專利名稱：紫花苜蓿鋅指蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物鋅指蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種紫花苜蓿鋅指蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幾乎所有的生命過程均涉及生物大分子的相互作用。這些作用有賴于大分子內(nèi)的特殊結(jié)構(gòu)域。這些相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域由至少50個(gè)氨基酸殘基長度的多肽片段形成。近年來又發(fā)現(xiàn)一些由較短的多肽片段(少于50個(gè)氨基酸殘基長度)形成的結(jié)構(gòu)域，但這些多肽片段不能自身折疊成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域。鋅離子在一定條件下可以不需要任何化學(xué)反應(yīng)就能與這種結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定性結(jié)合，故它非常適于結(jié)合在這種由短片段多肽形成的結(jié)構(gòu)中以維持其穩(wěn)定，發(fā)揮其特殊功能。人們將這種能夠特異性地與核酸位點(diǎn)結(jié)合并調(diào)節(jié)生理功能的蛋白質(zhì)片段稱為鋅指結(jié)構(gòu)(簡稱鋅指)，含有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白稱為鋅指蛋白。通常由一系列鋅指組成，具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的氨基酸模式，相隔特定距離的胱氨酸結(jié)合鋅指，能與某些RNA/DNA結(jié)合。1983年首次在轉(zhuǎn)錄因子IIIA(TFI11 A)中發(fā)現(xiàn)在基因調(diào)控方面起重要作用的鋅指結(jié)構(gòu)。此后的十幾年中，已發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物、酵母、病毒等的各種控制復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的500多種蛋白中具有這種鋅指類結(jié)構(gòu)基序。真核生物基因表達(dá)的調(diào)控是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)與前沿，真核生物的基因調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行。而鋅指蛋白正是作為真核生物中普遍存在的基因轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，鋅指蛋白通過與生物大分子如DNA、RNA結(jié)合來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，或通過蛋白間的連接直接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。既然鋅指蛋白對植物的生長發(fā)育起重要的作用，因此對于植物鋅指蛋白基因的克隆、表達(dá)、結(jié)構(gòu)與功能的分析，有利于在分子水平上詳細(xì)了解該基因，從而促進(jìn)植物基因工程的進(jìn)展。鋅指蛋白家族中有一類不尋常的鋅指蛋白，CCCH類型的鋅指蛋白的功能研究比較少，雖然現(xiàn)在已經(jīng)證明一些CCCH類型的鋅指蛋白具有RNA結(jié)合活性，但其具體的作用未知。而且現(xiàn)階段對CCCH類型鋅指蛋白的研究主要集中在動(dòng)物中，植物中研究較少。在水稻中，OsDOS蛋白也是一種核定位蛋白，可以通過影響茉莉酸甲酯信號通路從而延遲葉片的衰老。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的SOMNUS蛋白，編碼一種核定位CCCH類型的鋅指蛋白，對影響光依賴種子發(fā)芽的下游蛋白起負(fù)調(diào)控作用。擬南芥中的PEIl作為一種DNA結(jié)合蛋白，被鑒定作為一種胚胎發(fā)育的調(diào)控因子，另外兩種在擬南芥中分離得到的CCCH類型鋅指蛋白AtSZFl和 AtSZF2可以在鹽脅迫條件下起到一定的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫花苜蓿鋅指蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的紫花苜蓿鋅指蛋白，來源于紫花苜蓿(Medicago sativa)，是1)具有序列表中序列2所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；或2)是將序列2所示氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2所示氨基酸殘基序列相同活性的由序列2所示蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的紫花苜蓿鋅指蛋白，其中所述紫花苜蓿鋅指蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。本發(fā)明所提供的紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因，是下列DNA分子之一1)其核苷酸序列為序列表中的序列1自5’端第58到第1311位所示；2)編碼序列表中序列2所示蛋白質(zhì)的DNA分子；3)5’端非編碼區(qū)為序列表中序列3，從5’端第1到第57位所示；4) 3’ RACE產(chǎn)物序列為序列表中序列4，從5’端第623位到第1571位所示；5) 5’ RACE產(chǎn)物序列為序列表中序列5，從5’端第1位到第1199位所示；6)與序列表中序列1所示的DNA分子具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。本發(fā)明的紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因，其中所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因如序列表中的序列1所示。本發(fā)明還提供了含有所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了含有所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因的細(xì)胞系。本發(fā)明還提供了擴(kuò)增所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因中任一片段的引物。本發(fā)明的所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因可用在苜蓿生長發(fā)育機(jī)制研究中。本發(fā)明的所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因可用在植物開花性狀研究中。本發(fā)明的紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因?qū)檐俎ＩL發(fā)育過程研究，對植物生長發(fā)育的理論研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，以及鋅指蛋白基因功能研究具有重要意義。


圖1為中間片段擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖2為3’端擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖3為5’端擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、(一 )紫花苜蓿鋅指蛋白編碼基因的獲得紫花苜蓿品種中苜一號(Medicago sativa L. v. zhongmu No. 1)種子在下催芽2d后，在光照培養(yǎng)，每天光照12h，至兩葉一心期開始用250mmol/L NaCl脅迫處理 Oh, 0. 5h, lh, 3h, 6h, 12h, 24h 以備提取總 RNA。RNA提取參照張勁松等人的方法進(jìn)行(張勁松，等.中國科學(xué)，B輯，1995，25 (5) 659 669)，苜蓿葉片在液氮中研碎，懸于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中鈉，5g/l十二烷基肌氨酸，25mmol/L檸檬酸鈉，0. lmol/L^巰基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉淀總RNA，再經(jīng)4mol/LLiCl懸浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸鈉/乙醇沉淀總RNA，最后將RNA溶于水中，貯存于_20°C備用，用0. 8%的瓊脂糖檢測RNA的完整性。通過反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)，對一個(gè)紫花苜蓿鹽誘導(dǎo)抑制消減雜交cDNA文庫進(jìn)行篩選。獲得一個(gè)在鹽誘導(dǎo)條件下表達(dá)量下調(diào)的克隆。通過測序獲得了 701bp的cDNA片段如圖1 (圖1中1 :MsZFN基因中間片段；M :DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。以獲得的cDNA片段序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增3’端和5端’特異引物GSPl :5，-CAGACAGTCCACAACAAACAATGAG-3，GSP2 :5， -CTGATGAAGAACCTAGCAGACGCCG-3，按照SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Cat. no. K1811-1)的方法作 RT-PCR。3，端的擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為94 V變性k，68°C退火IOs，72°C延伸anin，35個(gè)循環(huán)。 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)出一 950bp左右的DNA片斷如圖2(圖2中1 =MsZFN基因3' 末端擴(kuò)增片段；M :DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。5，端的擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為94°C變性5s，72°C延伸;3min，5個(gè)循環(huán)；94°C變性k， 70°C退火 10s，72°C延伸;3min，5 個(gè)循環(huán)；94°C變性 5s，68°C退火 10s，72°C延伸 2min，25 個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)出1200bp左右的DNA片段如圖3(1 =MsZFN基因5' 末端擴(kuò)增片段；M :DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。產(chǎn)物回收純化，連接，轉(zhuǎn)化，測序，測序結(jié)果3’端序列為SEQ ID No :4，5’端序列為 SEQID Na :5ο借助DNA拼接軟件contig，獲得該基因的cDNA的完整序列，該序列全長為 1676bp，具有SEQ ID Ns 1的DNA序列，58_1311bp為其完整編碼區(qū)域，編碼的蛋白含有418 個(gè)氨基酸殘基，具有SEQ ID N2 :2的氨基酸殘基序列。( 二 )紫花苜蓿鋅指蛋白的功能分析1)序列比較分析用BLAST和DNAMAN軟件對克隆出紫花苜蓿鋅指蛋白的序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明紫花苜蓿鋅指蛋白與截形苜蓿、大豆、水稻和擬南芥的鋅指器具有極大的同源性如圖4 所示。其中與截形苜蓿MtZFN(ABD28369)有97%的同源性，與大豆的PsZFN(AAD45720)有 93%的同源性，與水稻的OsZFN(EEE52080)有61 %的同源性與擬南芥的AtZFN(ABG25055) 有61%的同源性。2)轉(zhuǎn)基因分析設(shè)計(jì)1對引物用于構(gòu)建植物表達(dá)載體ZFNf 5' -GCTCTAGAATGGAATACGATGCCATCCCTCAAGAGGC-3>ZFNr :5，-CGGATCCCCCATTTCCAAGAAGACAACATTATCCC-3’其中劃線部分分別表示)(bal，BamHI酶切位點(diǎn)。提取苜蓿的總RNA，用oligo (dT) 18作反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用引物ZFNf，ZFNr進(jìn)行 PCR,得到含有MsZFN完整開放閱讀框的DNA片段，連接到pMD_18T載體上，獲得重組克隆載體，命名為pMD-ZFN。pMD-ZFN轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并送到華大基因生物公司測序。對于含有正確序列的菌株，搖菌提取質(zhì)粒，用)(bal和BamHI分別雙酶切pMD-ZFN和PBI121載體，回收、 純化酶切產(chǎn)物。按照載體插入片段為1 7的比例，取適量線性化載體PBI121和MsZFN 的純化片段混合，用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，從而獲得含有MsZFN編碼序列的重組表達(dá)載體，命名為PBI-ZFN。挑取農(nóng)桿菌LBA4404單菌落接種到^iil YEB液體培養(yǎng)基(含鏈霉素125ug/ml)中， 振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物500ul接種于50ml的YEB液體培養(yǎng)基中，285000g，4°C離心5min，收集菌體200rmp振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 5左右。5000g，4°C離心5min，收集菌體。于冰上加入IOml 0. 15M的NaCl溶液懸浮細(xì)胞。5000g，4°C離心5min，收集菌體。加入預(yù)冷的lml20mMCaCl2重懸。取200ul感受太細(xì)胞，加入lug pBI-ZFN，冰浴30min，液氮中凍Imin0 37°C熱激，加入Iml的YEB液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)4h，IOOOOg離心30s，加入IOOul的YEB重懸細(xì)胞。菌液涂布于含有l(wèi)OOug/mlkan和125ug/ml鏈霉素的YEB固體選擇培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)過夜，獲得LBA4404-ZFN。農(nóng)桿菌LBA4404-ZFN葉盤法轉(zhuǎn)化煙草用5 IOmm打孔器制備葉盤外植體；獲得的外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡Smin ；用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入上鋪一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)；3d后，將材料轉(zhuǎn)到含有抗生素的誘導(dǎo)愈傷組織形成及誘芽培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；待抗性芽生長至2-3cm高時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；待煙草長出根，轉(zhuǎn)移到花盤中，待種子成熟，收集種子。轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選制備MS (0. 43% MS鹽，3%蔗糖，1 %瓊脂，用KOH調(diào)pH至 5.7)選擇培養(yǎng)基；T1代種子表面消毒Omin in 70%乙醇，IOmin in 0.5%次氯酸鈉，無菌水a(chǎn)iiinX 5次)；平鋪于含相應(yīng)抗生素(40 μ g/ml Kan和50 μ g/ml的頭孢霉素)的MS選擇培養(yǎng)基中，密度為100-200粒種子/皿；4°C春化3天，移入生長箱中(22°C恒溫，24小時(shí)光照，光強(qiáng)為30-40ymOl.m_2. s-1) ；7天后挑選轉(zhuǎn)化體，表現(xiàn)為真葉健康呈深綠色，根伸長至培養(yǎng)基中；將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)至正常的MS培養(yǎng)基中，10天后轉(zhuǎn)入土壤；收獲T2代種子。T2代轉(zhuǎn)基因植株倒置培養(yǎng)5天后根平均伸長2. O厘米，野生型植株根平均伸長2. 1 厘米，野生型植株和T2代轉(zhuǎn)基因植株差別并不明顯，除具有一定彎曲長度的主根外，都有比較發(fā)達(dá)的側(cè)根出現(xiàn)。成熟的T2代轉(zhuǎn)基因植株要比野生型的煙草推遲開花1-2個(gè)月，說明 MsZFN基因可能涉及到植物的開花過程。說明紫花苜蓿鋅指蛋白與基因涉及到植物生長發(fā)育階段，尤其是涉及到植物的開花過程?？梢宰鳛橹参锷L發(fā)育基因工程的侯選基因加以應(yīng)用，用來改良植物的表型性狀。以上的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種紫花苜蓿鋅指蛋白，是如下的1)或2)1)具有序列表中序列2所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；2)是將序列2所示氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2所示氨基酸殘基序列相同活性的由序列2所示蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述紫花苜蓿鋅指蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
3.紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因，是下列DNA分子之一1)其核苷酸序列為序列表中的序列1自5’端第58到第1311位所示；2)編碼序列表中序列2所示蛋白質(zhì)的DNA分子；3)5’端非編碼區(qū)為序列表中序列3，從5’端第1到第57位所示；4)3’RACE產(chǎn)物序列為序列表中序列4，從5’端第623位到第1571位所示；5)5’RACE產(chǎn)物序列為序列表中序列5，從5’端第1位到第1199位所示；6)與序列表中序列1所示的DNA分子具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因如序列表中的序列1所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求3或4所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因的細(xì)胞系。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求3或4所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因中任一片段的引物。
8.權(quán)利要求3或4所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因在苜蓿生長發(fā)育機(jī)制研究中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3或4所述紫花苜蓿鋅指蛋白的編碼基因在植物開花性狀研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種紫花苜蓿鋅指蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的紫花苜蓿鋅指蛋白，是具有序列表中序列2所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的所示氨基酸殘基序列相同活性的由序列2所示蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的紫花苜蓿鋅指蛋白及其編碼基因?qū)⒃谲俎ｉ_花分子機(jī)制研究、豆科植物生長發(fā)育性狀改良中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/29GK102477086SQ201010556180
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者孫彥, 康俊梅, 張鐵軍, 晁躍輝, 楊青川 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所