專利名稱：一種激酶蛋白Akt1基因條件性敲除小鼠的建立及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物模型的建立和用途。
背景技術(shù)：
Akt/蛋白激酶B (PKB)屬于AGC激酶家族(包括PKA，PKG以及H(C)中的一個(gè)亞家族-Akt/PKB家族。在哺乳類生物如小鼠，大鼠和人，Akt/PKB家族包含三個(gè)成員分別稱為Aktl/PKB α，Akt2/PKB β和Akt3/PKB γ (以下通用Akt)。Akt在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞生存和凋亡中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、胚胎發(fā)育等過程均密切相關(guān)。在人和小鼠中，這三個(gè)成員由位于不同染色體上的三個(gè)基因所編碼。Akt的三個(gè)蛋白在氨基酸組成上有很高的同源性，達(dá)80%以上。在氨基酸數(shù)量組成上，它們只相差一到兩個(gè)氨基酸，Aktl有480個(gè)氨基酸，Akt2有481個(gè)氨基酸，而Akt3有479個(gè)氨基酸。它們都有三個(gè)功能區(qū)域，分別是氨基端PH區(qū)域，中間激酶催化區(qū)域和羧基端調(diào)控區(qū)域。它們的激酶催化區(qū)域在氨基酸組成上幾乎是一樣的。由于雙基因敲除小鼠(Aktl/3)死于胚胎發(fā)育第12天，所以我們將無法研究晚期胚胎(12天之后)重要器官的發(fā)育及糖代謝的調(diào)控。因此，我們制作了 Aktl基因條件性基因敲除小鼠，通過不同Cre重組酶介導(dǎo)的方法在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期及成年期敲除所有三個(gè)Akt基因，研究它們對小鼠胚胎發(fā)育及糖代謝的調(diào)控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物模型。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物模型的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種產(chǎn)生激酶蛋白Aktl基因條件性敲除非人哺乳動物模型的方法，它包括步驟a)提供一種線性化的基因打靶載體構(gòu)建物，該構(gòu)建物從5’到3’依次含有Aktl打靶左臂、正選擇基因、自殺負(fù)篩選基因、Akt 1打靶右臂；b)通過體外轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、篩選與打靶載體發(fā)生同源重組的陽性ES 細(xì)胞克隆，經(jīng)顯微注射技術(shù)導(dǎo)入非人哺乳動物囊胚中；C)將步驟b得到的囊胚植入假孕的非人哺乳動物的子宮；d)產(chǎn)生激酶蛋白Aktl基因條件性敲除非人哺乳動物模型。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟e)對步驟d獲得的Aktl基因條件性敲除動物進(jìn)行鑒定。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟f)使獲得的激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物進(jìn)行交配建系，獲得子代。在另一優(yōu)選例中，所述的正選擇基因是Neo、hph、或gpt。
在另一優(yōu)選例中，所述的自殺負(fù)篩選基因是HSV-tk、胞嘧啶脫氨酶基因、或 VIV-tko在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動物模型是小鼠、大鼠、兔或猴。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物基因敲除外顯子。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物不含啟動子。在另一優(yōu)選例中，所產(chǎn)生的激酶蛋白Aktl編碼第58位至480位氨基酸缺失的非人哺乳動物在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用上述方法產(chǎn)生的激酶蛋白Aktl基因條件性敲除非人哺乳動物模型。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用上述方法產(chǎn)生的激酶蛋白Aktl基因條件性敲除非人哺乳動物模型的用途，所述的動物模型可用于篩選預(yù)防或者治療心臟和糖代謝紊舌L。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種激酶蛋白Aktl基因條件性敲除小鼠的用途，它可用于篩選治療心臟肥大和糖代謝紊亂的藥物。在另一優(yōu)選例中，可以將激酶蛋白Aktl及其所在的上、下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為治療心臟肥大和糖代謝紊亂的藥物干預(yù)靶點(diǎn)。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種激酶蛋白Aktl基因條件性敲除模型，有效地揭示了其在高等哺乳動物中的生物學(xué)功能，并由此提供了激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物模型及其用途。


圖1是激酶蛋白Aktl打靶載體構(gòu)建策略示意圖。圖2顯示了激酶蛋Aktl基因條件性敲除ES細(xì)胞基因型Southern blot (DNA印記雜交)鑒定；其中B5、B10、D6、F2、F6、F10為雜合子基因型，表示該ES細(xì)胞為基因敲除雜合子。圖3通過Mespl-cre介導(dǎo)的心臟特異性敲除小鼠的敲除效率的flfestern blot (蛋白免疫印記)鑒定。
圖4 Aktl和Akt2基因聯(lián)合敲除小鼠的心臟切片蘇木素-伊紅染色照片。 具體實(shí)施方案發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，建立了激酶蛋白Aktl基因條件性敲除小鼠模型， 并通過Southern blot (DNA印記雜交)和^festern blot (蛋白免疫印記)進(jìn)行了鑒定。激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物模型的建立本發(fā)明通過本領(lǐng)域成熟的基因打靶技術(shù)建立了激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物模型，可用于本發(fā)明的負(fù)篩選自殺基因沒有特別的限制，可以選用本領(lǐng)域常規(guī)使用的各種自殺基因。代表性的例子包括(但并不限于)hsv-tk、胞嘧啶脫氨酶(⑶)、VIV_tk等?？捎糜诒景l(fā)明的正選擇基因沒有特別限制，可以選用本領(lǐng)域常規(guī)使用的各種正選擇基因。代表性的例子包括(但并不限于)Ne0、hph、gpt等。本發(fā)明利用FLP重組酶將正選擇基因Neo最終從基因組中去除，避免其對小鼠表型的可能影響。
激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物模型本發(fā)明所建立的激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物模型中所敲除的可以使其基因組結(jié)構(gòu)中的任一段外顯子，優(yōu)選敲除編碼激酶蛋白Aktl第58位至480位氨基酸的外顯子。本發(fā)明的激酶蛋白Aktl基因條件性敲除基因長度可以是1-201Λ，優(yōu)選3-61Λ，更優(yōu)選3-41Λ。激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物模型的用途本發(fā)明提供的激酶蛋白Aktl基因條件性敲除動物顯示了部分心臟發(fā)育缺陷。通過和Akt其他異構(gòu)體敲除小鼠進(jìn)行聯(lián)合敲除的研究，表明Akt在心臟發(fā)育中是必不可少的。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，利用該模型篩選預(yù)防或者治療心臟肥大的化合物，方法如下1)在測試組中，給激酶蛋白Aktl和Akt2聯(lián)合敲除的動物模型服用待篩選的候選物，并檢測心臟肥大情況；2)若步驟(1)測試組中心臟肥大程度的改善在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(更優(yōu)選明顯高于) 對照組(未服用候選物組)中心臟肥大程度的改善情況，就表明該候選物是可抑制心臟肥大的化合物。本發(fā)明揭示了激酶蛋白Aktl的生物學(xué)功能，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中提供了一種制備預(yù)防或者治療心臟肥大和糖代謝紊亂的藥物的方法，就是加入治療有效量的激酶蛋白Aktl及藥學(xué)上可接受的載體?？梢灾瞥筛鞣N劑型，包括(但不限于)片劑、膠囊、注射劑等。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.首次建立了激酶蛋白Aktl基因敲除動物；2.首次運(yùn)用該模型揭示了激酶蛋白Aktl基因在非人哺乳動物中的生物學(xué)功能， 可以將激酶蛋白及其上下游生物傳導(dǎo)通路作為藥物治療心臟肥大和糖代謝的作用靶點(diǎn)；3.運(yùn)用該模型有效地進(jìn)行針對性的藥物篩選。下面將結(jié)合具體是實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和分?jǐn)?shù)按重量計(jì)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1建立激酶Aktl蛋白基因條件性敲除模型1.通過構(gòu)建基因打靶載體，見圖1 ；2.將上述載體轉(zhuǎn)染胚胎肝細(xì)胞(EQ，通過Southern印記雜交篩選同源重組的ES 細(xì)胞克隆，見圖2;3.將步驟( 獲得的同源重組的ES細(xì)胞進(jìn)行囊胚注射后、植入假孕小鼠子宮，待子鼠出生后得到嵌合小鼠；
4.嵌合鼠進(jìn)一步交配后得到激酶蛋白Aktl的基因敲除小鼠。實(shí)施例2激酶蛋白Aktl基因敲除小鼠心臟肥大模型的建立實(shí)施例1獲得的Aktl基因缺陷小鼠出生時(shí)無明顯異常，Aktl和Akt2基因聯(lián)合敲除小鼠在出生后1個(gè)月時(shí)全部死亡；與野生型對照小鼠相比，Aktl和Akt2基因聯(lián)合敲除小鼠的心臟心肌壁明顯變薄，心肌結(jié)構(gòu)疏松，右心室擴(kuò)張(圖4)，提示Aktl和Akt2基因聯(lián)合敲除小鼠可以作為舒張性心臟肥大的模型。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請的權(quán)利要求范圍中，任何讓人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生激酶蛋白Aktl基因敲除非人哺乳動物模型的方法，其特征在于，它包括步驟a.提供一線性化的基因打靶載體構(gòu)建物，該構(gòu)建物從5’至3’依次含有Aktl打靶左臂、正選擇基因、自殺負(fù)篩選基因、Aktl打靶右臂；b.通過體外轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、篩選與打靶載體發(fā)生同源重組的陽性ES細(xì)胞克隆，經(jīng)顯微注射技術(shù)導(dǎo)入非人哺乳動物囊胚中；c.將囊胚植入假孕的非人哺乳動物子宮內(nèi)；d.產(chǎn)生激酶蛋白Aktl基因敲除非人哺乳動物模型。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正選擇基因是Neo、hph、或者gpt。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的自殺負(fù)篩選基因是HSV-tk、細(xì)胞嘧啶脫氨酶基因、或者Viv-tk。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人動物是小鼠、大鼠、兔或猴。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物基因剔除外顯子。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生的激酶蛋白Aktl編碼第58位至480位氨基酸缺失的非人哺乳動物。
7.一種用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的生的激酶蛋白Aktl基因敲除非人哺乳動物模型。
8.一種用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的激酶蛋白Aktl基因敲除非人哺乳動物模型的用途，其特征在于，所述的動物模型用于篩選預(yù)防或者治療心臟肥大和糖代謝紊亂的藥物。
9.一種激酶蛋白Aktl的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或者治療心臟肥大和糖代謝紊亂的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種激酶蛋白Akt1基因敲除非人哺乳動物模型的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明還公開了利用所述的激酶蛋白Akt1基因敲除非人哺乳動物模型篩選預(yù)防或者治療心臟肥大和糖代謝紊亂的化合物的方法，以及將Akt1及其所在上、下游生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為藥物干預(yù)靶點(diǎn)治療心臟肥大和糖代謝紊亂的用途。
文檔編號C12N15/09GK102477421SQ20101055681
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者盧雙雙, 常在, 楊中州 申請人:南京大學(xué)