玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIF3.2基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIF3. 2基因的功能及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 全球干旱、半干旱地區(qū)約占耕地面積的一半，這些地區(qū)水分供應(yīng)不足，森林植被疏 稀，生態(tài)環(huán)境惡化，水土流失嚴重，自然災(zāi)害頻繁。即使在土壤水分充足的情況下，水分虧缺 也常常會發(fā)生，從而影響到光合作用、物質(zhì)運輸、蛋白質(zhì)合成和細胞伸長等生理過程。干旱、 高鹽會造成植物不同程度的脫水，引起植物體內(nèi)一系列的生理代謝變化，所以又將干旱、高 鹽等非生物脅迫稱為水分脅迫，或滲透脅迫。植物應(yīng)答滲透脅迫的過程是一個涉及到多基 因、多信號途徑、多基因產(chǎn)物的復(fù)雜過程，大體上可將這些基因及其表達產(chǎn)物分成兩類，即 功能蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。功能蛋白是指在抵抗?jié)B透脅迫中直接起作用的蛋白質(zhì)；而調(diào)節(jié)蛋白 是在逆境中參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或調(diào)控基因表達，間接起保護作用的蛋白，主要包括：傳遞信 號和調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子等。
[0003] 植物在逆境脅迫下可誘導(dǎo)合成大量抗逆的化合物和蛋白質(zhì)，這些與抗逆境相關(guān)的 化合物和蛋白質(zhì)又受轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控.轉(zhuǎn)錄因子可以通過與順式作用元件 結(jié)合，啟動抗逆相關(guān)功能基因的轉(zhuǎn)錄，通過抗逆功能基因的表達使植物作出適應(yīng)逆境脅迫 的代謝調(diào)整。近年來，在提高作物抗逆性的分子育種中，研究重點已逐漸從改良個別基因 轉(zhuǎn)到改良或增強一個或多個發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子上，這樣能促使多個功能基因發(fā)揮作 用，以期獲得綜合抗逆性狀改良的植物。
[0004] 植物PIFs家族轉(zhuǎn)錄因子能夠與CANNTG序列（又稱E-b0X)發(fā)生特異性作用，調(diào)節(jié) 啟動子中含E-box元件的功能基因或調(diào)控基因的表達，從而參與植物的各種抗逆性反應(yīng)。 目前有關(guān)PIFs家族轉(zhuǎn)錄因子的研究大部分來自擬南芥，而其它物種的研究報道不多。
[0005] 本發(fā)明以玉米為研究材料，以擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子PIF3為查詢序列，同源搜索玉 米核苷酸數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)的方法找到玉米中的PIF3轉(zhuǎn)錄因子基因。
[0006] 擬南芥轉(zhuǎn)錄因子PIF3是能與光敏色素直接相互作用的信號因子，通過與被光活 化的光敏色素相互作用將光信號傳導(dǎo)下去，即在光信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。有關(guān)PIF3的研究 報道主要與光信號路徑相關(guān)，未有其在非生物脅迫中的研究報道。ZmPIF3和ZmPIF3. 2是以 擬南芥中PIF3為查詢序列，由玉米核苷酸數(shù)據(jù)庫中得的兩個與PIF3高度同源的序列，設(shè)計 引物并克隆獲得后，將其命名為ZmPIF3和ZmPIF3. 2。它們的序列尚未公布報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIF3. 2基因的序列及功能，并進一步公開 了該基因的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明通過對ZmPIF3. 2基因在玉米受干旱及高鹽脅迫時的表達模式判斷，該基 因可能參與植物抗逆途徑。根據(jù)該基因的序列設(shè)計引物，利用RT-PCR技術(shù)從玉米品種鄭單 958 (購于揚州田源種業(yè)公司）總cDNA中擴增得到ZmPIF3. 2基因。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化 到野生型水稻植株中，并研究其在水稻體內(nèi)的抗逆功能，為ZmPIF3. 2基因在其他植物上的 應(yīng)用提供了很好的基礎(chǔ)。
[0009] 玉米ZmPIF3. 2基因，其序列如SEQIDN0. 5所示。它所編碼的蛋白的氨基酸序列 如SEQIDN0. 6 所示。
[0010] 本發(fā)明所述的玉米ZmPIF3. 2基因可用于植物轉(zhuǎn)化，提高植物的耐旱耐鹽能力。
[0011] 本發(fā)明還公開了一種提高植物耐旱耐鹽能力的方法，即利用玉米ZmPIF3. 2基因 轉(zhuǎn)化目標植物，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0012] 所述的提高植物耐旱能力的方法，包括下述步驟：
[0013] (1)獲得玉米轉(zhuǎn)錄因子基因ZmPIF3. 2核酸序列及氨基酸序列，
[0014] (2)用RT-PCR獲得玉米ZmPIF3. 2基因片段，
[0015] (3)利用電擊法將帶有ZmPIF3. 2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，
[0016] (4)將帶有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化目標植物，得到轉(zhuǎn)基因植物。
[0017]本發(fā)明根據(jù)玉米基因組序列（KJ727969)設(shè)計如下引物：
[0018]F:5' -ATGTCCGACAGCAACGACT-3'（SEQIDNO. 1)，
[0019]R:5'-CTATTTTTGTAGTATTTGTGGATCTC-3'（SEQIDNO. 2)。
[0020] 利用RT-PCR技術(shù)從玉米鄭單958總cDNA中擴增得到ZmPIF3. 2基因全長cDNA(開 放閱讀框部分）。經(jīng)測序表明為PIFs家族轉(zhuǎn)錄因子，ZmPIF3. 2的全長cDNA為1704bp(SEQ IDNO. 5)，編碼一個由567個氨基酸組成的蛋白（SEQIDNO:6)。
[0021] 本發(fā)明根據(jù)ZmPIF3. 2基因的cDNA序列設(shè)計如下檢測引物：
[0022] F:5'-GCAGTCGCTACTCCATCGC-3'（SEQIDN0. 3)，
[0023]R:5'-TCCTCGCATCCCACCAGAC-3'（SEQIDNO. 4)。
[0024] 檢測玉米經(jīng)過PEG、NaCl、ABA和冷處理后體內(nèi)ZmPIF3. 2基因的表達情況。
[0025] 結(jié)果表明ZmPIF3. 2受PEG、NaCl、ABA和冷誘導(dǎo)表達。
[0026] 本發(fā)明將含ZmPIF3. 2的質(zhì)粒經(jīng)Bglll+EcoRI雙酶切后，利用DNA回收試劑盒回收 1704bp(SEQIDN0. 5)左右的DNA片段，將此片段與相應(yīng)酶切的plOll載體相連構(gòu)建成一個 新的載體，命名為pl〇ll_ZmPIF3. 2。
[0027] 本發(fā)明利用電擊法將構(gòu)建好的雙元載體pl011_ZmPIF3. 2導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，根 癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ZmPIF3. 2基因轉(zhuǎn)化到水稻中，對目標植物轉(zhuǎn) 基因陽性苗進行鑒定，對目標植物轉(zhuǎn)基因T2代陽性純合植株的篩選；對轉(zhuǎn)基因純合植株進 行抗逆分析；驗證了轉(zhuǎn)基因水稻對干旱、高鹽脅迫的耐受能力得到提高。
[0028] 本發(fā)明的ZmPIF3. 2基因是能夠針對性調(diào)控植物耐旱和耐高鹽能力提高的轉(zhuǎn)錄因 子基因；且該抗逆基因來自植物本身，對環(huán)境影響較小。
[0029] 本發(fā)明通過對ZmPIF3. 2基因轉(zhuǎn)化水稻進行該基因的功能研究，獲得效果如下： [0030] 1.獲得了對干旱及高鹽脅迫有較高耐受性的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0031] 2.ZmPIF3. 2基因具有抵抗干旱和高鹽脅迫逆境的功能，為利用該基因在其他植物 上的應(yīng)用而提高植物抗逆性提供了理論依據(jù)及利用價值。
【附圖說明】
[0032] 圖lZmPIF3. 2與擬南芥PIF3家族轉(zhuǎn)錄因子保守區(qū)的氨基酸序列同源性比對。
[0033] 圖2ZmPIF3. 2與擬南芥PIFs轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比對后所作進化樹。
[0034] 圖3ZmPIF3. 2基因在PEG、NaCl、ABA和低溫條件下的誘導(dǎo)表達譜變化情況。
[0035] 圖4ZmPIF3. 2轉(zhuǎn)基因水稻1~2代純合株系內(nèi)熒光定量檢測。WT:野生型；VC:空載 體；0E1-0E11 :ZmPIF3. 2 轉(zhuǎn)基因水稻。
[0036] 圖5ZmPIF3. 2轉(zhuǎn)基因水稻在溶液中的耐旱性研究。WT:野生型；VC :空載體；0E1、 0E3、0E7 :ZmPIF3. 2 轉(zhuǎn)基因水稻。
[0037] 圖6ZmPIF3. 2轉(zhuǎn)基因水稻在土壤中的耐旱性研究。WT:野生型；VC :空載體；0E1、 0E3、0E7 :ZmPIF3. 2 轉(zhuǎn)基因水稻。
[0038] 圖7ZmPIF3. 2轉(zhuǎn)基因水稻在溶液中的耐鹽性研究。WT:野生型；VC :空載體；0E1、 0E3、0E7 :ZmPIF3. 2 轉(zhuǎn)基因水稻。
[0039] 圖8ZmPIF3. 2轉(zhuǎn)基因水稻在土壤中的耐鹽性研究。WT:野生型；VC :空載體；0E1、 0E3、0E7 :ZmPIF3. 2 轉(zhuǎn)基因水稻。
【具體實施方式】
[0040] 實施例1 :玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIF3. 2核苷酸序列及氨基酸序列的獲得
[0041]登陸公共數(shù)據(jù)庫NCBI主頁（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，搜索到擬南芥中 轉(zhuǎn)錄因子PIF3的氨基酸序列，以此氨基酸序列為查詢探針，獲得了一個玉米中高