時細胞的實際數(shù)目，記為n；(3)取待測定的病毒原液10ul加入到第一個管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二個管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs),終體積為500ul；(4)感染開始后20小時，除去培養(yǎng)上清，更換為500μl完全培養(yǎng)基(高糖dmem+10％fbs)，5％co2繼續(xù)培養(yǎng)48小時；(5)72小時后，觀察熒光表達情況，正常情況下，熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應(yīng)減少,并拍照；(6)用0.2ml0.25％胰酶-edta溶液消化細胞，在37℃放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗整個細胞面，離心收集細胞。按照dneasy試劑盒的說明抽提基因組dna。每個樣品管中加入200μl洗脫液洗下dna并定量；(7)準備目的dna檢測qpcrmix總管ⅰ(qpcr引物序列為seqidno.36---seqidno.37)：n＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlh2o混和。震蕩后放在冰上；(8)準備內(nèi)參dna檢測qpcrmix管ⅱ(qpcr引物序列為seqidno.38---seqidno.39)：2×taqmanmastermix25μl×n10×rnasepprimer/probemix2.5μl×nh2o17.5μl×nn＝numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，100μl10×rnasepprimer/probemix和700μlh2o混和。震蕩后放在冰上；(9)在預(yù)冷的96孔pcr板上完成pcr體系建立。從總管ⅰ中各取45μl加入到a-d各行的孔中，從總管ⅱ中各取45μl加入到e-g各行的孔中。(10)分別取5μl質(zhì)粒標準品和待測樣品基因組dna加入到a-d行中，每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。(11)分別取5μl基因組標準品和待測樣品基因組dna加入到e-g行中，每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。(12)所使用定量pcr儀為abiprism7500定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50℃2分鐘，95℃10分鐘，然后是95℃15秒，60℃1分鐘的40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測得的dna樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的計算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v其中：c＝平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)n＝感染時細胞的數(shù)目(約為1×105)d＝病毒載體的稀釋倍數(shù)v＝加入的稀釋病毒的體積數(shù)(13)重組慢病毒載體lvocts-pdl1psmas、lvocts-pdl1psmat的滴度結(jié)果(如圖6所示)；二、octs-car-t細胞構(gòu)建參見圖7，本發(fā)明所述octs-car-t細胞的構(gòu)建方法如下：1、分離pbmc。(1)抽取健康供者新鮮外周血50ml；(2)將采血袋噴拭酒精兩遍，并擦干。(3)用50ml注射器將袋中的血細胞吸出來移至新50ml管中。(4)400g，20℃離心10min。(5)將上層血漿移到新的50ml離心管中，56℃，30min滅活血漿，恢復(fù)至室溫，2000g，離心30min，取上清到50ml離心管中待用。(6)用d-pbs(-)補至50ml，擰緊蓋子，顛倒混勻。(7)取2個新50ml離心管，每管加入15mlficoll淋巴細胞分離液。(8)向每管ficoll上小心加入血細胞稀釋液25ml。800g，20℃離心20min。(9)離心管中液體分為四層，從上至下分別為：黃色的血漿層(回收待用)、白膜層、無色透明的ficoll層、紅黑色的混合細胞層。(10)小心吸取白膜層到新50ml離心管中，補加d-pbs(-)至50ml，顛倒混勻后500g，20℃離心10min。(11)加入25ml5％人血白蛋白并重懸細胞，400g，20℃離心10min。(12)棄上清，加入25ml5％人血白蛋白重懸細胞沉淀，并過70um篩網(wǎng)，計數(shù)。(13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余細胞懸液400g，20℃離心10min，加cryopremium并凍存。2、cd4/cd8陽性t細胞分選。(1)將獲得的pbmc計數(shù)，以80ul/107cells的比例加入分選緩沖液，重懸細胞沉淀。(2)再以20ul/107cells的比例加入cd4/cd8磁珠，吹打混勻后放入4℃中孵育15min。(3)取出磁珠-細胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分選緩沖液，顛倒混勻后，250g，4℃離心10min。(4)以500ul/108cells的比例加入分選緩沖液，重懸細胞沉淀。(5)用鑷子夾取ls分離柱到磁力架上。(6)同時準備2個15ml離心管，分別標記：cd4-/cd8-細胞液(a管)、cd4+/cd8+細胞液(b管)。(7)用3ml分離緩沖液潤洗ls,并用a管接緩沖液。(8)加入細胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml緩沖液沖洗柱子(每次無液體殘留時再加入新的液體)，總共三次，收集得到cd4/cd8-細胞。(9)ls分離柱與磁力架分離，用b管接細胞懸液，加入5ml緩沖液，將并用柱子內(nèi)塞稍用力沖洗，收集為cd4+/cd8+細胞，取樣計數(shù)。(10)按1x106/ml-4x106/ml的細胞密度用aim-v培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，并加入2×105～1×106u/lifn-γ因子。3、t細胞激活。(1)提前一天將1×103ug/l～1×104ug/lcd3單克隆抗體和1×103ug/l～1×104ug/lcd28單克隆抗體加入24孔板，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)取出包被的t75瓶，倒掉包被液，用d-pbs(-)洗滌一次，并將分選得到的細胞懸液接種到t75瓶中，搖勻，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、car基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及octs-car-t細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)。(1)提前一天包被1×103ug/l～1×104ug/lretronectin于24孔板內(nèi)，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)往24孔板中，根據(jù)每孔5×105細胞量，按moi＝5～20的量，分別加入lvocts-pdl1psmas、lvocts-pdl1psmat慢病毒轉(zhuǎn)基因載體，同時添加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)。5、octs-car-t細胞體外擴增。(1)每2天等量補加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養(yǎng)基，使ph值維持在6.5～7.5之間，細胞密度維持在5×105～2×106/ml之間，37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)10-14天。(2)第7天左右，凍存培養(yǎng)的octs-car-t細胞用于后續(xù)檢測。實施例2octs-car-t細胞病原檢測和表達檢測。一、內(nèi)毒素檢測；(1)、內(nèi)毒素工作標準品為15eu/支；(2)、鱟試劑靈敏度λ＝0.25eu/ml，0.5ml/管(3)、內(nèi)毒素標準品稀釋：取內(nèi)毒素標準品一支，分別用bet水按比例稀釋成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震蕩溶解15min；稀釋時每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s；(4)、加樣：取鱟試劑若干支，每支加入bet水0.5ml溶解，分裝至若干支無內(nèi)毒素試管中，每管0.1ml。其中2支為陰性對照管，加入bet水0.1ml；2支為陽性對照管，加入2λ濃度的內(nèi)毒素工作標準品溶液0.1ml；2支為樣品陽性對照管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標準品的樣品溶液(稀釋20倍的待測樣品1ml+4λ的內(nèi)毒素標準品溶液1ml＝2ml含2λ內(nèi)毒素標準品的稀釋40倍樣品)。樣品管中加入0.1ml樣品，稀釋比例見表4，37±1℃水浴(或培養(yǎng)箱)保溫60±1min；表4內(nèi)毒素稀釋比例及對應(yīng)內(nèi)毒素含量(5)、octs-car-t細胞的內(nèi)毒素檢測結(jié)果(如表5所示)，所有細胞的內(nèi)毒素含量均小于2.5eu/ml，符合《中華人民共和國藥典》中小于10eu/ml的標準；表5稀釋倍數(shù)原液510204080160對應(yīng)eu/ml0.251.252.55102040octs-pdllpsmas-car-t(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)ocis-pdllpsmat-car-t(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)二、支原體檢測；(1)在實驗前三日，細胞樣品用無抗生素培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；(2)收集1ml細胞懸浮液(細胞數(shù)大于1*105)，置于1.5ml離心管中；(3)13000g離心1min，收集沉淀，棄去培養(yǎng)基；(4)加入500ulpbs用槍頭吹吸或渦旋振蕩，重懸沉淀。13000g離心5min；(5)步驟4重復(fù)一次；(6)加入50μlcelllysisbuffer，用槍頭吹吸，充分混勻后,在55℃水浴中孵育20min；(7)將樣品置于95℃中加熱5min；(8)13000g離心5min后，取5μl上清作為模板，25μlpcr反應(yīng)體系為：ddh206.5μl、mycomix1μl、2xtaqplusmixmaster(dyeplus)12.5μl、模板5μl；pcr循環(huán)條件為：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。(9)支原體檢測結(jié)果顯示(如圖8所示)，octs-car-t細胞中均不含支原體。三、octs基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測及免疫分型檢測；(1)收集經(jīng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的t細胞，用含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細胞并調(diào)整為1×106/ml。(2)向離心管中加入含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液1ml并混勻，350g離心5min，棄上清。(3)重復(fù)步驟2一次。(4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細胞，并向離心管中加入1ul的1mg/ulproteinl，5ulcd4-fitc，5ulcd8-apc，混勻，4℃孵育45min。(5)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液并混勻，350g離心5min，棄上清。(6)重復(fù)步驟5兩次。(7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細胞，并向離心管中加入0.2ulpe-sa，混勻，37℃避光孵育15min。(8)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重并混勻，350g離心5min，棄上清。(9)用1mld-pbs(-)溶液重懸細胞沉淀，350g離心5min，棄上清。(10)重復(fù)步驟9兩次。(11)用0.4mld-pbs(-)溶液重懸細胞沉淀，流式細胞儀進行檢測。(12)octs基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及免疫分型檢測的檢測結(jié)果如圖9所示，制備的octs-car-t細胞的感染效率均位于40％以上，cd4陽性細胞和cd8陽性細胞的比例位于1:3～3:1之間，可以進行后續(xù)功能檢測。實施例3octs-car-t細胞的功能檢測。一、靶細胞殺傷效果評估。(1)分別培養(yǎng)靶細胞[psma+k562、pdl1+k562、pdl1+psma+k562、k562細胞]和效應(yīng)細胞[octs-car-t細胞]；(2)收集靶細胞4x105cells和octs-car-t細胞2.8x106cells，800g，6min離心，棄上清；(3)用1mld-pbs(-)溶液分別重懸靶細胞和效應(yīng)細胞，800g，6min離心，棄上清；(4)重復(fù)步驟3一次；(5)用700ul培養(yǎng)基(aim-v培養(yǎng)基+1～10％fbs)重懸效應(yīng)細胞，用2ml培養(yǎng)基(aim-v培養(yǎng)基+1～10％fbs)重懸靶細胞；(6)設(shè)置效靶比為1:1、5:1、10:1的實驗孔，效應(yīng)細胞分別與單靶細胞和雙靶細胞共孵育的分組情況如表6所示，并設(shè)置對照組(k562細胞)，每組3個復(fù)孔；表6效應(yīng)細胞靶細胞1靶細胞2靶細胞3octs-pdllpsmas-car-tpdll+k562psma+k562pdll+psma+k562octs-pdllpsmat-car-tpdll+k562psma+k562pdll+psma+k562(7)250g，5min平板離心；(8)37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時；(9)250g，5min平板離心；(10)取每個孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；(11)避光孵育25min；(12)每孔加入50ul終止液；(13)酶標儀檢測490nm吸光度；(14)將3個復(fù)孔取平均值；將所有實驗孔、靶細胞孔和效應(yīng)細胞孔的吸光值減去培養(yǎng)基背景吸光值的均值；將靶細胞最大值的吸光值減去體積校正對照吸光值的均值。(15)將步驟14中獲得的經(jīng)過校正的值帶入下面公式，計算每個效靶比所產(chǎn)生的細胞毒性百分比。結(jié)果如圖10所示，octs-car-t對各自的單靶細胞和雙靶細胞均有較好的殺傷效果，turnocts結(jié)構(gòu)的car-t細胞對靶細胞的殺傷效率略高于seriesocts結(jié)構(gòu)的car-t細胞；殺傷效率＝(實驗孔-效應(yīng)細胞孔-靶細胞孔)/(靶細胞最大孔-靶細胞孔)x100％(16)上述實驗結(jié)果表明，通過對傳統(tǒng)car結(jié)構(gòu)中抗原識別區(qū)的改造形成的octs結(jié)構(gòu)，能夠顯著提高octs-car-t細胞識別并殺傷靶細胞的范圍，因此octs-car-t細胞將在未來的psma陽性/pdl1陽性/psma、pdl1雙陽性的前列腺癌、黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤的細胞治療中發(fā)揮巨大的作用。序列表<110>上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司<120>一種基于octs技術(shù)的前列腺癌car-t治療載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用<130>hj17-13349<160>39<170>patentinversion3.5<210>1<211>861<212>dna<213>人工序列<400>1atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct60gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca120cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcccc180gaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcc240cgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttg300gttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatta360tgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatc420ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcctt480gatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg540cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct600tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc660tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtct720cgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctac780acgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcc840tcactgattaagcattggtaa861<210>2<211>674<212>dna<213>人工序列<400>2cccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgc60ttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacca120actctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttcta180gtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgct240ctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttg300gactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgc360acacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcta420tgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagg480gtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagt540cctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagggggg600cggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctgg660ccttttgctcacat674<210>3<211>147<212>dna<213>人工序列<400>3atcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttt60tttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgagga120ggcttttttggaggcctagacttttgc147<210>4<211>228<212>dna<213>人工序列<400>4gtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgc60cttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcg120tgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgcc180gcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacg228<210>5<211>180<212>dna<213>人工序列<400>5ggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccac60tgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgt120gtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca180<210>6<211>234<212>dna<213>人工序列<400>6tgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcac60acaacagacgggcacacactacttgaagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagca120gtgggttccctagttagccagagagctcccaggctcagatctggtctaaccagagagacc180cagtacaagcaaaaagcagatcttattttcgttgggagtgaattagcccttcca234<210>7<211>353<212>dna<213>人工序列<400>7atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattc60ggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcaggg120agctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaa180tactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatata240atacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaag300ctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaa353<210>8<211>233<212>dna<213>人工序列<400>8aggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaat60gacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaattt120gctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagca180gctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcc233<210>9<211>489<212>dna<213>人工序列<400>9tggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgcta60gttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacag120agaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagca180agaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtt240taacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggt300aggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattc360accattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaat420agaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcg480acggttaac489<210>10<211>119<212>dna<213>人工序列<400>10ttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataat60agcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaatttta119<210>11<211>696<212>dna<213>人工序列<400>11atggcccagtccaagcacggcctgaccaaggagatgaccatgaagtaccgcatggagggc60tgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcgagggcatcggctaccccttcaagggc120aagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcggccccttgcccttcgccgaggacatc180ttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgttcaccgagtacccccaggacatcgtc240gactacttcaagaactcctgccccgccggctacacctgggaccgctccttcctgttcgag300gacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcaccgtgagcgtggaggagaactgcatg360taccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccccgccgacggccccgtgatgaagaag420atgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagatcatccccgtgcccaagcagggcatc480ttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaaggacggtggccgcttgcgctgccag540ttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatc600cagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgacc660gagcacgccatcgcctccggctccgccttgccctga696<210>12<211>575<212>dna<213>人工序列<400>12gcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggt60gtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggccc120ggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaag180gaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagac240aaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcc300tctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgcc360acgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctcacctcaagcgtattcaaca420aggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggt480gcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacgg540ggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataat575<210>13<211>592<212>dna<213>人工序列<400>13aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctc420gcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592<210>14<211>1178<212>dna<213>人工序列<400>14gctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggg60gaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtg120atgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcag180tagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccg240tgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaatta300cttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtggg360agagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggc420ctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctt480tcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggc540aagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccg600cgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgag660cgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctg720gcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccag780ttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggagga840cgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt900cctcagccgtcgcttcatgtgactccactgagtaccgggcgccgtccaggcacctcgatt960agttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatgg1020agtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaat1080tctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacag1140tggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtga1178<210>15<211>63<212>dna<213>人工序列<400>15atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccg63<210>16<211>321<212>dna<213>人工序列<400>16gatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcaccagcgtgggcgatcgcgtgacc60ctgacctgcaaagcgagccaggatgtgggcaccgcggtggattggtatcagcagaaaccg120ggcccgagcccgaaactgctgatttattgggcgagcacccgccataccggcattccgagc180cgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcagcctgcagccg240gaagattttgcggattattattgccagcagtataacagctatccgctgacctttggcccg300ggcaccaaagtggatattaaa321<210>17<211>345<212>dna<213>人工序列<400>17gaagtgcagctggtgcagagcggcccggaagtgaaaaaaccgggcgcgaccgtgaaaatt60agctgcaaaaccagcggctatacctttaccgaatataccattcattgggtgaaacaggcg120ccgggcaaaggcctggaatggattggcaacattaacccgaacaacggcggcaccacctat180aaccagaaatttgaagataaagcgaccctgaccgtggataaaagcaccgataccgcgtat240atggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcggcgggctgg300aactttgattattggggccagggcaccctgctgaccgtgagcagc345<210>18<211>333<212>dna<213>人工序列<400>18gatattgtgctgacccagagcccggcgagcctggcggtgagcccgggccagcgcgcgacc60attacctgccgcgcgagccagagcgtgagcaccagcagcagcagctttatgcattggtat120cagcagaaaccgggccagccgccgaaactgctgattaaatatgcgagcaacctggaaagc180ggcgtgccggcgcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattaac240ccggtggaagcgaacgataccgcgaactattattgccagcatagctgggaaattccgtat300acctttggccagggcaccaaactggaaattaaa333<210>19<211>348<212>dna<213>人工序列<400>19gaagtgcagctggtggaaagcggcggcggcctggtgaaaccgggcggcagcctgcgcctg60agctgcgcggcgagcggctttatttttcgcagctatggcatgagctgggtgcgccaggcg120ccgggcaaaggcctggaatgggtggcgagcattagcagcggcggcagcacctattatccg180gatagcgtgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacagcctgtatctg240cagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgcggtgtatgattgcgcgcgcggctatgat300agcggctttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagca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