本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

真核細(xì)胞細(xì)胞膜上的磷脂分子分布是不對(duì)稱(chēng)的。一般情況下磷酸酰絲氨酸(phosphatidylserine，ps)和磷酸酰乙醇胺(phosphatidyetholanie，pe)分布在細(xì)胞的內(nèi)膜，磷酸酰膽堿(phosphatidylcholine，pc)分步在外膜。真核細(xì)胞基因組編碼14個(gè)p4型atpase內(nèi)翻酶來(lái)維持這種脂質(zhì)分子的不對(duì)稱(chēng)分布。ps和pe在細(xì)胞膜上不對(duì)稱(chēng)分布對(duì)重要細(xì)胞生理過(guò)程如膜穩(wěn)定、血液凝聚反應(yīng)調(diào)控、囊泡蛋白運(yùn)輸、清除凋亡細(xì)胞都至關(guān)重要。atp8b1,atp8a2和atp11c基因突變導(dǎo)致數(shù)種人類(lèi)疾病，揭示了p型atp酶的重要性。atp8b1導(dǎo)致i型漸進(jìn)式家族性肝內(nèi)膽汁淤積(progressivefamilialintrahepaticcholestasistypei)和復(fù)發(fā)型肝內(nèi)膽汁淤積。atp8a2突變導(dǎo)致小腦共濟(jì)失調(diào)、智力發(fā)育遲緩和平衡缺乏綜合癥。atp11c缺失導(dǎo)致b細(xì)胞發(fā)育缺陷，貧血和肝內(nèi)膽汁淤積。

p4型atp酶需要結(jié)合蛋白tmem30才能正確折疊和運(yùn)輸。tmem30和na-katp酶的β亞基作用相似，參與p4型atp酶的催化反應(yīng)過(guò)程。真核生物基因組編碼三個(gè)tmem30蛋白，所以一個(gè)tmem30蛋白需結(jié)合多個(gè)p4型atp酶。tmem30a廣泛表達(dá)在多個(gè)組織，在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞中也特異表達(dá)。tmem30a在人類(lèi)染色體上定位于6號(hào)染色體短臂，由7個(gè)外顯子組成，其轉(zhuǎn)錄本大小為2kb，編碼的蛋白大小為44kd，各組織內(nèi)普遍都有表達(dá)。

經(jīng)序列分析，tmem30a在真核生物中高度保守，含有兩個(gè)膜錨定區(qū)域，并具有糖基化位點(diǎn)。tmem30a的體內(nèi)功能還不甚明了，對(duì)其研究尚處于初步階段。有必要通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物和細(xì)胞模型對(duì)其功能進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

糖尿病(diabetesmellitus，dm)發(fā)病率不斷攀升，已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。dm會(huì)引起病人多個(gè)器官并發(fā)癥，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)也可導(dǎo)致殘障、死亡。目前對(duì)糖尿病的發(fā)病機(jī)制了解尚不清楚。合適的糖尿病動(dòng)物模型，對(duì)闡明dm及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制十分重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明利用胰島β細(xì)胞cre轉(zhuǎn)基因鼠，構(gòu)建了tmem30a胰島β細(xì)胞特異敲除小鼠模型，以便研究其在胰島里的功能。

因此，本發(fā)明一方面旨在提供一種胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明另一方面旨在提供該胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠模型用于糖尿病研究。

在第一方面，本發(fā)明提供了一種胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)將與小鼠tmem30a基因同源的5’臂、含有報(bào)告基因lacz的表達(dá)框、有neo抗性基因的表達(dá)框、兩端有同向排列l(wèi)oxp位點(diǎn)的第3外顯子和3’端臂克隆到bac載體以用于替換欲敲除的tmem30a基因第3個(gè)外顯子；

2)利用dna同源重組技術(shù)將tmem30a基因中的第3個(gè)外顯子替換，得到tmem30a基因條件性敲除的小鼠胚胎干細(xì)胞；

3)利用步驟2)得到的胚胎干細(xì)胞制備得到含tmem30a基因敲除細(xì)胞的嵌合體小鼠；

4)將步驟3)得到的嵌合體小鼠和野生型小鼠交配繁育，在后代中篩選出tmem30a基因敲除的雜合子小鼠；

5)將步驟4)得到的雜合子小鼠動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因鼠flper鼠交配繁育，得到tmem30a基因條件性敲除雜合子小鼠；

6)將步驟5)得到的tmem30a基因條件性敲除雜合子小鼠相互交配繁育，得到tmem30a基因條件性敲除純合子小鼠；

7)將步驟6)得到的tmem30a基因條件性敲除純合子小鼠與胰島β細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)基因鼠ins2-cre交配，得到胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠tmem30aloxp/loxp，ins2-cre。

進(jìn)一步地，步驟2)中，利用tmem30a敲除的打靶載體tmem30atm1a(komp)wtsi轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞，獲得含有打靶序列的胚胎干細(xì)胞；所述打靶載體有如下特征：

5’端長(zhǎng)臂為4201；3’端端長(zhǎng)臂為5123bp。在tmem30a第二個(gè)內(nèi)含子內(nèi)放置有en2剪接接受位點(diǎn)(splicingaccepting)，ires后面是lacz基因表明序列，ploya序列；

loxp位點(diǎn)后是人βactin啟動(dòng)子和新霉素(neomysin)編碼序列，以便于藥物篩選；

另外有兩個(gè)frt位點(diǎn)在兩端，以便使用flp工具書(shū)鼠刪除報(bào)告基因；

第三個(gè)外顯子兩端有同方向的loxp序列，以便使用cre刪除第三個(gè)外顯子，建立組織特異的敲除小鼠模型(詳見(jiàn)圖1)。

進(jìn)一步地，步驟3)中，具體制備方法是：將單個(gè)步驟2)獲得的胚胎干細(xì)胞顯微注射到小鼠胚囊中，并移植到假孕動(dòng)物的子宮中，分娩出含tmem30a突變細(xì)胞的嵌合體動(dòng)物。

進(jìn)一步地，步驟4)中，整合到生殖系的嵌合體動(dòng)物與野生型動(dòng)物c57bl/6j交配后，得到的子一代代動(dòng)物通過(guò)使用長(zhǎng)距離pcr篩選得到tmem30a基因敲除雜合子個(gè)體；將tmem30a基因敲除雜合子與flper基因敲入小鼠交配，刪除兩個(gè)frt位點(diǎn)之間的報(bào)告基因，得到含有兩個(gè)loxp位點(diǎn)的條件性敲除小鼠雜合子個(gè)體tmem30aloxp/+。

本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，tmem30a基因全身敲除純合子小鼠死于胚胎期9.5-12.5天，成功分娩出的是含tmem30a基因敲除的雜合子小鼠tmem30ako/+。

根據(jù)本發(fā)明的部分步驟或全部步驟，本發(fā)明可以提供出tmem30a基因條件性敲除雜合子小鼠tmem30aloxp/+和純合子小鼠tmem30aloxp/loxp，以及胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠tmem30aloxp/loxp，ins2-cre。

在另一方面，本發(fā)明提供了上述胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠模型的應(yīng)用，該胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠模型用于作為糖尿病研究的模型。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠表現(xiàn)出葡萄糖不耐受，胰島素敏感性差，可用作糖尿病研究模型。

附圖說(shuō)明

圖1.tmem30a突變的打靶載體示意圖。

圖2.tmem30a打靶載體酶切圖譜，打靶載體僅有1個(gè)ascsi酶切位點(diǎn)，酶切后成為線性質(zhì)粒。

圖3.實(shí)施例1中長(zhǎng)距離pcr擴(kuò)增5’端長(zhǎng)臂篩選轉(zhuǎn)染的小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用引物對(duì)gf3和lar3，擴(kuò)增產(chǎn)物為5.8kb。

圖4.實(shí)施例1中長(zhǎng)距離pcr擴(kuò)增3’端長(zhǎng)臂篩選轉(zhuǎn)染的小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用引物對(duì)raf5和gr3，擴(kuò)增產(chǎn)物為6.6kb。

圖5.實(shí)施例2中長(zhǎng)距離pcr鑒定陽(yáng)性子一代鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擴(kuò)增5’端長(zhǎng)臂使用引物對(duì)gf3和lar3，擴(kuò)增產(chǎn)物為5.8kb；擴(kuò)增3’端長(zhǎng)臂使用引物對(duì)raf5和gr3，擴(kuò)增產(chǎn)物為6.6kb；其中：204－1為陽(yáng)性雜合子，204－2為野生型對(duì)照。

圖6.實(shí)施例3中tmem30a條件性敲除模型的構(gòu)建示意圖。

圖7.實(shí)施例3中tmem30a敲除雜合子基因型鑒定結(jié)果，其中：(a)是對(duì)第三外顯子上游的loxp位點(diǎn)的pcr鑒定結(jié)果，擴(kuò)增片段為220bp；(b)是對(duì)人βactin啟動(dòng)子上游的loxp位點(diǎn)的pcr鑒定結(jié)果，擴(kuò)增片段為214bp；(c)是對(duì)第三外顯子下游的loxp位點(diǎn)的pcr鑒定結(jié)果，突變型擴(kuò)增片段為214bp，野生型擴(kuò)增片段為179bp。

圖8.實(shí)施例3中pcr鑒定tmem30a條件性敲除鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)第三外顯子下游的loxp位點(diǎn)做pcr鑒定，其中：野生型擴(kuò)增的片段為179bp(泳道3)；純合子(loxp/loxp)擴(kuò)增片段為214bp(泳道1和4)；雜合子(loxp/+)擴(kuò)增片段為兩條：214bp和179bp(泳道2)。

圖9.與胰島β細(xì)胞特異的cre(ins2-cre)交配建立胰島β細(xì)胞特異敲除動(dòng)物模型(簡(jiǎn)稱(chēng)ins2-tmem30ako)。需要兩次交配，才能得到胰島β細(xì)胞特異敲除小鼠ins2tmem30ako。

圖10.pcr鑒定胰島β細(xì)胞特異敲除小鼠，ins2tmem30ako需要使用引物對(duì)tmem-loxp-f2:attccccttcaagatagctac；

tmem-loxp-r2:aatgatcaactgtaattcccc通過(guò)pcr反應(yīng)對(duì)第三外顯子下游的loxp位點(diǎn)做pcr鑒定。野生型擴(kuò)增的片段為179bp(wt)；純合子(loxp/loxp)擴(kuò)增片段為214bp；雜合子(loxp/+)擴(kuò)增片段為兩個(gè)：214bp和179bp。另外對(duì)ins2-cre轉(zhuǎn)基因進(jìn)行基因型鑒定，所使用的引物對(duì)是：cre-f,5’-atttgcctgcattaccggtc–3’；cre-r,5’-atcaacgttttcttttcgg-3’。擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物片段為350bp，野生型無(wú)擴(kuò)增片段。

圖11.顯示ins2tmema30ako小鼠葡萄糖不耐受。

圖12.顯示ins2tmema30ako小鼠對(duì)胰島素敏感性差。

圖13.顯示ins2tmema30ako小鼠肝臟脂肪積累。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，通常按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例1.tmem30a雜合子小鼠的獲得

1)將打靶載體tmem30atm1a(komp)wtsi(從美國(guó)children'shospitaloaklandresearchinstitute購(gòu)買(mǎi))線性化之后，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞129sv，擴(kuò)增培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，篩選500個(gè)克隆，得到兩株包含有正確打靶序列的胚胎干細(xì)胞g6和a11。

tmem30a打靶載體tmem30atm1a(komp)wtsi結(jié)構(gòu)如圖1所示，5’端長(zhǎng)臂為4201bp，3’端長(zhǎng)臂為5123bp；在第二個(gè)內(nèi)含子內(nèi)放置有en2剪接接受位點(diǎn)(splicingaccepting，sa)，ires后面是lacz基因編碼序列，ploya序列(pa)；loxp位點(diǎn)后是人βactin啟動(dòng)子和新霉素(neomysin)編碼序列(neo)，以便于藥物篩選；另外有兩個(gè)frt位點(diǎn)在兩端，以便使用flp工具鼠刪除報(bào)告基因；第三個(gè)外顯子(e3)兩端有同方向的loxp序列，以便使用cre刪除第三個(gè)外顯子，建立組織特異的基因敲除小鼠模型。

本實(shí)施例1以第三個(gè)外顯子為具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，本發(fā)明包括但不限于在第三個(gè)外兩端加入同向排列的loxp位點(diǎn)以構(gòu)建條件性基因敲除小鼠，本發(fā)明還可以在第1,2,4,5,6或7等其他外顯子兩端加入同向排列的loxp位點(diǎn)以構(gòu)建條件性基因敲除小鼠。

將圖1所示的打靶載體用asisi內(nèi)切酶消化2小時(shí)進(jìn)行線性化，如圖2所示。

2)擴(kuò)增步驟1)篩選的克隆g6，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞后，用顯微囊胚注射的方法注入到c57bl/6j小鼠囊胚中，移植胚胎到假孕鼠子宮，得到整合tmem30a突變細(xì)胞的嵌合體雄小鼠。該嵌合體雄性小鼠與野生型雌性小鼠交配，得到的小鼠通過(guò)pcr篩選出tmem30a基因敲除(簡(jiǎn)稱(chēng)tmem30ako)雜合子小鼠，命名為tmem30a^tm1xzhu。

圖3和圖4是長(zhǎng)距離pcr篩選轉(zhuǎn)染的小鼠胚胎干細(xì)胞的結(jié)果。擴(kuò)增5’端長(zhǎng)臂使用引物對(duì)gf3和lar3，擴(kuò)增產(chǎn)物為5.8kb片段(圖3)。擴(kuò)增3’端長(zhǎng)臂使用引物對(duì)raf5和gr3，擴(kuò)增產(chǎn)物為6.6kb(圖4)。僅有第一個(gè)96孔板的d11和第二個(gè)96孔板的g6含有正確的5’端和3’端長(zhǎng)臂。各引物序列如下：

gf3：5’-gaggaagcggaagtgtaagttaccaag-3’(seqidno：1)；

lar3：5’-cacaacgggttcttctgttagtcc-3’(seqidno：2)；

raf5：5’-cacacctccccctgaacctgaaac-3’(seqidno：3)；

gr3：5’-gtgtgaagtcaacgtcattatcggagaatc-3’(seqidno：4)。

實(shí)施例2.tmem30a敲除小鼠純合子死于胚胎期9.5－12.5天

選用c57bl/6/129sv雜合背景的小鼠作為實(shí)驗(yàn)用小鼠。

實(shí)施例1獲得的tmem30ako雜合子小鼠與c57bl/6j小鼠交配，得到的c57bl/6/129sv雜合背景的tmem30ako雜合子小鼠可正常出生，且符合孟德?tīng)栆?guī)律。tmem30ako雜合子小鼠和野生型小鼠相比，無(wú)明顯差異。我們對(duì)tmem30ako雜合子小鼠間交配產(chǎn)生的后代進(jìn)行pcr等方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果參見(jiàn)圖5，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有存活的tmem30ako純合子小鼠出生。接著我們對(duì)其后代進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，野生型和雜合子所占的比例分別是1/3和2/3(表1)。此結(jié)果符合純合子胚胎致死后的孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。

表1.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析tmem30ako雜合子小鼠間交配的后代

為了確定tmem30ako純合子小鼠胚胎死亡的確切時(shí)間，我們分離了9.5-12.5天的胚胎。結(jié)合pcr等基因型檢測(cè)手段，以及通過(guò)胚胎形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，12.5天的胚胎中沒(méi)有tmem30ako純合子胚胎的存在；在9.5和10.5天的胚胎中，tmem30ako純合子發(fā)育遲緩，個(gè)體比野生型和雜合子小鼠小，且隨著天數(shù)的增加，個(gè)體差異更加明顯。

實(shí)施例3.tmem30a條件性敲除小鼠構(gòu)建

tmem30ako純合子致死影響了對(duì)其功能的深入研究。為了能在各個(gè)組織中詳細(xì)研究tmem30a的體內(nèi)功能，需要建立tmem30a條件性敲除小鼠。

將tmem30ako雜合子與flpdeleter(美國(guó)杰克森實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)，品系名b6.129s4-gt(rosa)26sortm1(flp1)dym/rainj,又稱(chēng)flper)鼠交配，所生的后代基因組中兩個(gè)frt之間的en2-ires-lacz-hact-neo序列將被刪除，僅保留第3外顯子兩端的loxp位點(diǎn)(見(jiàn)圖6)。此動(dòng)物模型為tmem30a條件性敲除模型，命名為tmem30atm1.1xzhu，簡(jiǎn)稱(chēng)為tmem30aloxp。tmem30aloxp/+雜合子與c7bl/6j交配，可以擴(kuò)大雜合子種群規(guī)模。tmem30aloxp/+雜合子交配，可以得到純合子tmem30aloxp/loxp。

圖7顯示了tmem30ako雜合子基因型鑒定結(jié)果，其中：(a)運(yùn)用pcr反應(yīng)對(duì)tmem30a敲除雜合子進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)第三外顯子上游的loxp位點(diǎn)做pcr鑒定，需要使用如下引物對(duì)：

tmem-loxp-f1：5’-gtcgagaagttcctattccga-3’(seqidno：5)；

tmem-loxp-r1：5’-tcttcaaatgtttgcccta-3’(seqidno：6)；

擴(kuò)增的片段220bp。

(b)運(yùn)用pcr反應(yīng)對(duì)人βactin啟動(dòng)子上游的loxp位點(diǎn)做pcr鑒定，需要使用如下引物對(duì)：

tmem-loxp-f3：5’-cactgcattctagttgtggtt-3’(seqidno：7)；

tmem-loxp-r3：5’-ggacatctcttgggcactga-3’(seqidno：8)；

擴(kuò)增的片段214bp。

(c)運(yùn)用pcr反應(yīng)對(duì)第三外顯子下游的loxp位點(diǎn)做pcr鑒定，需要使用如下引物對(duì)：

tmem-loxp-f2：5’-attccccttcaagatagctac-3’(seqidno：9)；

tmem-loxp-r2：5’-aatgatcaactgtaattcccc-3’(seqidno：10)；

突變子擴(kuò)增的片段為214bp(mutant)，野生型擴(kuò)增的片段為179bp(wt)。

圖8顯示了tmem30a條件性敲除鼠的pcr鑒定結(jié)果，需要使用如下引物對(duì)：

tmem-loxp-f2：5’-attccccttcaagatagctac-3’(seqidno：9)；

tmem-loxp-r2：5’-aatgatcaactgtaattcccc-3’(seqidno：10)；

通過(guò)pcr反應(yīng)對(duì)第三外顯子下游的loxp位點(diǎn)做鑒定，其中第1，4道野生型擴(kuò)增片段179bp(wt)；第2道雜合子(flox/+)擴(kuò)增片段為兩條：214bp和179bp；第2道純合子(loxp/loxp)擴(kuò)增片段為214bp。

實(shí)施例4.tmem30a胰島β細(xì)胞敲除小鼠的構(gòu)建

tmem30aloxp/loxp純合子與胰島β細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)基因cre(b6.cg-tg(ins2-cre)25mgn/j，簡(jiǎn)稱(chēng)為ins2-cre)小鼠交配，可以得到tmem30aloxp/+,ins2-cre雜合子，將其再與tmem30aloxp/loxp純合子交配，即可得到胰島β細(xì)胞特異敲除的tmem30aloxp/loxp,ins2-cre小鼠，簡(jiǎn)稱(chēng)ins2-tmema30ako小鼠。

使用引物對(duì)tmem-loxp-f2和tmem-loxp-r2，通過(guò)pcr反應(yīng)對(duì)第三外顯子下游的loxp位點(diǎn)做pcr鑒定。如圖9所示，野生型擴(kuò)增的片段為179bp(wt)；純合子(loxp/loxp)擴(kuò)增片段為214bp；雜合子(loxp/+)擴(kuò)增片段為兩個(gè)：214bp和179bp。

另外，對(duì)ins2-cre轉(zhuǎn)基因進(jìn)行基因型鑒定，所使用的引物對(duì)是：

cre-f：5’-atttgcctgcattaccggtc-3’(seqidno：11)；

cre-r：5’-atcaacgttttcttttcgg-3’(seqidno：12)。

如圖9所示，ins2-cre轉(zhuǎn)基因擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物片段為350bp，野生型無(wú)擴(kuò)增片段。

實(shí)施例5.tmem30a胰島β細(xì)胞敲除小鼠(ins2-tmema30ako)體重異常，血糖代謝異常

與對(duì)照組(以wt表示,tmem30aloxp/loxp基因型)比較，tmem30a胰島β細(xì)胞敲除小鼠敲除動(dòng)物(以mut表示，tmem30aloxp/loxp,ins2-cre基因型)純合子動(dòng)物在3個(gè)月開(kāi)始體重增加，7個(gè)月體重平均51克，比對(duì)照增加40％(圖10)。葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(glucosetolerancetest,gtt)證明，mut動(dòng)物對(duì)葡萄糖不耐受，在注射葡萄糖后血糖迅速升高到33mmol/l，靜脈血糖明顯比對(duì)照組高(圖11)。胰島素耐受實(shí)驗(yàn)(insulintolerancetest,itt)證明，mut動(dòng)物對(duì)對(duì)胰島素不敏感，在注射胰島素后血糖未能如對(duì)照組迅速降低，靜脈血糖明顯比對(duì)照組高(圖12)。

實(shí)施例6.tmem30a胰島β細(xì)胞敲除小鼠肝臟脂肪堆積，結(jié)構(gòu)異常

我們對(duì)9個(gè)月的野生型和tmem30a胰島β細(xì)胞敲除小鼠的肝臟固定切片后h&e染色觀察。

肝臟固定并石蠟切片后he和masson染色，具體步驟如下：

1.組織經(jīng)固定、脫水、浸蠟和包埋后切片；

2.然后再經(jīng)脫蠟和補(bǔ)水后蘇木素溶液或馬蘇染液染色約5-15min；

3.蒸餾水洗去多余染料；

4.加入稀釋的鹽酸酒精溶液中分色，邊分色邊鏡檢，至核呈紅紫色，細(xì)胞質(zhì)無(wú)色；

5.分色后用自來(lái)水堿化返蘭；

6.再經(jīng)伊紅染液染色，以95％酒精對(duì)伊紅分色，至胞漿，結(jié)締組織等呈桃紅色；

7.染色后的切片，浸入從70％到100％遞升的乙醇溶液脫水；

8.浸入二甲苯透明劑，二次(各數(shù)分鐘)，取出切片滴中性樹(shù)膠后加蓋玻片封固。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，tmem30a胰島β細(xì)胞敲除小鼠的肝臟脂肪積累，含有大量油滴顆粒(圖13)。

上文所列出的一系列的詳細(xì)說(shuō)明僅僅是針對(duì)本發(fā)明的可行性實(shí)施例的具體說(shuō)明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施例或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>朱獻(xiàn)軍

<120>胰島β細(xì)胞條件性敲除tmem30a基因小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用

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