專(zhuān)利名稱(chēng)：Mitofilin基因敲除小鼠模型的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Mitofilin基因敲除小鼠模型的制備方法及用途，具體地，本發(fā)明提供了一種Mitofilin雜合子小鼠的制備方法以及Mitofilin作為潛在的心臟保護(hù)因子在制備藥物中的用途。
背景技術(shù)：
1.線粒體損傷與心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞在自身基因調(diào)控下進(jìn)行的一種主動(dòng)死亡， 具有獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)特征，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，凋亡小體出現(xiàn)，梯形脫氧核糖核酸(DNA)電泳圖譜形成。研究證實(shí)，心肌細(xì)胞凋亡與原發(fā)性高血壓、心肌缺血再灌注損傷、血管成形術(shù)后再狹窄、心律失常、心肌病和心肌炎、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、 動(dòng)脈瘤等多種心血管疾病有關(guān)。線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器，它具有復(fù)雜的亞微結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，通過(guò)氧化磷酸化為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量。生物體內(nèi)90%以上的ATP是由線粒體產(chǎn)生，因此線粒體被稱(chēng)為細(xì)胞器的“動(dòng)力工廠”。線粒體被兩層膜包繞，外膜通透性較高；內(nèi)膜有更嚴(yán)格的選擇性，它對(duì)離子、小分子物質(zhì)的通透性，在線粒體的結(jié)構(gòu)與功能的維持中非常重要，它有利于維持內(nèi)膜兩側(cè)的電勢(shì)差，并在一定條件下形成跨膜質(zhì)子梯度，后者是氧化磷酸化的必要中間過(guò)程。線粒體占心肌細(xì)胞體積的45%，許多研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的改變。如Siarow等在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在梗死心肌周?chē)?，而離梗死心肌越近，線粒體損傷程度越重、數(shù)量越多。過(guò)氧化氫(H2O2)能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，Chen等在觀察H2A對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中加入H2O2后，首先出現(xiàn)線粒體呼吸功能減弱，繼而出現(xiàn)一系列細(xì)胞凋亡的特征DN的降解，寡聚DNA梯形圖譜的形成。Cook等對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)加入H2O2后15 30min內(nèi)，細(xì)胞色素C即從線粒體釋放于胞漿中，15 30min后線粒體跨膜電位降低，這個(gè)過(guò)程約持續(xù) lh，此后線粒體跨膜電位發(fā)生不可逆性喪失，繼而出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡與壞死。這均顯示，線粒體在心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。Okamura等對(duì)線粒體與心肌細(xì)胞凋亡及心肌壞死關(guān)系方面進(jìn)行了研究。他結(jié)扎大鼠的前降支30min后再灌注模型，然后分成三組，分別加入YVAD (Caspase 1抑制劑)、 DEVD (Caspase 3抑制劑)及對(duì)照組，研究發(fā)現(xiàn)，YVAD及DEVD均顯著減少心肌細(xì)胞凋亡，然而三組壞死心肌面積無(wú)差別。進(jìn)一步研究顯示，Caspase抑制劑、線粒體保護(hù)劑、自由基清除劑及一些藥物均可減少心肌細(xì)胞凋亡，然而它們?cè)诳s小心肌壞死面積方面存有較大差異。 ^oita等認(rèn)為，心肌細(xì)胞缺血時(shí)，一些促凋亡及促壞死信號(hào)均作用于線粒體這一共同通路而發(fā)揮作用。作用于線粒體后途徑，僅能抑制心肌細(xì)胞凋亡，不能抑制心肌細(xì)胞壞死途徑。這些研究表明，只有作用于線粒體前及線粒體水平的措施才能有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，縮小壞死心肌面積。明確這一機(jī)制對(duì)指導(dǎo)臨床用藥也有重要意義，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACE I)能有效減少心肌梗死后壞死心肌面積，改善心衰癥狀?，F(xiàn)在的研究表明， ACE I類(lèi)藥物能夠促使心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)數(shù)量增多、功能改善，細(xì)胞凋亡減少，說(shuō)明ACE I類(lèi)藥物可能通過(guò)線粒體水平而發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞凋亡及壞死等積極作用?？傊?，線粒體在心肌細(xì)胞凋亡中起中心作用，決定心肌細(xì)胞走向凋亡還是壞死。線粒體在凋亡凋節(jié)中也十分重要，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)通過(guò)線粒體起到調(diào)節(jié)作用。明確線粒體在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，對(duì)于我們進(jìn)一步探討心臟疾病的發(fā)生及防治均有重要意義。2線粒體內(nèi)膜蛋白一 Mitofilin1994年，Icho T等從人心肌組織中得到一高表達(dá)蛋白，經(jīng)序列分析，他們預(yù)測(cè)在其 N端有一 GIPase功能域，這也揭示該蛋白可能是一動(dòng)力蛋白。由于其在心肌里含量非常豐富，Icho T 稱(chēng)之為人心肌蛋白(Human Heart Mucle Protein, HMP)。1996 年，Odgren PR 利用免疫雜交和cDNA文庫(kù)的篩選，得到HMP蛋白，但他們通過(guò)免疫電鏡發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于線粒體內(nèi)膜，于是又重新命名為Mitofilin。2005年，John等人用RNA干擾的方法降低 Mitofilin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖減慢并且凋亡增加。通過(guò)對(duì)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴結(jié)構(gòu)異常，呈現(xiàn)同心圓結(jié)構(gòu)，不能形成正常的管狀或片層嵴，同時(shí)伴隨著線粒體功能異常，包括ROS生成增加以及Δ Ψπι升高，認(rèn)為Mitofilin是控制線粒體嵴結(jié)構(gòu)蛋白。此外，該研究還利用Mitofilin-GFP融合蛋白將Mitofilin準(zhǔn)確定位，確認(rèn)其在線粒體內(nèi)膜上，并預(yù)測(cè)其前78個(gè)氨基酸是一個(gè)膜錨定結(jié)構(gòu)域。Mitofilin在人類(lèi)染色體上定位于2號(hào)染色體，由15個(gè)外顯子組成，其轉(zhuǎn)錄本大小為2. 91Λ，編碼的蛋白大小為88kD，各組織內(nèi)普遍都有表達(dá)。在需能高富含線粒體的組織，如心臟、腦、腎、肝臟、骨骼肌中表達(dá)尤為豐富。經(jīng)序列分析，Mitofilin在真核生物中高度保守，其N(xiāo)端的78個(gè)氨基酸殘基為膜錨定區(qū)域，在接近C-端的區(qū)域，Mitofilin有一 Coil-Coil結(jié)構(gòu)域，但并未有明顯的功能域。在體內(nèi)，Mitofilin的Coil-Coil結(jié)構(gòu)域可能促使其形成一個(gè)約1200kD的復(fù)合物。2007年，Xie等通過(guò)免疫純化的方法，分析得到Mitofilin與SAM50、metaxinsl/2 和DnaJCll等6個(gè)線粒體蛋白可能存在相互作用。其中SAM50是線粒體上具有識(shí)別線粒體蛋白定位信號(hào)，并形成孔道，轉(zhuǎn)運(yùn)線粒體蛋白入線粒體的蛋白，其余5個(gè)蛋白的功能還尚未明確。2008年，Lai等發(fā)現(xiàn)在大鼠腦創(chuàng)傷組織中，PARP活性升高，并會(huì)將一些線粒體蛋白快速多腺苷化，而Mitofilin就是其中之一，研究者推測(cè)這種修飾可能和線粒體功能異常相關(guān)。但這些研究對(duì)Mitofilin的功能并未有明確闡述?？偟膩?lái)說(shuō)，Mitofilin的確切功能還不甚明了，對(duì)其的研究尚處于初步階段。有必要通過(guò)建立完善的動(dòng)物和細(xì)胞模型對(duì)其功能進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種Mitofilin基因敲除非人哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供Mitof i 1 in在制備用于心臟保護(hù)的藥物中的新用途在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生Mitofilin基因敲除非人哺乳動(dòng)物的方法， 包括以下步驟a)復(fù)蘇并培養(yǎng)誘捕缺失Mitofilin基因的胚胎干細(xì)胞，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞后顯微注射到代孕動(dòng)物的囊胚中。b)將步驟a)得到的囊胚移到代孕動(dòng)物的子宮角，娩出小動(dòng)物后，得到整合 Mitofilin突變細(xì)胞的嵌合體動(dòng)物。c)整合到生殖系的動(dòng)物與野生型動(dòng)物交配后，得到的動(dòng)物通過(guò)使用PCR和 Southern Blot篩選得到Mitofilin雜合子個(gè)體。Mitofilin雜合子間交配得到純合子個(gè)體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種Mitofilin基因敲除非人哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠。本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，Mitofilin敲除小鼠純合子死于胚胎期7. 5-9. 5天。在一個(gè)特別的方面，本發(fā)明提供了 Mitofilin敲除雜合子小鼠。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途，其特征在于，用于制備維持線粒體氧化磷酸化復(fù)合物活性的藥物。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途，其特征在于，用于制備維持線粒體ATP合成水平的藥物。在另外一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途，其特征在于，用于制備維持體內(nèi)ROS水平的藥物。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了 Mitofilin在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途，其特征在于，用于制備維持心肌線粒體結(jié)構(gòu)的藥物。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種Mitofilin基因敲除非人哺乳動(dòng)物及其產(chǎn)生方法。并且， 由此本發(fā)明人揭示了 Mitofilin作為潛在的心臟保護(hù)因子在制備用于心臟保護(hù)藥物中的新用途。


圖l.Mitofilin雜合子小鼠的基因型分析。A.誘捕載體插入后的Immt基因座；B. Southern blot檢測(cè)Mitofilin雜合子小鼠；C. Western blot檢測(cè)心臟中的Mitofilin的表達(dá)水平。圖2. Mitofilin純合子胚胎的基因型及形態(tài)學(xué)觀察。A.打靶后Immt基因融合片段及野生型Immt基因的轉(zhuǎn)錄本；B. 7. 5天到9. 5天胚胎的形態(tài)學(xué)觀察；C. PCR對(duì)野生型、Mitofilin雜合子和Mitofilin純合子胚胎的檢測(cè)；D.野生型、Mitofilin雜合子和Mitofilin純合子胚胎中的immt基因和Lac Z基因的RT-PCR結(jié)果。 圖3.9. 5天胚胎的TUNEL染色結(jié)果。圖4.電鏡觀察野生型、Mitofilin雜合子和Mitofilin純合子胚胎的線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察。圖5.組織化學(xué)酶學(xué)對(duì)Mitofilin純合子胚胎復(fù)合物II和復(fù)合物IV的檢測(cè)。圖6.組織化學(xué)酶學(xué)對(duì)Mitofilin雜合子小鼠心臟復(fù)合物I、復(fù)合物II和復(fù)合物 IV的檢測(cè)。圖7.線粒體氧化磷酸化復(fù)合物活性的體外檢測(cè)。圖8.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mtDNA編碼的復(fù)合物。
A.復(fù)合物I亞基的表達(dá)水平的檢測(cè)；B.復(fù)合物III和復(fù)合物IV亞基表達(dá)水平的檢測(cè)。圖9. Mitofilin雜合子小鼠心臟的ATP水平的檢測(cè)。*p < 0. 05n = 10圖10. DHE染色對(duì)野生型和Mitofilin雜合子小鼠心臟組織ROS水平的檢測(cè)。圖11.野生型和Mitofilin雜合子小鼠心肌的病理檢測(cè)。A.野生型和Mitofilin雜合子小鼠的心肌的形態(tài)觀測(cè)；B. HE染色對(duì)野生型和 Mitofilin雜合子小鼠的心肌組織的檢測(cè)；C. Masson染色對(duì)野生型和Mitofilin雜合子小鼠的心肌組織的檢測(cè)。圖12. 16周的野生型和Mitofilin雜合子的心臟固定切片后電鏡觀察。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1. Miotifilin敲除鼠的建立本發(fā)明將Mitofilin突變的ES細(xì)胞系(英國(guó)Sanger研究所贈(zèng)送)通過(guò)囊胚注射的方法注入到C57BL/6J小鼠囊胚中，移植胚胎到假孕鼠子宮，得到了 Mitofilin突變細(xì)胞整合到生殖系的嵌合體小鼠。該嵌合體與野生型小鼠交配后得到Mitofilin雜合子小鼠。 具體操作步驟如下a)分離培養(yǎng)小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素C處理后用于培養(yǎng)ES細(xì)胞的滋養(yǎng)層；b)復(fù)蘇ES細(xì)胞于鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿培養(yǎng)后，注入到代孕小鼠的囊胚中；c)將注射過(guò)的囊胚置于加了 Brinster’ s BM0C-3培養(yǎng)液滴里培養(yǎng)，做好標(biāo)記，以備移植；d)將步驟(c)的囊胚移到假孕的代孕動(dòng)物體內(nèi)，得到整合Mitofilin突變細(xì)胞的嵌合體小鼠。整合到生殖系的小鼠與野生型小鼠交配后，得到的小鼠通過(guò)使用PCR和 Southern Blot篩選得到Mitofilin雜合子小鼠。實(shí)施例2. Mitofilin敲除小鼠純合子死于胚胎期7. 5-9. 5天本發(fā)明選用了 C57BL/6/12901a雜合背景和12901a背景的小鼠作為實(shí)驗(yàn)用小鼠。 這兩種背景的Mitofilin雜合子小鼠均可正常出生，且符合孟德?tīng)栆?guī)律。Mitofilin雜合子小鼠和野生型小鼠相比，無(wú)明顯差異。Western Blot檢測(cè)Mitofilin雜合子小鼠的 Mitofilin的表達(dá)水平較野生型低，這和單倍體效率不足相符。我們對(duì)Mitofilin雜合子小鼠間交配產(chǎn)生的后代進(jìn)行PCR、Souther Blot和flfestern Blot等方法進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。 在兩種背景的小鼠中，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有存活的Mitofilin純合子小鼠出生。接著我們對(duì)其后代進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，野生型和雜合子所占的比例分別是1/3和2/3(表1)。這符合純合子胚胎致死后的孟德?tīng)栆?guī)律。表1.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Mitofilin雜合子小鼠間交配的后代
時(shí)期-I-+/-+/+合計(jì)新生N/A234112346E12.5N/A231033E10.5N/A432063
為了確定Mitofilin純合子小鼠胚胎死亡的確切時(shí)間，我們分離了 6. 5-12. 5天的胚胎。結(jié)合RT-PCR和PCR等基因型檢測(cè)手段，以及通過(guò)胚胎形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，12. 5天的胚胎中沒(méi)有Mitofilin純合子胚胎的存在(表1)；在7. 5和9. 5天的胚胎中，Mitofilin純合子純合子發(fā)育遲緩，個(gè)體比野生型和雜合子小鼠小。且隨著天數(shù)的增加個(gè)體差異更加明顯。我們對(duì)9. 5天的胚胎切片后進(jìn)行TUNEL實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Mitofilin純合子胚胎胚體細(xì)胞大量死亡。9. 5天后，Mitofilin純合子胚胎死亡并逐漸被母體子宮吸收，具體結(jié)果如圖2和圖3所示。TUNEL的具體操作步驟如下1.石蠟切片脫蠟、補(bǔ)水固定后，蛋白酶K消化，每張切片上滴加IOOul蛋白酶K溶液(20ug/ul)，室溫消化10分鐘。2. PBS清洗5分鐘，4%多聚甲醛再固定5分鐘，而后用PBS室溫清洗5分鐘。3.擦凈載玻片上多余的水分，在切片處滴加反應(yīng)平衡液(Promega試劑盒提供)平衡后按配好的反應(yīng)體系避光37°C濕盒內(nèi)反應(yīng)1小時(shí)。4.反應(yīng)結(jié)束后，用2X SSC溶液終止反應(yīng)，用Hoechst染色5分鐘后封片。4°C避光保存以待觀察。5.熒光顯微鏡下以488nm的藍(lán)色激光激發(fā)，可見(jiàn)FITC標(biāo)記的細(xì)胞核為凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核，而紫外光激光看到的則是Hoechst染色的細(xì)胞核。實(shí)施例3. Mitofilin純合子胚胎線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變?nèi)?. 5天的Mitofilin雜合子小鼠交配的后代胚胎進(jìn)行切片，通過(guò)透射電鏡觀察它們的線粒體超微結(jié)構(gòu)。具體步驟如下1.取Mitofilinv-小鼠交配后的8. 5天胚胎，迅速放到預(yù)冷的2. 5%的新鮮配制的戊二醛溶液中(0. IM PBS pH 7. 4)，在4°C條件下固定2小時(shí)后，磷酸緩沖液清洗3遍。2.用的鋨酸固定液固定1 2小時(shí)后，將樣品進(jìn)行脫水、置換和浸透處理，然后將其包埋。3.將包埋板放入溫箱，于37°C、45°C、60°C分別放置M小時(shí)。4.修塊將包埋塊夾在特制的夾持器上，放在解剖顯微鏡下，用鋒利的刀片先削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成錐體形。5.將包好的組織塊制成500 μ m的半薄切片，甲苯胺蘭染色，光學(xué)顯微鏡下定位。 在超薄切片機(jī)上，將定位好的組織塊，制成60-70nm的超薄切片。粘在300目的銅網(wǎng)上。6.電子染色用鑷子夾住載網(wǎng)的邊緣，把貼有切片的一面朝下放到醋酸雙氧鈾-枸緣酸鉛染色液，使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿，染色10 20分鐘。7.透射電鏡觀察、拍片、記錄JEOL TEM-1010電子顯微鏡觀察，做好觀察記錄，選好范圍拍片，準(zhǔn)確記錄底片號(hào)碼及相應(yīng)內(nèi)容。電鏡結(jié)果表明(圖4)野生型和Mitofilin雜合子胚胎的線粒體大小均勻、結(jié)構(gòu)正常、內(nèi)外膜正常分布以及內(nèi)膜內(nèi)陷形成的特化結(jié)構(gòu)嵴有規(guī)則的排布。而Mitofilin純合子胚胎線粒體大小不一，雖然有外膜存在，但內(nèi)膜和嵴的排布紊亂；部分線粒體膨大，內(nèi)膜和嵴結(jié)構(gòu)消失，電子密度降低。實(shí)施例4. Mitofilin純合子胚胎氧化磷酸化呼吸鏈功能失常Mitofilin純合子胚胎的線粒體結(jié)構(gòu)明顯改變，尤其是內(nèi)膜和嵴的形態(tài)明顯異常；由于負(fù)責(zé)氧化磷酸化的復(fù)合物附著于內(nèi)膜上，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)引發(fā)氧化磷酸化復(fù)合物的功能的改變。因此，我們?nèi)?. 5天的胚胎進(jìn)行冰凍切片后，進(jìn)行組織酶學(xué)染色來(lái)鑒定復(fù)合物酶的活性。以四唑氮藍(lán)(NBT)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為酶的底物。通過(guò)NBT和DAB 在組織上反應(yīng)后顏色的深淺反映復(fù)合物的酶活性。經(jīng)鑒定，我們發(fā)現(xiàn)線粒體復(fù)合物IV細(xì)胞色素氧化酶(COX)的活性明顯下降，而復(fù)合物II琥珀酸脫氫酶(SDH)活性沒(méi)有明顯改變，復(fù)合物I NADH氧化脫氫酶有一定程度的下降。這是由于該酶在胞漿中也存在，不能真實(shí)反映線粒體內(nèi)的NADH氧化脫氫酶活性。具體結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例5. Mitofilin雜合子小鼠氧化磷酸化復(fù)合物活性較野生型降低Mitofilin雜合子小鼠可正常出生，跟野生型相比無(wú)明顯差異。我們經(jīng)過(guò)行為學(xué)、 體重及飲食等多方面對(duì)新生的Mitofilin雜合子小鼠進(jìn)行鑒定，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Mitofilin雜合子小鼠存在明顯的功能異常(結(jié)果未出示)。但Mitofilin雜合子小鼠存在單倍體效率不足，該蛋白在組織中的表達(dá)水平較野生型低(圖1C)。由于Mitofilin的表達(dá)降低，線粒體的基本功能可能在Mitofilin雜合子小鼠中會(huì)有一定的改變。因此，我們對(duì)6-8周的 Mitofilin雜合子小鼠的線粒體的氧化磷酸化水平進(jìn)行了測(cè)定。取Mitofilin雜合子小鼠的心臟進(jìn)行冰凍切片并進(jìn)行酶組織染色，結(jié)果表明Mitofilin雜合子小鼠的線粒體復(fù)合物 IV的活性與野生型小鼠相比明顯降低，而復(fù)合物II的活性沒(méi)有變化(圖6)；接著我們提取了小鼠肝臟組織的線粒體，進(jìn)行體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示復(fù)合物IV的活性明顯下降，而復(fù)合物II的活性沒(méi)有改變，這與組織酶學(xué)的結(jié)果一致。此外，在體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)復(fù)合物I和復(fù)合物I/III的活性也有一定的下降(圖7)。在線粒體復(fù)合物中，復(fù)合物I、III和IV都有必需亞基由線粒體DNA編碼并翻譯。 而復(fù)合物II的亞基則全部由核基因組DNA編碼。為此，我們推測(cè)Mitofilin的缺失可能影響了線粒體DNA(mtDNA)的拷貝數(shù)或轉(zhuǎn)錄，而使mtDNA編碼的復(fù)合物亞基的表達(dá)水平降低， 進(jìn)而影響了復(fù)合物的正常組裝，最終使得氧化磷酸化水平降低甚至缺失。為此，提取了 Mitofilin雜合子小鼠心臟和肝臟組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real time PCR0具體步驟如下分離Mitofilin雜合子小鼠的心臟，加入Iml Trizal后勻漿破碎組織后，加入氯仿。劇烈搖動(dòng)后12000轉(zhuǎn)離心15分鐘。將分層后的水相吸入一新的離心管中，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，12000轉(zhuǎn)10分鐘。棄上清，加入75%乙醇，7500轉(zhuǎn)離心，棄上清后晾干沉淀。加入適當(dāng)?shù)乃芙夂?，測(cè)定RNA的濃度，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的產(chǎn)物為模板，選用線粒體復(fù)合物亞基的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合物I、IV的亞基表達(dá)降低，說(shuō)明Mitofilin的缺失確實(shí)導(dǎo)致了 mtDNA 的表達(dá)降低；而復(fù)合物III的亞基cyto b的表達(dá)基本沒(méi)有變化(肝臟結(jié)果未出示)，這可能是由于線粒體啟動(dòng)子近端效應(yīng)所致。線粒體DNA的近端效應(yīng)表現(xiàn)為在線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，距其越近的轉(zhuǎn)錄本，表達(dá)隨著啟動(dòng)子活性的改變而明顯改變；距啟動(dòng)子越遠(yuǎn)，改變?cè)叫?。因此，Mitofilin雜合子小鼠中距啟動(dòng)子較近的復(fù)合物I和復(fù)合物IV的亞基所受到的影響較大，降低明顯；而Cyto b是其重鏈轉(zhuǎn)錄本上的最后一個(gè)編碼基因，受啟動(dòng)子活性的影響最小，幾乎沒(méi)有改變。結(jié)果如圖8所示。實(shí)施例6. Mitofilin雜合子小鼠ATP供給較野生型減少線粒體最重要的功能就是產(chǎn)能以供給機(jī)體需求，故ATP的水平是線粒體功能的基本衡量標(biāo)準(zhǔn)。ATP生成的水平和細(xì)胞代謝狀態(tài)直接相關(guān)，線粒體功能失?；蜓趸姿峄钚越档投伎墒笰TP合成減少。在Mitofilin雜合子小鼠的線粒體中，氧化磷酸化復(fù)合物活性與野生型相比有一定降低，因此我們通過(guò)高壓液相(HPLC)法對(duì)Mitofilin雜合子小鼠ATP 的合成效率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果(圖9)顯示，Mitofilin雜合子小鼠的心臟和腦組織的ATP供給較野生型減少。實(shí)施例7. Mitofilin雜合子小鼠體內(nèi)ROS水平增加Mitofilin雜合子小鼠的線粒體氧化磷酸化水平較野生型降低，而在氧化磷酸化過(guò)程中，ROS是其副產(chǎn)物。一般情況下，當(dāng)氧化磷酸化出現(xiàn)異常時(shí)，ROS在體內(nèi)的平衡狀態(tài)破壞，使其在體內(nèi)積累。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們通過(guò)ROS原始物02_ ·的特異性探針DHE標(biāo)記， 以檢測(cè)Mitofilin雜合子小鼠小鼠體內(nèi)的ROS水平。具體步驟如下斷頸處死小鼠并分離其心臟組織進(jìn)行冰凍切片。用ROS特異性探針DHE溶液覆蓋心臟切片，室溫孵育10分鐘。用PBS清洗3遍后于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果(圖10)顯示，Mitofilin雜合子小鼠的心臟的ROS水平較野生型升高。實(shí)施例8. Mitofilin雜合子小鼠的心臟呈現(xiàn)病理性變化ROS在細(xì)胞中的異常累積以及線粒體氧化磷酸化功能的降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生病理性變化而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鑒于此，我們對(duì)16周的野生型和Mitofilin雜合子小鼠的心臟進(jìn)行檢測(cè)。我們對(duì)它們的心臟進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，雜合子心臟較野生型的體積明顯增加，對(duì)這些心臟固定并石蠟切片后HE和Masson染色，具體步驟如下1.組織經(jīng)固定、脫水、浸蠟和包埋后切片。
2.然后再經(jīng)脫蠟和補(bǔ)水后蘇木素溶液或馬蘇染液染色約5 15min。
3.自來(lái)水洗去多余染料。
4.加入稀釋的鹽酸酒精溶液中分色，邊分色邊鏡檢，至核呈紅紫色，細(xì)胞質(zhì)無(wú)色。
5.分色后用自來(lái)水堿化返蘭。
6.再經(jīng)伊紅染液染色，以95%酒精對(duì)伊紅分色，至胞漿，結(jié)締組織等呈桃紅色。
7.染色后的切片，浸入從70 %到100 %遞升的乙醇溶液脫水。
8.浸入二甲苯透明劑，二次(各數(shù)分鐘)，取出切片滴中性樹(shù)膠后加蓋玻片封固。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mitofilin雜合子心臟的心肌排列松散，并有很多細(xì)胞壞死，而野生型
的心臟心肌細(xì)胞排列緊密有序，并呈現(xiàn)正常的生理狀態(tài)。實(shí)施例9. Mitofilin雜合子小鼠心肌的線粒體超微結(jié)構(gòu)異常改變接著我們對(duì)16周的野生型和Mitofilin雜合子的心臟固定切片后電鏡觀察。電鏡結(jié)果表明(圖12)野生型的心肌線粒體大小均勻、結(jié)構(gòu)正常、內(nèi)外膜正常分布以及內(nèi)膜內(nèi)陷形成的特化結(jié)構(gòu)嵴有規(guī)則的排布。而Mitofilin雜合子小鼠的心肌體大小不一，雖然有外膜存在，但內(nèi)膜和嵴的排布紊亂；部分線粒體膨大，內(nèi)膜和嵴結(jié)構(gòu)消失，電子密度降低。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生Mitofilin基因敲除非人哺乳動(dòng)物的方法，包括以下步驟a)復(fù)蘇并培養(yǎng)誘捕缺失Mitofilin基因的胚胎干細(xì)胞，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞后顯微注射到代孕動(dòng)物的囊胚中；b)將步驟a)得到的囊胚移到代孕動(dòng)物的子宮角，娩出小動(dòng)物后，得到整合Mitofilin 突變細(xì)胞的嵌合體動(dòng)物；c)整合到生殖系的動(dòng)物與野生型動(dòng)物交配后，得到的動(dòng)物通過(guò)使用PCR和Southern Blot篩選得到Mitofilin雜合子個(gè)體；Mitofilin雜合子間交配得到純合子個(gè)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)生Mitofilin基因敲除非人哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)生Mitofilin基因敲除非人哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的小鼠為Mitofilin雜合子小鼠。
4.Mitofi 1 in在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Mitofilin在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途，其特征在于， 用于制備維持線粒體氧化磷酸化復(fù)合物活性的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Mitofilin在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途，其特征在于， 用于制備維持線粒體ATP合成水平的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Mitofilin在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途，其特征在于， 用于制備維持體內(nèi)ROS水平的藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Mitofilin在制備用于心臟保護(hù)藥物中的用途，其特征在于， 用于制備維持心肌線粒體結(jié)構(gòu)的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及Mitofilin基因敲除小鼠模型的制備方法及用途，具體地，本發(fā)明提供了一種Mitofilin雜合子小鼠的制備方法以及Mitofilin作為潛在的心臟保護(hù)因子在制備藥物中的用途。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102199572SQ20101013297
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者劉德培, 孫立紅, 張媛, 楊瑞鋒, 梁植權(quán), 陳厚早, 韋玉生 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所