本發(fā)明屬于植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及巨桉egrzfp6在提高植物在滲透脅迫下適應(yīng)脅迫的用途。
背景技術(shù)：
：低溫、干旱等非生物脅迫會制約植物生長和發(fā)育，對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)有嚴重影響。研究植物抗逆生理和分子機制對提高植物非生物逆境脅迫抗性具有重要意義(dosreisetal.,2012；roychoudhuryetal.,2015)。為了應(yīng)對逆境脅迫，植物在長期進化過程中形成了一定的響應(yīng)機制，植物感受到逆境信號后，通過相應(yīng)基因調(diào)控，改變一系列代謝過程，產(chǎn)生應(yīng)對脅迫的響應(yīng)，如提高可溶性糖含量，增加抗?jié)B透脅迫物質(zhì)如脯氨酸、甜菜堿等，進而提高植物抗逆性(takabe,2012)。在植物抗逆分子響應(yīng)機制中，作為基因開關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,tf)發(fā)揮重要作用。植物中轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量龐大，相當一部分成員與逆境調(diào)控相關(guān)，如bzip、wrky、ap2/erebp、myb和nac等，近年來鋅指類轉(zhuǎn)錄因子(zincfingerprotein:zfp)也被證明在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用(gujjaretal.,2014；reddyetal.,2013)。根據(jù)zfp轉(zhuǎn)錄因子具有的半胱氨酸(c)和組氨酸(h)殘基數(shù)量和位置，可將鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子分為c2h2，c2h，c2c2，c2hcc2c2，c2c2c2等類型。其中c2h2型鋅指蛋白是植物中研究較多、功能較為明確的一類鋅指蛋白。其鋅指結(jié)構(gòu)域由約30個氨基酸組成，包含兩個半胱氨酸和兩個組氨酸，以及一段植物所特有的高度保守序列(qalggh)(kuboetal.,1998；黃驥等,2004)。c2h2型鋅指蛋白在植物中成員眾多，擬南芥(arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)176個成員(englbrechtetal.,2004)，水稻(oryzasativa)基因組數(shù)據(jù)顯示水稻上有182個(agarwaletal.,2007)。c2h2型鋅指蛋白廣泛參與植物生長、發(fā)育和代謝，以及植物對低溫，高鹽和干旱等非生物逆境的響應(yīng)(agnieszkaand2012)。水稻oszfp1作為負調(diào)控因子，能抑制鹽脅迫相關(guān)基因表達，轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫抗性降低。同時，其逆境響應(yīng)還受脫落酸(aba)影響，暗示其可能參與aba依賴的逆境響應(yīng)過程(kongetal.,2004)。水稻另外一個c2h2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因oszfp245的超表達則能夠提高植株對低溫、干旱和氧化逆境的抗性(huangetal.,2009)。矮牽牛(petuniahybrid)基因zpt2-3也可被低溫、干旱和重金屬等非生物脅迫誘導(dǎo)表達，其轉(zhuǎn)基因植株干旱耐受力有效提高(suganoetal.,2003)。這些表明c2h2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子能夠在植物非生物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。目前植物c2h2型鋅指蛋白研究主要集中在模式植物中，在林木中研究較少。巨桉(eucalyptusgrandis)作為世界三大用材樹種之一，在我國南方各省栽培廣泛，為我國林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展作出重要貢獻。但其對低溫敏感，不耐干旱、鹽漬，這嚴重限制其栽培范圍的擴大；低溫、干旱等不良天氣條件還經(jīng)常對桉樹生產(chǎn)造成損失。因此，研究其非生物逆境脅迫響應(yīng)分子機制對桉樹抗逆分子育種具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供巨桉c2h2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子egrzfp6在提高植物在滲透脅迫下適應(yīng)脅迫的用途。在本發(fā)明一個實施方案中，在植物中過表達巨桉c2h2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子egrzfp6，在滲透脅迫下改變植株根構(gòu)型，提高植物在滲透脅迫下適應(yīng)脅迫的用途。其中，所述改變植物根構(gòu)型包括增加側(cè)根數(shù)量以及促進側(cè)根的伸長生長。其中，所述的逆境脅迫包括但不限于干旱、高鹽等滲透脅迫。另一方面，本發(fā)明還提供一種提高植物在滲透脅迫下的適應(yīng)性的方法，向目標植物轉(zhuǎn)入巨桉c2h2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子egrzfp6，并使其在目標植物體內(nèi)進行過量表達。其中，所述的滲透脅迫包括但不限于干旱，高鹽等。另一方面本發(fā)明還提供一種在滲透脅迫下改變植株根構(gòu)型的方法，其特征在于，向目標植物轉(zhuǎn)入巨桉c2h2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子egrzfp6，并使其在目標植物體內(nèi)進行過量表達。在本發(fā)明一個實施方案中，將轉(zhuǎn)入所述egrzfp6基因的目標植物進行干旱誘導(dǎo)，進一步促進側(cè)根增加和伸長，改變植株根構(gòu)型。其中，所述改變植物根構(gòu)型包括增加側(cè)根數(shù)量以及促進側(cè)根的伸長生長。其中，可采用本領(lǐng)域已知的所有方法向目標植物轉(zhuǎn)入巨桉c2h2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子egrzfp6，包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等。本發(fā)明構(gòu)建35s::egrzfp6超表達載體，采用花序侵染法進行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化；和對照相比，egrzfp6超表達擬南芥轉(zhuǎn)化植株在peg(1g·l-1以上)處理下，能大幅度促進側(cè)根增加和伸長，改變植株根構(gòu)型。附圖說明圖1所示為巨桉egrzfp6蛋白序列與其他植物同源蛋白序列比對。鋅指結(jié)構(gòu)域，l-box和ear基序用加粗黑線標示。meszat11：木薯manihotesculenta(oay41302.1)；mtrzat11：蒺藜苜蓿medicagotruncatula(xp_013468307.1)；grazat11：雷蒙德氏棉gossypiumraimondii(xp_012483278.1)；luszat11：亞麻linumusitatissimum(xp_002533000)；atzat11：擬南芥arabidopsisthaliana(aec09397.1)圖2egrzfp6的亞細胞定位。圖3所示為野生型和超表達egrzfp6擬南芥轉(zhuǎn)基因株系鑒定。col：野生型；egrzfp6-ox1和egrzfp6-ox2：超表達株系。圖4所示為野生型和超表達egrzfp6擬南芥轉(zhuǎn)基因株系生長7天后表型(a)和根長差異(b)。圖5所示為鹽脅迫下野生型和超表達egrzfp6基因擬南芥表型。圖6所示為模擬干旱脅迫下野生型和超表達egrzfp6基因擬南芥。具體實施方式以下實例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例11.材料與方法1.1材料巨桉幼苗生長在浙江農(nóng)林大學(xué)苗圃地。所選試驗材料為長勢一致的6個月苗齡幼苗。擬南芥野生型為col。實驗處理均在snijders微氣候控制生長箱(mc1000，荷蘭)中進行。培養(yǎng)條件為，擬南芥：白天24℃15h，夜間22℃9h；巨桉：白天25℃15h，夜間22℃12h。光照強度150μmol·m-2s-1,相對濕度(rh)70％。1.2egrzfp6蛋白序列分析在巨桉數(shù)據(jù)庫phytozome(http://www.phytozome.net/search.php)下載egrzfp6全長序列，設(shè)計引物，進行全長序列測序驗證后，將其編碼蛋白序列在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi進行blast比對，選擇5個與該蛋白序列相似程度比較高的不同物種蛋白序列，利用clastalx1.83進行多重比對。同時，用cdd在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白序列保守域。1.3egrzfp6亞細胞定位設(shè)計引物(表1)，pcr擴增去掉終止密碼子的egrzfp6開放閱讀框序列，以pcambia1300為載體骨架，利用多克隆位點處的kpni和xbai酶切位點，構(gòu)建egrzfp6-gfp融合蛋白表達載體。提取質(zhì)粒，金粉包埋后轟擊洋蔥(alliumcepa)表皮細胞。激光共聚焦顯微鏡掃描成像。1.4egrzfp6超表達載體構(gòu)建、異源轉(zhuǎn)化擬南芥和超表達擬南芥低溫、鹽和peg處理超表達載體骨架為含35s啟動子的pcambia1301，egrzfp6全長序列擴增引物見表1，利用多克隆位點處的kpni和xbai酶切位點，雙酶切法構(gòu)建35s::egrzfp6超表達載體。提取質(zhì)粒，選取健壯盛花期擬南芥采用農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥(許紅梅等,2010)。收獲侵染植株種子，于含20mg·l-1潮霉素的1/4ms培養(yǎng)基上(hygromycin)進行篩選，陽性植株繼續(xù)繁殖，收獲，篩選，pcr檢測，直到獲得t3代轉(zhuǎn)基因純合株系。提取10天苗齡的野生型和兩個超表達egrzfp6擬南芥純合株系rna，逆轉(zhuǎn)錄后，設(shè)計引物(表1)以atactin為內(nèi)參基因進行半定量rt-pcr，鑒定egrzfp6在轉(zhuǎn)基因株系中的表達情況。野生型和超表達egrzfp6擬南芥種子均勻播種在1/2ms培養(yǎng)基上，4℃暗處理24h后置于生長箱中生長。一周后，比較和分析野生型和超表達株系表型變化；參考zhao等(2016)的方法，將10天苗齡的幼苗于-8℃低溫處理3天，然后正常培養(yǎng)條件下緩苗3天，拍照觀察表型，統(tǒng)計植株死亡率；鹽(nacl)處理梯度為0mmol·l-1，50mmol·l-1和100mmol·l-1；使用peg6000模擬干旱處理，處理梯度為1g·l-1，5g·l-1和9g·l-1，種子發(fā)芽后，于生長箱中生長一周，觀察表型并拍照(nikon,d7000)。1.5rna提取，cdna合成及基因定量表達分析巨桉rna提取參考ctab+trizol法(王亞紅等,2010)，擬南芥rna提取參照trizol法(金美芳，2004)。cdna反轉(zhuǎn)錄試劑盒由康為世紀公司提供，定量熒光染料sybr由takara公司(大連，中國)提供。設(shè)計引物(表1)用bio-radcfx96定量rt-pcr系統(tǒng)(biorad,美國)以及系統(tǒng)自帶的bio-radcfxmanager(ver1.5.5.34)軟件進行實驗和結(jié)果分析。表1相關(guān)引物序列引物名稱引物序列(5′-3′)egrzfp6-sgfp-fcggggtacctcaacgacattctcttcagcaegrzfp6-sgfp-rgctctagacaggagcaaggcatctatct35s-egrzfp6-fcggggtaccgaaaaggcaccccacaaa35s-egrzfp6-rgctctagacctaaactcagtcggtccaaaatactin-rt-ftgcccatcgggtaattcatagttcatactin-rt-rcctcatgccatcctccgtcttegrzfp6-rt-fatcccaagatgcacgagtgctcegrzfp6-rt-rcggaccaaccacgaaaatctca2結(jié)果與分析2.1egrzfp6編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析egrzfp6編碼蛋白含有2個鋅指結(jié)構(gòu)域，對該基因蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域搜索，并將其與其他不同植物中的同源蛋白比對分析結(jié)果表明，該基因編碼蛋白含有2個高度保守的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，且2個鋅指結(jié)構(gòu)域核心序列均為qalggh，該序列是植物鋅指蛋白所特有的(takatsuji,1999)。另外，egrzfp6蛋白序列還分別含有1個乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子相關(guān)雙性抑制子(erfassociatedamphiphilicrepression：ear)基序：dlnltp和1個l-box基序(圖1)。2.2egrzfp6亞細胞定位結(jié)果分析構(gòu)建egrzfp6-gfp表達載體，利用基因槍轟擊洋蔥表皮的方法對egrzfp6蛋白進行亞細胞定位分析，結(jié)果表明該基因表達的蛋白定位于細胞核中(圖2)。其可能是作為轉(zhuǎn)錄因子在細胞核內(nèi)發(fā)揮基因表達調(diào)控作用。2.3超表達egrzfp6轉(zhuǎn)基因擬南芥株系鑒定半定量rt-pcr分析結(jié)果(圖3)表明，野生型col中沒有檢測到egrzfp6表達，在兩個轉(zhuǎn)基因純合株系egrzfp6-ox1和egrzfp6-ox2中egrzfp6具有明顯表達(圖3)。2.4超表達egrzfp6基因擬南芥株系正常條件及低溫、高鹽和peg處理下表型分析超表達egrzfp6擬南芥2個純合株系egrzfp6-ox1和egrzfp6-ox2，播種7天后和對照(col)相比，根長生長明顯受到抑制(圖4a)。2個轉(zhuǎn)基因株系的根長分別為野生型的89.4％和87.0％(圖4b)。鹽處理下，egrzfp6超表達擬南芥株系與野生型擬南芥隨鹽濃度提高，主根、側(cè)根生長都表現(xiàn)為受鹽抑制，但受抑制程度相對于野生型有所減弱，表示超表達egrzfp6在一定程度上能夠提高植株對鹽脅迫的耐受性(圖5)。在peg處理中，1g·l-1以上的濃度即能誘導(dǎo)egrzfp6超表達擬南芥株系側(cè)根大量發(fā)生，同時側(cè)根伸長作用也明顯被促進。但伸長和對照相比，在peg處理下并沒有受到明顯抑制，表示超表達egrzfp6株系根長生長對滲透脅迫的抑制作用敏感性下降(圖6)，9g·l-1時側(cè)根數(shù)目增多為野生型3.2倍以上，5g·l-1側(cè)根長度為野生型的4.0倍左右。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。sequencelisting<110>浙江農(nóng)林大學(xué)<120>巨桉egrzfp6在提高植物在滲透脅迫下適應(yīng)脅迫的用途<130><160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列<400>1cggggtacctcaacgacattctcttcagca30<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列<400>2gctctagacaggagcaaggcatctatct28<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列<400>3cggggtaccgaaaaggcaccccacaaa27<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列<400>4gctctagacctaaactcagtcggtccaaa29<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<400>5tgcccatcgggtaattcatagttc24<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6cctcatgccatcctccgtctt21<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7atcccaagatgcacgagtgctc22<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8cggaccaaccacgaaaatctca22當前第1頁12