類人胸腺肽α1基因序列、類人胸腺肽α1及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種類人胸腺肽a1基因序列、類 人胸腺肽a1及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胸腺肽a1最早是由Goldstein等從牛胸腺素組分5 (TF5)中分離出來(lái)的，是一 種胸腺內(nèi)分泌細(xì)胞與胸腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種高度保守的活性肽。在體內(nèi)胸腺肽a1是 由a1-胸腺肽原（prothymosine)經(jīng)酶解加工而成，成熟的胸腺肽a1含有28個(gè)氨基酸， 其氨基酸序列為：Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-L eu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn，分子量為 3. 108KD，等電點(diǎn)為 4. 2。
[0003] 胸腺肽a1在人體血清中的正常濃度大約為540~670pg/mL，其主要生理功能為調(diào) 節(jié)人體免疫機(jī)能，包括刺激多能干細(xì)胞分化為胸腺細(xì)胞，促進(jìn)T-細(xì)胞的分化和成熟，增強(qiáng)T 細(xì)胞的功能，并使CD3+和CD4+等細(xì)胞的數(shù)量升高等。胸腺肽a1作為一種廣譜的免疫調(diào)節(jié) 齊U，臨床結(jié)果已顯示其對(duì)乙型肝炎和丙型肝炎有顯著的療效，對(duì)腫瘤和艾滋病也有一定療 效。此外胸腺肽a1還可用于疫苗的輔助藥劑，以增強(qiáng)免疫機(jī)能底下的患者對(duì)疫苗的應(yīng)答 能力。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，胸腺肽a1的制備大多是從動(dòng)物胸腺中提取，但是由于提取物為混 合物，有效成分濃度低，療效不夠理想，而且混合物中含動(dòng)物蛋白，注射時(shí)可能引起過(guò)敏反 應(yīng)。也有采用化學(xué)方法合成來(lái)制備胸腺肽a1的，但其主要問(wèn)題是成本高昂，難以推廣應(yīng) 用。例如藥品名為"日達(dá)仙"的胸腺肽al制品，每只含量?jī)H1. 6mg，而價(jià)格卻高達(dá)700元以 上，一個(gè)療程就需要5萬(wàn)多元，這讓普通病人難以承受，而且化學(xué)藥品制備過(guò)程中難免會(huì)出 現(xiàn)污染問(wèn)題，因而限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。
[0005] 近年來(lái)也有研究人員試圖通過(guò)基因工程的方法來(lái)制備胸腺肽a 1，通過(guò)基因工程 的應(yīng)用，雖然在體外成功表達(dá)了胸腺肽a1，但制備過(guò)程中所獲得的重組蛋白需要經(jīng)過(guò)親和 層析、離子交換層析、酶切等步驟，而且產(chǎn)量低，純化困難，并不適合批量化、工業(yè)化生產(chǎn)，因 而有必要繼續(xù)探索并改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種類人胸腺肽a1基因序列、類人胸腺肽a1及其制備方 法；類人胸腺肽a1基因序列所編碼翻譯的類人胸腺肽a1具有與人胸腺肽a1相同的功 能；所提供的類人胸腺肽a1的制備方法可以在短時(shí)間內(nèi)較為簡(jiǎn)捷、快速地獲得大量的類 人胸腺肽a1，從而替代人胸腺肽a1的使用，降低其使用成本。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0008] 類人胸腺肽a 1的基因序列，其序列如序列表中序列1所示，具體為： 5'-CTGCTCGGCTTCTTCCACAACCTCTTTCTTTTCTTTTAAGTCTTTCGTAGTTATTTCACTGCTGGTATCG ACCGCAGCATCCGA-3'。
[0009] 類人胸腺肽a1基因序列所編碼的類人胸腺肽a1，該肽包括28個(gè)氨基酸，其氨基 酸序列如序列表序列2所示，具體為：SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEQ。
[0010] 類人胸腺肽a1在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用可以替代現(xiàn)有的人胸腺肽a1。
[0011] 所述類人胸腺肽a1的制備方法，包括以下步驟： (1)以編碼類人胸腺肽a1的基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增； 以編碼類人胸腺肽a1的基因序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，首先進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì) 目的在于在基因的C端加上限制性內(nèi)切酶BslI酶切位點(diǎn)，N端加上限制性內(nèi)切酶AlwnI酶 切位點(diǎn)，引物序列設(shè)計(jì)如下： 上游引物 5'-ATACCTAATGTCGGATGCTGCGGTCGATACCAGC-3' ； 下游引物 5' -ATACAGCATCTGCTCGGCTTCTTCCACAACCTCTT-3' ； PCR擴(kuò)增體系： 類人胸腺肽a1基因，0.liiL; 上游引物，lOOuM0. 5iiL; 下游引物，lOOuM0. 5iiL; PCR擴(kuò)增Mix，12.5iiL; 三蒸水，11. 4uL。
[0012] ?〇?擴(kuò)增程序：預(yù)變性951：5111111，951：308、601：308、721：308,30個(gè)循環(huán)， 72。。lOmin。
[0013] (2)對(duì)步驟（1)中PCR擴(kuò)增的類人胸腺肽a1基因序列進(jìn)行酶切、自連接，構(gòu)建含 有類人胸腺肽a1基因序列不同拷貝數(shù)目的重組質(zhì)粒表達(dá)載體；具體如下： ①目的基因的酶切、自連接 將步驟（1)中PCR產(chǎn)物在37°C條件下先用酶AlwnI切割4h，酶切體系為： 酶AlwnI，10000U/mL0? 5iiL， CutSmartBuffer(隨酶提供），2uL; 步驟（1)中PCR產(chǎn)物，10iiL; 三蒸水，7. 5iiL。
[0014] 酶切完成后將溫度逐漸升高到55°C，再在原有體系中加入0.5iiL酶BslI (20000U/mL)切割lh。
[0015] 膠回收雙酶切后目的基因備用，所述目的基因即類人胸腺肽a1基因。
[0016]用T4DNA連接酶連接目的基因使其頭尾相連，連接體系為： 10XT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液，2i!L; T4DNA連接酶，350U/iiL1iiL; 膠回收后的目的基因片段，0.lug/mL17iiL; 連接溫度為4°C，時(shí)間為24h。
[0017] ②自連的目的基因與質(zhì)粒載體Pet_31b( + )連接構(gòu)建含有類人胸腺肽a 1基因 序列不同拷貝數(shù)目的重組質(zhì)粒載體（由于目的基因自連時(shí)，自連接數(shù)目的不確定性，一般會(huì) 有2~6個(gè)數(shù)目的目的基因的自連，因而是可以構(gòu)建含有不同拷貝數(shù)目的重組質(zhì)粒表達(dá)載體 的）； 酶AlwnI酶切質(zhì)粒載體Pet-31b(+)，酶切體系為： 酶AlwnI，10000U/mL0? 5iiL; CutSmartBuffer(隨酶提供），2uL; 質(zhì)粒載體Pet-3lb(+)，0? 2iig/iiL6uL； 三蒸水，lL5iiL; 切割時(shí)間為4h，溫度為37°C。
[0018] 酶切后質(zhì)粒載體Pet-31b(+)用堿性磷酸酶CIAP處理防止載體自連，處理體系 為： 酶切后載體，17uL; 堿性磷酸酶CIAP，10~30U/iiL1iiL; 10X堿性磷酸酶緩沖液，2yL。
[0019] 將堿性磷酸酶處理后質(zhì)粒載體與步驟①中自連后的目的基因用T4DNA連接酶 16°C連接過(guò)夜，連接體系為： 步驟①中自連后目的基因，9iiL; 堿性磷酸酶處理后的質(zhì)粒載體，8yL; 10XT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液，2iiL; T4DNA連接酶，350U/iiL1iiL。
[0020] (3)轉(zhuǎn)化、篩選；將步驟（2)所構(gòu)建的攜帶有不同拷貝數(shù)目的類人胸腺肽a1基因 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，篩選并測(cè)序鑒定； 將步驟（2)連接好的攜帶有不同拷貝數(shù)目（一般而言為2~6個(gè)拷貝數(shù)目，優(yōu)選4個(gè)拷貝 數(shù)目）的類人胸腺肽a1基因質(zhì)粒載體連接體系，加入到1〇〇ULJM109感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)胞 濃度大約5X107個(gè)/mL)中，迅速置冰上30min，42°C熱激90s，迅速放于冰上2min，涂于含 100Pg/mL氨芐青霉素LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0021] 菌落PCR鑒定，并測(cè)序鑒定。
[0022] (4)重組質(zhì)粒載體的改造；對(duì)步驟（3)中篩選測(cè)序正確的重組質(zhì)粒載體進(jìn)行改造 以去除會(huì)使目的蛋白形成包涵體的KSI (ketosteroid isomerase)。
[0023] 以步驟（3)所獲得的含4個(gè)拷貝數(shù)目的目的基因的重組質(zhì)粒載體為例，改造步驟 如下： ①PCR擴(kuò)增含有4個(gè)拷貝數(shù)目的目的基因的重組質(zhì)粒載體 設(shè)計(jì)引物： 上游引物 5 ' -AAAGGATCCGAGAAGAATAITCACGCATGCCATATGTC-3 '， 下游引物 5' -AAAGTCGACGGCITTGTTAGCAGCCGGATCTC-3'。