專利名稱：絨山羊VEGF164基因cDNA核苷酸序列及其毛囊特異性表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從體外培養(yǎng)的絨山羊胎兒成纖維細胞分離的編碼VEGF164蛋白的 cDNA及其毛囊特異性表達載體，更具體地說涉及編碼VEGF164蛋白質(zhì)的cDNA的573bp的 核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列及將克隆到的VEGF164基 因與毛囊特異性的KAP6-1 基因啟動子片段以及紅色熒光蛋白表達元件連接構(gòu)成VEGF164毛囊特異性表達載體 pCDsRed-KVo
背景技術(shù)：
內(nèi)蒙古白絨山羊是經(jīng)過長期自然選育形成的優(yōu)良地方性絨肉兼用型品種，所產(chǎn)羊 絨具有徑細絨長、綜合品質(zhì)優(yōu)良的特點，但由于近年來草場退化，種群數(shù)量增加，舍飼比例 加大，導致產(chǎn)絨量降低。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導入促進毛囊發(fā)育和絨毛生長的功能基因，培育高 產(chǎn)絨量新品系是解決這一問題的有效手段。血管內(nèi)皮生長因子是一種二聚體糖蛋白，具有 促進毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長的功能?？寺?nèi)蒙古白絨山羊血管內(nèi)皮生長因子(VEGF164)基因 并構(gòu)建毛囊特異性表達載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細胞，篩選得到轉(zhuǎn)基因細胞克隆，將為通 過核移植方法獲得高產(chǎn)絨量轉(zhuǎn)基因絨山羊新品種提供條件。血管內(nèi)皮生長因子是1979年Dvorak等首先在無血清的腫瘤細胞培養(yǎng)液及動物 癌性腹水中發(fā)現(xiàn)，Senger等(1983)分析后確定是一種以二硫鍵結(jié)合的二聚體肝素親合性 糖蛋白并命名為血管滲透因子(vascular permeability factor，VPF)。Gospodarowicz 和Ferrara等(1989)從牛的垂體濾泡細胞中分離得到類似物，命名為血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial cell growth factor, VEGF)，后經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)二者是同一種細胞因 子，具有特異作用于血管內(nèi)皮細胞的特異性，在體外可誘導血管發(fā)生，并可增加血管壁的通 透性，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，促進傷口愈合及在惡性腫瘤中過表達等。近年的研 究發(fā)現(xiàn)VEGF可明顯促進毛乳頭細胞的增殖和遷移，轉(zhuǎn)VEGF基因小鼠可以促進毛發(fā)生長。進 一步的研究表明(Man等，2009) VEGF是毛乳頭細胞的一種自分泌生長因子，在人初級毛囊 中有表達，在外分泌汗腺的囊泡基底膜中的表達量也非常豐富。VEGF與動物毛囊發(fā)育和毛 發(fā)生長密切相關(guān)。迄今，關(guān)于VEGF在大鼠和小鼠中已被證實可以促進毛發(fā)的生長，但與絨山羊相關(guān) 的研究還未見報道。也未見有絨山羊VEGF基因的cDNA核苷酸序列和與它對應的氨基酸序 列的報道。在各種情況下，有重要的原因研究和開發(fā)與絨山羊VEGF蛋白相關(guān)的基因克隆及 其重組表達，因為研究清楚絨山羊的VEGF基因和蛋白的功能，可以用在通過轉(zhuǎn)基因克隆技 術(shù)培育高產(chǎn)絨量絨山羊，提高絨毛產(chǎn)量等方面，得到的絨山羊VEGF164基因的核苷酸序列 可以用于通過RT-PCR方法或雜交的方法檢測VEGF164基因在絨山羊不同組織和不同發(fā)育 階段的表達特性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過已知的不同物種的VEGF基因的核苷酸序列設計引物，然后 通過RT-PCR方法克隆絨山羊VEGF164基因的cDNA片段。對該片段測序后提供編碼絨山羊 VEGF164蛋白的基因cDNA的573bp的核苷酸序列和由此序列推斷的氨基酸序列；將克隆到 的VEGF164基因與毛囊特異性的KAP6-1基因啟動子片段以及紅色熒光蛋白表達元件連接 構(gòu)成VEGF164毛囊特異性表達載體ρ⑶sRed-KV，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細胞后獲得了 具有紅色熒光蛋白和新霉素抗性雙選擇標記的轉(zhuǎn)基因細胞克隆，可以作為轉(zhuǎn)基因體細胞核 供體用于細胞核移植，為利用克隆技術(shù)培育高產(chǎn)絨量絨山羊新品系提供了條件。本發(fā)明的基因產(chǎn)品采用以下方式表述1、絨山羊VEGF164基因cDNA片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所述。2、由權(quán)利要求1中cDNA的核苷酸序列推斷出的絨山羊VEGF164蛋白質(zhì)的氨基酸 序列如SEQ ID NO 2所述。3、構(gòu)建的絨山羊VEGF164基因毛囊特異性表達載體ρCDsRed-KV如圖9所示。本發(fā)明的基因產(chǎn)品的制備方法概述為本發(fā)明是一段從體外培養(yǎng)的絨山羊胎兒成纖維細胞分離的編碼VEGF164蛋白 的cDNA及其毛囊特異性表達載體，更具體地說是編碼VEGF164蛋白質(zhì)的cDNA核苷酸序 列和與它對應的氨基酸序列及在毛囊細胞內(nèi)特異性表達VEGF164蛋白的真核表達載體 PCDsRed-KV0本發(fā)明采用RT-PCR方法克隆基因并獲得相應的核苷酸序列，首先設計了一對 引物并應用這對引物通過RT-PCR方法擴增出了絨山羊VEGF164基因cDNA的特異性片段， 經(jīng)過測序后得到這一片段的573bp的核苷酸序列，包含編碼VEGF164蛋白的完整ORF ；將克 隆到的VEGF164基因與毛囊特異性的KAP6-1基因啟動子片段以及紅色熒光蛋白表達元件 連接構(gòu)成VEGF164毛囊特異性表達載體ρ⑶sRed-KV。其特征是在還沒有絨山羊VEGF164基 因核苷酸序列的情況下，通過比較已知的小鼠、大鼠、人、綿羊、牛和馬的VEGF基因的核苷 酸序列，找到保守區(qū)，然后根據(jù)GenBank中綿羊VEGF基因cDNA序列(EU857623. 1)設計出了 一對用于RT-PCR擴增絨山羊VEGF164基因cDNA片段的特異性引物，進而通過RT-PCR方法 擴增出了絨山羊VEGF164基因cDNA片段，測序后得到了 573bp的核苷酸序列和與它對應的 氨基酸序列；克隆到的VEGF164基因與毛囊特異性表達的KAP6-1基因啟動子連接，順序連 接紅色熒光蛋白表達元件，構(gòu)建成毛囊特異性表達VEGF164蛋白和穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白 的真核表達載體?；谏鲜稣f明，本發(fā)明的技術(shù)特征也可以表述為一種自絨山羊分離的多 核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列，是下列序列之一 1)序列表中SEQ ID NO 1的cDNA 序列；2)與序列表中SEQ ID NO 1的cDNA序列相對應的標注為SEQ ID NO 2的氨基酸序 列。3)絨山羊VEGF164基因與KAP6-1基因啟動子片段以及紅色熒光蛋白表達元件連接構(gòu) 成的毛囊特異性表達VEGF164蛋白和穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的真核表達載體ρ⑶sRed-KV。本發(fā)明具有以下突出的特點和顯著的技術(shù)進步首先，這一絨山羊VEGF164基因 cDNA片段的核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列及其毛囊特異性表達載體在國內(nèi)外是首 次獲得。其次，本發(fā)明具有很強實用價值和未來廣闊的應用前景。根據(jù)本發(fā)明利用RT-PCR 法克隆絨山羊VEGF164基因cDNA的弓|物和編碼絨山羊VEGF164蛋白質(zhì)的包括573bp的cDNA 的核苷酸序列和由它推斷的氨基酸序列。此cDNA包括的573bp的核苷酸序列，它含有編碼 含有190個氨基酸殘基的VEGF164蛋白質(zhì)的完整0RF，經(jīng)過進一步的改造后構(gòu)建了 VEGF164基因的毛囊特異性表達載體，轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細胞后獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因細胞克隆，可以作為轉(zhuǎn)基因體細胞核供體用于細胞核移植，為利用克隆技術(shù)培育高產(chǎn)絨量絨山 羊新品系提供了條件。此外，它還可以亞克隆到如PET或pcDNA3. 1等原核或真核表達載體 上進行表達。重組的cDNA片段可能會表達出完整的絨山羊VEGF164蛋白，進而可用于抗體 生產(chǎn)，檢測絨山羊各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀態(tài)下的VEGF164的表達情況等等。


從下面給出的說明結(jié)合附圖，本發(fā)明的上面目的的特征將變的明了。其中圖1顯示了綿羊VEGF基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登錄號EU857623. 1)。圖2顯示了絨山羊VEGF164基因573bp的cDNA的核苷酸序列與綿羊(EU857623. 1) 的VEGF基因cDNA的序列的比較。圖3顯示了 573bp的絨山羊VEGF164基因的cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO 1)禾口 由此序列推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。圖4顯示從絨山羊胎兒成纖維細胞分離的總RNA的RT-PCR的結(jié)果(573bp VEGF164的cDNA)的電泳圖。圖5顯示本實驗室構(gòu)建的中間載體P19T-K的圖。圖6顯示本實驗室構(gòu)建的中間載體ρ⑶sRed的構(gòu)建流程圖。圖7顯示中間載體P19T-KV酶切鑒定的電泳圖。圖8是顯示毛囊特異性表達載體ρ⑶sRed-KV酶切鑒定的電泳圖。圖9顯示VEGF164基因毛囊細胞特異表達載體構(gòu)建流程及載體ρ⑶sRed-KV的圖。圖10是顯示ρ⑶sRed-KV轉(zhuǎn)染細胞48h后相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細胞的 圖。圖11是顯示G418篩選9天后轉(zhuǎn)基因細胞克隆的圖。圖12是顯示通過PCR鑒定轉(zhuǎn)基因細胞用引物在序列中位置示意圖。圖13是顯示轉(zhuǎn)基因細胞克隆的PCR鑒定的電泳圖。圖14是顯示組織半定量RT-PCR分析VEGF164基因在絨山羊腦、心臟、睪丸、胰腺、 脾、腎和肺中的表達情況。圖15是顯示絨山羊VEGF164基因與其它14種脊椎動物的VEGF基因根據(jù)基因間 核苷酸序列的同源性建立的進化樹。圖16是顯示推斷的由絨山羊VEGF164基因核苷酸序列編碼的VEGF164蛋白的二 級結(jié)構(gòu)。圖17是顯示推斷的由絨山羊VEGF164基因核苷酸序列編碼的VEGF164蛋白具有 的VEGF蛋白所特有的保守性活性位點。
具體實施例方式本發(fā)明人已經(jīng)努力從絨山羊的不同組織細胞中分離出VEGF基因。作為結(jié)果，本發(fā) 明人從絨山羊體外培養(yǎng)的胎兒成纖維細胞分離了 VEGF164基因的cDNA的573bp片段，并且 確定了它的核苷酸序列和由它推斷出的氨基酸序列。本發(fā)明人通過比對已知的小鼠、大鼠、人、綿羊、牛和馬的VEGF基因的核苷酸序列，找到保守區(qū)，然后根據(jù)GenBank中綿羊VEGF基 因cDNA序列(EU857623. 1)設計出了一對用于RT-PCR擴增絨山羊VEGF164基因cDNA片段 的引物(上游引物稱為P1，下游引物稱為P2)，并應用這對引物擴增出了特異性片段，測序 后得到了絨山羊VEGF164基因的cDNA的573bp片段，序列分析表明核苷酸序列與綿羊的 VEGF基因的(EU857623. 1)有99%的相似性，(572/573)，由此序列推導出的氨基酸序列與 綿羊的相比僅有1個氨基酸的差別。這一 cDNA片段稱為“VEGF164”。將克隆到的VEGF164基 因與毛囊特異性的KAP6-1基因啟動子片段以及紅色熒光蛋白表達元件連接構(gòu)成VEGF164 毛囊特異性表達載體pCDsRed-KV，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細胞后獲得了具有紅色熒光 蛋白和新霉素抗性雙選擇標記的轉(zhuǎn)基因細胞克隆。為了從絨山羊胎兒成纖維細胞中分離VEGF164基因，本發(fā)明人首先按照提取細 胞總RNA的標準要求收集體外培養(yǎng)的內(nèi)蒙古白絨山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat, Capra hircus)的胎兒成纖維細胞。然后利用TaKaRa的總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取絨山羊胎兒成纖維細胞的總RNA，然后以該總 RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA第一鏈。再以此cDNA第一鏈為模板，利用特異性引 物P1、P2進行PCR擴增，得到目的片段(圖4)。之后將電泳后分離的目的片段切膠回收， 測定雙鏈cDNA的濃度，與pMD19-T克隆載體連接構(gòu)建成質(zhì)粒pMD19T_VEGF164。為了檢測連接反應是否成功和擴增質(zhì)粒pMD19T-VEGF164，將其轉(zhuǎn)化E coli DH5 α 感受態(tài)細胞，然后將此被質(zhì)粒PMD19T-VEGF164轉(zhuǎn)化了的Ecoli DH5 α細胞涂在含有氨芐青 霉素的選擇性平板上，并同時進行藍、白菌落篩選。37°C培養(yǎng)16小時后選取白色的重組菌 落再進行平板劃線培養(yǎng)12小時。作為結(jié)果，初步認定白色菌落為獲得的重組菌落。重組菌落和重組質(zhì)粒PMD19T-VEGF164的進一步鑒定則分為三個步驟進行。首先 挑取劃線培養(yǎng)的菌落用Kieser法提質(zhì)粒，再以此質(zhì)粒為模板，用特異性引物Pl、P2進行PCR 鑒定，陽性的初步認定為重組質(zhì)粒，其相應的 菌落則為重組菌落。然后，再挑取初步認定為 重組的菌落進行液體培養(yǎng)，精提質(zhì)粒，再以此精提的質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定，陽性的質(zhì)粒 進一步進行EcoR I+Hind III雙酶切鑒定。經(jīng)過了 PCR和酶切雙重鑒定的質(zhì)粒確定為重組質(zhì) 粒PMD19T-VEGF164。作為結(jié)果，得到了顯示陽性反應的重組質(zhì)粒和重組菌落。將含有重組 質(zhì)粒PMD19T-VEGF164的Ecoli DH5 α液體培養(yǎng)的樣品送寶生物工程(大連)有限公司測 序。作為結(jié)果，獲得了 573bp的山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序列。將本實驗室前期構(gòu)建的含有綿羊毛囊特異性表達的KAP6-1基因啟動子的 pl9TK(圖5，ΚΑΡ6-1基因啟動子克隆和ρ19ΤΚ構(gòu)建參見“郭旭東，毛舒燕，寶明濤，尹俊，旭 日干.綿羊角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白ΚΑΡ6-1基因5'端調(diào)控區(qū)的分子克隆及測序結(jié)果比較.內(nèi)蒙古 大學學報(自然科學版)，2007，38 :58-63”)和pMD19T_VEGF164分別用Sal I+Sph I雙酶 切后電泳，切膠回收P19TK大片段與VEGF164小片段(長573bp)，純化后由T4DNA連接酶連 接，得到重組質(zhì)粒P19T-KV。提取質(zhì)粒后酶切鑒定重組結(jié)果，載體測序。序列測定表明基因 與KAP6-1啟動子連接正確。以pCDsRed2質(zhì)粒(該質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建，含有以CMV啟動 子穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的表達元件。CMV啟動子PCR擴增正向引物(pC-Ι，從基因序列第 4679 位開始設計)序列為 5，-GTC GGT ACC TCT TTC CTG CGT TAT CCC-3，，引物設計時 5， 端加入了 KpnI識別位點(序列劃線標示，以下相同)，在其前面加了 3個保護性堿基；反向 引物(pC-2，從基因589位開始逆向設計)序列為5，-GTG CCC GGG GAT CTG ACG GTT CACTAA A-3’，引物設計時5’端加入了 SmaI識別位點，在其前面也加了3個保護性堿基。以質(zhì) 粒 PIRES2-EGFP 為模板進行 PCR 擴增，PCR 反應條件為95°C lmin、60°C lmin、72°C lmin，40 次循環(huán)。預期片段長度660bp紅色熒光蛋白的質(zhì)粒載體pDsRed2-l和PCR擴增出來的CMV 啟動子部分片段分別以KpnI+Smal酶切，T4 DNA連接酶。構(gòu)建流程見圖6)為構(gòu)建骨架，將 ρ⑶sRed2載體Bgl II酶切，回收后Klenow fragment補平，再經(jīng)Hind III酶切，獲得上游為平 末端，下游為Hind III粘性末端的pCDsRed2大片段(約4. 8kb)。pl9T_KV經(jīng)Sma I +Hind III雙酶切獲得上游為平末端，下游為Hind III粘性末端KV片段(約1.6kb)。T4 DNA連接酶 連接ρ⑶SRed2大片段和KV片段，構(gòu)建毛囊特異性表達載體ρ⑶sRed2-KV (圖9)。轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5 α，提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定重組結(jié)果并載體測序。經(jīng)酶切鑒定及序列測定，載體構(gòu) 建正確，完全符合預期要求，獲得了重組表達載體。顯示上面提到的特征的本發(fā)明的特異性PCR引物Pl和Ρ2，可以利用RT-PCR方法 擴增出絨山羊的VEGF164基因的cDNA片段。將本發(fā)明克隆的VEGF164基因cDNA重組到真 核表達載體上構(gòu)建的毛囊特異性表達載體P⑶sRed-KV可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細 胞，在毛囊中可以表達出完整的VEGF164蛋白，促進毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長。轉(zhuǎn)VEGF164基因 細胞系的獲得為通過克隆技術(shù)培育高產(chǎn)絨量絨山羊新品系提供了材料。根據(jù)本發(fā)明獲得的 絨山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序列可進一步通過RT-PCR或雜交的方法檢測VEGF164 基因的組織表達特異性，進而可用于檢測絨山羊各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀 態(tài)下的VEGF164基因的表達情況等。在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，但這并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1 絨山羊VEGF164基因的cDNA 573bp片段的克隆為了克隆來自絨山羊胎兒成纖維細胞的VEGF164基因包含573bp編碼區(qū)的cDNA， 根據(jù)圖1公開的核苷酸序列(EU857623. 1)，并比對大鼠、小鼠、人、綿羊、牛和馬的VEGF基因 核苷酸序列，找到保守區(qū)，然后以圖1序列為基序首先制備允許擴增573bp的cDNA的PCR弓丨 物，即上游引物 Pl 5' CGGTCGAC ATGAAC TTTCTGCTCTCT 3'(其中 CG 為保護堿基，GTCGAC 為 Sal I 的酶切位點)。擴增的下游引物P2 AT GCATGC TCACCGCCTCGGCTTGTC 3' (AT 為保護堿基，GCATGC為Sph I的酶切位點)。 為了利用RT-PCR方法克隆VEGF164基因的cDNA，從絨山羊胎兒成纖維細胞分離總 RNA，利用TaKaRa總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作 程序提取絨山羊胎兒成纖維細胞總RNA，進行電泳檢測和紫外測定RNA濃度后置于-80°C冰 箱保存?zhèn)溆?。然后，利用TaKaRa的AMV反轉(zhuǎn)錄酶并按照使用說明書的操作程序進行反轉(zhuǎn)錄 反應，得到cDNA第一鏈。 以上面得到的cDNA第一鏈為模板，PU P2為引物，利用TaKaRa PrimeSTAR DNA 聚合酶進行PCR反應。PCR擴增的反應體系為25yL體系，5XPrimeSTAR Buffer 5μ L ； 2. 5mmol/L dNTPs 2 μ L ;10 μ mol/L 弓丨物 PI、P2 各 0· 5 μ L ；模板 cDNA 0. 5 μ L ；PrimeSTAR DNA聚合酶0. 25 μ L ；去離子水16. 25 μ L0 PCR的反應條件為95°C預變性5min，95°C lmin， 55°C 30S,72°C lmin，共 35 個循環(huán)，72°C延伸 10min，72°C TaqPolymerase 加尾 30min。預期 片段長度573bp。反應結(jié)束后，PCR產(chǎn)物10μ 1經(jīng)瓊脂糖凝膠進行電泳(0. 5% TAE,電 壓8v/cm，1. 5h)。電泳結(jié)束，0. 5 μ g/ml的EB染色液中染色20分鐘，再清水浸泡10分鐘后 置于凝膠成像儀觀察照相。作為結(jié)果，得到了 573bp的特異性目的片段(參見圖4)。
為了將獲得的573bp的cDNA特異性目的片段連接到pMD19_T克隆載體上，首先將 電泳分離的573bp的cDNA特異性目的片段進行切膠，然后利用膠回收試劑盒回收目的片 段，紫外測定濃度后按照PMD19-T克隆載體說明書操作 程序完成連接。為了檢測連接反應 是否成功和進一步擴增質(zhì)粒PMD19T-VEGF164，將其轉(zhuǎn)化Ecoli DH5 α感受態(tài)細胞，然后將 此被質(zhì)粒PMD19T-VEGF164轉(zhuǎn)化了的Ecoli DH5 α細胞涂在含有氨芐青霉素和Χ-gal的選擇 性平板上，并同時涂上IPTG進行誘導，實現(xiàn)藍、白菌落篩選。涂布的平板37°C培養(yǎng)16小時 后選取白色的重組菌落再進行平板劃線培養(yǎng)12小時。作為結(jié)果，得到了白色的重組菌落。進一步的工作是對重組菌落和重組質(zhì)粒進行鑒定(理論上將只有含有重組質(zhì)粒 的菌落才是真正的重組菌落)。首先將白色的重組菌落進行劃線培養(yǎng)12小時，然后挑取菌 落，用Kieser法提質(zhì)粒。再以此質(zhì)粒為模板，用特異性引物PI、P2進行PCR鑒定。對陽性 的菌落進行搖床振蕩液體培養(yǎng)12小時，精提質(zhì)粒，紫外檢測濃度并進行瓊脂糖凝膠電 泳(0.5%TAE，電壓8V/Cm，1.5h)檢測，作為結(jié)果，得到了與預期結(jié)果大小相符的質(zhì)粒。最 后一步是對精提的質(zhì)粒利用酶切反應(EcoR I ,Hind III)進行二次鑒定。作為結(jié)果，得到 了 573bp的特異性目的片段。經(jīng)過兩次鑒定的重組質(zhì)粒，與其相應的菌落即是重組菌落。將液體培養(yǎng)的重組菌 落樣品Iml送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司公司測序。作為結(jié)果，獲得了絨山羊VEGF164 基因的cDNA編碼區(qū)573bp片段的克隆。實施例2 絨山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序列圖2顯示了絨山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序列與綿羊的VEGF基因 (EU857623. 1) cDNA的核苷酸序列的比較。表明1)絨山羊VEGF164基因cDNA的核苷酸序 列與綿羊的VEGF基因cDNA的核苷酸序列有99%的同源性。由絨山羊的這段核苷酸序列推 導出的氨基酸序列與綿羊的VEGF蛋白相同位置片段的氨基酸序列相比(ACG49836. 1)只有 1個氨基酸的差異。圖3顯示了實施例1中獲得的573bp的cDNA位核苷酸序列(SEQ ID NO 1)和推 斷的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。在圖3中，顯示的序列是絨山羊VEGF164基因⑶S的核 苷酸序列，573bp的完整ORF和由此序列編碼形成的分子量為22. 3KD的成熟蛋白質(zhì)的190 個氨基酸，其N端的26個氨基酸殘基組成信號肽序列，后面的164個氨基酸殘基形成成熟 蛋白 VEGF164。實施例3 絨山羊VEGF164基因中間載體ρ 19T-KV和毛囊特異性表達載體 pCDsRed-KV 的構(gòu)建將質(zhì)粒pl9TK(本實驗室構(gòu)建，pMD19T載體上連接有1052bp的綿羊KAP6-1基因啟 動子，見圖5)和pMD19T-gVEGF164分別用Sal I+Sph I雙酶切后電泳，切膠回收pl9TK大 片段與VEGF164小片段(長573bp)，純化后由Τ4 DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒pl9T_KV。 提取質(zhì)粒后酶切鑒定重組結(jié)果(圖7)，載體測序。之后將pCDsRed2載體Bgl II酶切，回收后Klenow fragment補平，再經(jīng)Hind III酶切，獲得上游為平末端，下游為Hind III粘性末端的P⑶sRed2大片段(約4. 8kb)。 P19T-KV經(jīng)Sma I +Hind III雙酶切獲得上游為平末端，下游為Hind III粘性末端KV片 段(約1. 6kb)。T4DNA連接酶連接ρ⑶sRed2大片段和KV片段，構(gòu)建毛囊特異性表達載體 ρ⑶SRed2-KV。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定重組結(jié)果(圖8)并載體測序。構(gòu)建的毛囊特異性表達載體ρ⑶SRed-KV經(jīng)酶切鑒定正確，測序后顯示VEGF164基因正確連 接在KAP6-1啟動子的下游，順序連接紅色熒光蛋白表達元件，載體構(gòu)建正確，完全符合預 期要求。ρ⑶SRed2載體是以pDsRed2為框架，在DsRed2基因上游加入CMV啟動子，增強紅 色熒光蛋白的表達，以提高轉(zhuǎn)基因細胞的篩選效率。表達載體PCDsRed-KV構(gòu)建流程見圖9。實施例4 表達載體ρ⑶sRed-KV轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞擴大培養(yǎng)含重組質(zhì)粒ρ⑶SRed2-KV的E.Coli DH5 α宿主菌，按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒中 量提取試劑盒的說明提取和純化質(zhì)粒。以紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度和純度。利用限制 性內(nèi)切酶Hind III (載體中單一酶切位點)將質(zhì)粒線性化，乙醇沉淀回收。轉(zhuǎn)染實驗參照Lipo2000操作說明和要求進行。轉(zhuǎn)染前一日，以胰蛋白酶消化P2 代絨山羊胎兒成纖維細胞并計數(shù)，離心去上清，以無抗生素、含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng) 液重懸細胞，按照6X IO4細胞/孔密度接種六孔培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染當日，取25 μ 1約合4. 0 μ g 線性化質(zhì)粒ρ⑶sRed2-KV至1. 5ml Eppendorf管中，用無血清DMEM/F12調(diào)整至終體積為 250 μ 1 ；另取1個1. 5ml Eppendorf管中加入Lipo20008 μ 1，同樣以無血清DMEM/F12調(diào)整 至終體積為250 μ 1 ；室溫放置5min，將質(zhì)粒和脂質(zhì)體放入同一個管中輕輕混勻，室溫下靜 置20min。細胞在轉(zhuǎn)染前吸棄原培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，將混合物500 μ 1加入六孔培養(yǎng)板細 胞中，搖動培養(yǎng)板混勻，在37°C、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，6hr后換DMEM/F12完全培養(yǎng) 基，繼續(xù)培養(yǎng)至48hr后觀察熒光并統(tǒng)計轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48h后，在20倍熒光顯微鏡和相差顯微鏡下統(tǒng)計每一個視野中發(fā)紅 色熒光細胞數(shù)和細胞總數(shù)的比值，連續(xù)統(tǒng)計3個視野，獲得的平均值計算轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)胰蛋 白酶消化接種在IOOmm培養(yǎng)皿中，24h后加入終濃度為800 μ g/ml的G418開始篩選，隔天換 液一次，連續(xù)培養(yǎng)9天后形成大量同時具有新霉素抗性和紅色熒光標記的多克隆細胞群， 之后將G418的濃度調(diào)整為300 μ g/ml的維持濃度擴大培養(yǎng)后凍存。作為結(jié)果，Lipo2000介導線性化質(zhì)粒ρ⑶sRed-KV轉(zhuǎn)染細胞48h后觀察熒光，統(tǒng)計 轉(zhuǎn)染率約為10% (圖10A，B)。連續(xù)篩選9天后培養(yǎng)皿中出現(xiàn)了熒光密集的多克隆細胞群 (圖11A)。對分離的多克隆群細胞擴大培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因細胞系(圖11B)。實施例5 轉(zhuǎn)基因絨山羊胎兒成纖維細胞克隆的PCR鑒定選取擴大培養(yǎng)成功后穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因細胞克隆、轉(zhuǎn)染空載體細 胞及未轉(zhuǎn)染細胞，提取細胞基因組DNA進行PCR鑒定。PCR鑒定用特異性引物以預期的 pCDsRed2-KV 序列為模版進行設計，引物 P3 5 ‘ CACACCCACACTGAGAGC 3 ‘ 18mer ；P4 5' CGATCTCGAACTCGTGGC 3' 18mer，起始和終止位置見圖 12。25 μ 1 反應體系TaKaRa LA Taq (5U/μ 1)0. 25 μ 1 ； IOx LA Buffer (Mg+plus) 2. 5 μ 1 ；dNTP Mixture (各 2· 5mM) 4 μ 1 ； 細胞基因組 DNA 0. 5μ 1 ；Pl (10 μ Μ) 0. 5 μ 1 ；Ρ2 (10 μ Μ) 0. 5 μ 1 ；ddH2016. 75 μ 1 ；反應條件 94°C 4min ;(94°C lmin、50°C 2. 5min、72°C 2. 5min，35 個循環(huán))72°C IOmin0 預期片段長度 1405bp。作為結(jié)果，以基于VEGF164基因上游KAP6-1啟動子序列設計的引物Pl和基于 VEGF164基 因下游CMV啟動子序列設計的引物P2 PCR擴增重組序列片段，結(jié)果顯示在預期 的1083bp處檢測到一條特異性的擴增條帶(圖13)，表明ρ⑶sRed-KV已經(jīng)整合到絨山羊胎 兒成纖維細胞的基因組DNA中，可以作為轉(zhuǎn)基因體細胞核供體用于細胞核移植。實施例6 =VEGF 164基因在內(nèi)蒙古白絨山羊不同組織中表達的半定量RT-PCR檢測
內(nèi)蒙古白絨山羊的腦、心臟、睪丸、胰腺、肝、脾、腎、肺等組織采自內(nèi)蒙古白絨山羊種羊場屠宰后的羊體，現(xiàn)場采集后立即放入液氮冷凍，帶回實驗室置-80°C保存。按總 RNA提取試劑盒((TaKaRa RNAiso Reagent)說明書的操作方法分別提取各組織的總RNA， 瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性，紫外測定RNA濃度，然后用Oligo d(T)20Primers按照 反轉(zhuǎn)錄酶AMV說明書的方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。按照組織表達半定量RT-PCR的要 求，為了保證各組織RT-PCR反應模版的數(shù)量一致，采用了兩種措施，即首先每種組織的總 RAN反轉(zhuǎn)錄時，用量均為1 μ g ；然后以β -actin為內(nèi)參，通過調(diào)整cDNA用量保證擴增出 的不同組織的β -actin條帶一致，從而確定擴增目的基因VEGF164的PCR反應體系。內(nèi) 參 β -actin 的 PCR 特異性引物為上游引物 P5 5 ‘ TGGCACCACACCTTCTA CAACGAGC 3 ‘； 下游引物 P6:5' CGTCCCCAGAGTCCATGA CAATG 3'。10 μ L 反應體系10XPCR buffer 1 μ L ； dNTP :0· 8 μ L ；模版cDNA: :PCR的反應條件為:10μ L擴增反應體系=IOXPCRbuffer lyL;dNTP0. 8yL;模版cDNA;引物 Pl 0. 2yL;引物 P2 0. 2 μ L ；r-Taq 0. 1 μ L ;ddH20。各 組織cDNA模版用量分別為腦0. 2 μ L、心臟0. 2 μ L、睪丸0. 3 μ L、胰腺0. 4 μ L、脾0. 1 μ L、 腎0. 3 μ LJi 0. 2μ L ；相對應的CldH2O用量分別為腦7. 1μ L、心臟7. 1μ L、睪丸7. 0μ L、 胰腺 6.9 μ L、脾 7.2 μ L、腎 7.0 μ L、肺 7. IyL0 擴增循環(huán)95°C 預變性 5min，(95°C lmin， 50°C 30S，72°C lmin)，34個循環(huán)，72°C延伸10min. PCR擴增目的基因VEGF164的特異性引 物(P1，P2)、反應循環(huán)及反應體系與實施例1 (絨山羊VEGF164基因的cDNA573bp片段的克 隆)中所述相同，各組織cDNA模版用量與擴增內(nèi)參基因β-actin相同。β-actin預期片 段長度229bp，VEGF164預期片段長度573bp。反應結(jié)束后，PCR產(chǎn)物10 μ 1經(jīng)瓊脂糖凝 膠電泳檢測(0. 5% TAE,電壓8v/cm，1. 5h)。電泳結(jié)束，0. 5 μ g/ml的EB染色液中染色20 分鐘，再清水浸泡10分鐘后置于凝膠成像儀觀察照相。作為結(jié)果，組織半定量RT-PCR分析表明，VEGF164基因在腦、心臟、睪丸、胰腺、脾、 腎和肺中都有表達，其中在睪丸，胰腺和肺中表達量相對較高，在腦，心臟和腎中相對較低 (圖 14)。實施例7 :VEGF164基因核苷酸序列及其編碼的蛋白的氨基酸序列生物信息學和 功能預測測序得到的內(nèi)蒙古白絨山羊VEGF164基因cDNA序列用NCBI上的BLAST進行序 列比對(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，開放閱讀框(ORF)預測采用 DNAstar。 理論分子量大小和蛋白等電點預測采用Protein property calculator軟件(http:// www. basic. North westtern. edu/biotools/proteincalc. html)。胃
用SMART程序(http://smart, embl. de/)，蛋白質(zhì)功能位點分析采用Psite程序(http:// www. softberry. com)，蛋白質(zhì)亞細胞定位采用ProtComp Version 9. 0程序，進化樹建立使 用CLC軟件。作為結(jié)果，測序得到內(nèi)蒙古白絨山羊VEGF164基因cDNA核苷酸序列中GC含量 為 51. 1%。與人(AF486837. 1)、稱猴(ΧΜ_001089925. 1)、犬屬(NMJ)Ol 110502. 1)、小鼠 (BC061468. 1)、馬(AB053350. 1)野豬(AF318502. 1)、牛(AB450824. 1)、綿羊(EU857623. 1) 的VEGF基因的堿基序列同源性分別為94%、94%、94%、90%、95%、95%、98%、99%。相應 的氨基酸序列同源性分別為94%、94%、94%、90%、95%、95%、98%、99%。與14種脊椎動 物的VEGF基因根據(jù)基因間核苷酸序列的同源性建立進化樹(圖15)，表明內(nèi)蒙古白絨山羊與綿羊的親緣關(guān)系最近。編碼蛋白分析表明，內(nèi)蒙古白絨山羊VEGF164基因最大ORF編碼一個由190個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。該蛋白理論分子質(zhì)量22.3KD，等電點(pl)8.02，氨基酸組成中 Glu, Cys含量最高，為16%。SMART分析表明該蛋白質(zhì)1 26氨基酸位形成信號肽結(jié)構(gòu) 域，49 131氨基酸位為血小板衍生和血管內(nèi)皮生長因子家族(PDGF，VEGF)結(jié)構(gòu)域，128 172氨基酸為表皮生長因子相似結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含一些保守的半胱氨酸殘基，對蛋白的 高級結(jié)構(gòu)形成非常重要(圖16)。Psite分析表明在100 103氨基酸位有一個蛋白激酶C 磷酸化位點，146 184氨基酸位有4個酪蛋白激酶磷酸化位點，56 59氨基酸位有1個 N-豆蔻酰化位點，83 88氨基酸位有1個微體C端靶信號，171 173氨基酸位有1個血 小板衍生的生長因子家族(PDGF，VEGF)標簽(圖17)。ProtComp Version 9. O將其定位于 細胞外(分泌)。生物信息學分析表明，克隆的絨山羊VEGF164基因與其它物種的VEGF基因既有較 高的同源性，又有序列上的差別，是絨山羊的一個新基因，為首次獲得。對由該基因核苷酸 序列推斷的VEGF164蛋白分析表明，該蛋白的氨基酸序列與其它物種的VEGF蛋白既具有保 守區(qū)的一致性，又具有不同的氨基酸殘基。對絨山羊VEGF164蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析表明，該 蛋白具有VEGF蛋白保守的信號肽序列、功能結(jié)構(gòu)域和活性位點，在細胞內(nèi)表達后應該具有 VEGF血管內(nèi)皮生長因子的功能，可以促進細胞生長和毛囊發(fā)育，在轉(zhuǎn)基因動物中超表達可 以促進絨毛生長。
權(quán)利要求
絨山羊VEGF164基因cDNA片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所述。
2.由權(quán)利要求1中cDNA的核苷酸序列推斷出的絨山羊VEGF164蛋白質(zhì)的氨基酸序列 如 SEQ ID NO 2 所述。
3.構(gòu)建的絨山羊VEGF164基因毛囊特異性表達載體PcdsRed-KV如圖9所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及從體外培養(yǎng)的絨山羊胎兒成纖維細胞分離的編碼VEGF164蛋白的cDNA的核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列及毛囊特異性表達VEGF164蛋白和穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的真核表達載體pCDsRed-KV。其特征在于絨山羊VEGF164基因cDNA片段的核苷酸序列與它對應的氨基酸序列如SEQID NO1所述和SEQ ID NO2所述；構(gòu)建的絨山羊VEGF164基因毛囊特異性表達載體pCDsRed-KV如圖9所示。生物信息學分析表明，絨山羊VEGF164蛋白具有VEGF蛋白保守的信號肽序列、功能結(jié)構(gòu)域和活性位點，在細胞內(nèi)表達后具有VEGF血管內(nèi)皮生長因子的功能，可以促進細胞生長和毛囊發(fā)育，在轉(zhuǎn)基因動物中超表達可以促進絨毛生長。
文檔編號C12N15/12GK101988066SQ20101055662
公開日2011年3月23日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者侯鑫, 劉東軍, 劉俊娥, 李彬, 王志鋼, 郭旭東, 鮑文蕾 申請人:內(nèi)蒙古大學