[0024]PCR擴(kuò)增； ② 對(duì)步驟①中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sail酶、Ndel酶雙酶切； ③ 對(duì)步驟（3)中所獲得篩選測(cè)序正確的含4個(gè)拷貝數(shù)目的重組質(zhì)粒載體進(jìn)行Xhol酶、 Ndel酶雙酶切； ④ 連接；將步驟②中酶切后的PCR片段與步驟③中酶切后的重組質(zhì)粒載體進(jìn)行連接； 需要說(shuō)明的是，由于Sail和Xhol是同尾酶，所以在連接酶作用下，上述兩種酶切片段 能夠連在一起； ⑤轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定；將步驟④中的連接體系加入100yLJM109感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)胞濃度 大約5X107個(gè)/mL)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，含100yg/mL氨芐青霉素LB平板培養(yǎng)過(guò)夜；挑選單克隆 培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證；對(duì)酶切鑒定正確的克隆的切除一個(gè)4X87bp的片段和一個(gè) 大的線性質(zhì)粒片段(即KSI片段）后再對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證是否正確連接。
[0025] (5)再轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)；將步驟（4)中改造后的重組質(zhì)粒載體再轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增質(zhì)粒并 提取，提取后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，離心收集菌 體；具體如下： 將步驟（4)中改造后的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化進(jìn)JM109感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化 進(jìn)入表達(dá)細(xì)胞，過(guò)程如下： 將1UL含有目的基因的重組質(zhì)粒載體(即步驟（4)中改造后的篩選測(cè)序正確的攜帶有 2~6個(gè)拷貝數(shù)目的類人胸腺肽a1基因質(zhì)粒載體，濃度大約〇. 3iig/iiL)加入100iiLBL21 感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)胞濃度約4X107個(gè)/mL)中，迅速置冰上30min，42°C熱激90s，迅速放于冰 上2min，涂于含100iig/mL氨芐青霉素LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0026] 挑選單克隆接種于5mL含100iig/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng) 過(guò)夜。培養(yǎng)結(jié)束后取lmL加入lOOmL含100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò) 大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（0D_=0. 6)加入終濃度為0. 2mM的IPTG(異丙基硫代半乳糖苷）誘 導(dǎo)6h，5000g離心10分鐘收集菌體。
[0027] (6)串聯(lián)體類人胸腺肽a 1的純化；將步驟（5)所收集的菌體，沸水中煮沸，離心收 集上清，即為類人胸腺肽a1串聯(lián)體懸液； PBS重懸步驟（5)收集的菌體，沸水中水浴20分鐘，8000g離心15分鐘，收集上清，即 為高純度的類人胸腺肽a1串聯(lián)體懸液。
[0028] (7)切割獲得類人胸腺肽a1蛋白（即類人胸腺肽a1蛋白單體);將步驟（6)所得 類人胸腺肽a1串聯(lián)體懸液用溴化氰切割得類人胸腺肽a1蛋白，即類人胸腺肽a1蛋白 單體； 在步驟（6)的類人胸腺肽a1串聯(lián)體懸液中緩慢加入濃鹽酸，使終濃度達(dá)到3~4M，接著 在混合液中加入溴化氰，避光，密封，常溫，在搖床上搖12h。
[0029] 加水終止切割反應(yīng)，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入PBS重懸蒸干后的膠狀物質(zhì)，緩慢加 入碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8左右，干燥后即可得到類人胸腺肽al蛋白單體；所述干燥 為丙酮干燥或者冷凍干燥。
[0030]本發(fā)明的技術(shù)原理是：類人胸腺肽a1的氨基酸序列與人胸腺肽a1的氨基酸序 列相比，類人胸腺肽a1的序列的尾部最后一個(gè)氨基酸為谷氨酰胺，而人胸腺肽a1的尾部 最后一個(gè)氨基酸為天冬酰胺。通過(guò)人工合成相應(yīng)的類人胸腺肽a1基因序列，通過(guò)基因工 程技術(shù)手段將其連接轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，獲得重組的、高拷貝的類人胸腺肽a1基因 序列，進(jìn)一步通過(guò)誘導(dǎo)、表達(dá)，簡(jiǎn)單的沸水浴、離心后，即可同時(shí)獲得大量的類人胸腺肽a1 蛋白串聯(lián)體序列，進(jìn)一步通過(guò)溴化氰切割即可獲得大量的類人胸腺肽a1蛋白單體，具有 產(chǎn)量高、純度高、制備步驟簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
[0031]本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)手段改造、合成相關(guān)基因序列，并將其轉(zhuǎn)化、重組進(jìn)入表 達(dá)細(xì)胞，由于可以同時(shí)獲得多拷貝的基因序列，因而進(jìn)一步誘導(dǎo)、表達(dá)相關(guān)蛋白時(shí)，可同時(shí) 獲得大量的蛋白串聯(lián)體序列，進(jìn)一步地通過(guò)簡(jiǎn)單的水浴、離心等技術(shù)手段即可獲得高純度 的串聯(lián)的類人胸腺肽a1蛋白，將串聯(lián)的類人胸腺肽a1蛋白經(jīng)溴化氰切割后即可獲得高 純度的、一致的類人胸腺肽a1單體。
[0032] 本發(fā)明所提供的類人胸腺肽a 1單體與人胸腺肽a 1結(jié)構(gòu)上類似，生物學(xué)功能相 同，因此完全可以替代人胸腺肽a1的使用，對(duì)于推廣人胸腺肽a1的使用及降低其使用成 本具有較為重要的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)本發(fā)明所提供的類人胸腺肽a1的制備方法，具有產(chǎn)量 高、純度高、制備方法簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)，因而適于批量化推廣應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為含4個(gè)拷貝目的基因質(zhì)粒載體的測(cè)序結(jié)果，圖中右側(cè)圖片為左側(cè)的續(xù)圖； 圖2為含4個(gè)拷貝的目的基因表達(dá)后的SDS-PAGE分析結(jié)果；其中1 :低分子量蛋白 Marker;2、3 :切割濃縮后的類人胸腺肽a1單體；4、5 :切割后未經(jīng)濃縮的類人胸腺肽a1 單體；6 :沸水浴后的囷體總蛋白；7 :囷體總蛋白； 圖3為高效液相色譜法（HPLC)對(duì)類人胸腺肽a1單體和對(duì)比樣品日達(dá)仙的測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。
[0035] 介紹具體實(shí)施例前，對(duì)本發(fā)明中所涉及的主要儀器設(shè)備和試劑介紹如下： 高效液相色譜儀購(gòu)自Agilent公司； PCR儀、PCR擴(kuò)增Mix、堿性磷酸酶CIAP(AlkalinePhosphatase)、T4DNA連接酶、質(zhì)粒 小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司； 類人胸腺肽a1基因和PCR引物合成自Genewiz(北京）公司； 表達(dá)載體Pet_31b(+)質(zhì)粒載體購(gòu)自Novagen公司； 各限制性核酸內(nèi)切酶試劑、DNAmarker、大腸桿菌JM109和BL21感受態(tài)均購(gòu)自Biolabs公司； 低分子量蛋白marker購(gòu)自索萊寶公司； 溴化氰購(gòu)自Aladdin公司； 日達(dá)仙(一種人用化學(xué)合成胸腺肽a1注射制劑）購(gòu)自SciGlone公司； 綿羊紅細(xì)胞購(gòu)自鄭州益康生物工程有限公司； 小牛血清購(gòu)自BiologicalIndustries公司。 實(shí)施例
[0036] 類人胸腺肽a 1的基因序列，該序列為： 5'-CTGCTCGGCTTCTTCCACAACCTCTTTCTTTTCTTTTAAGTCTTTCGTAGTTATTTCACTGCTGGTATCG ACCGCAGCATCCGA-3'。在本實(shí)施例中，所用類人胸腺肽a1序列由Genewiz(北京）公司合 成提供。
[0037]類人胸腺肽a 1基因序列所編碼的類人胸腺肽a 1，屬于一種多肽，包括28個(gè)氨基 酸，其氨基酸序列為，SDAAVDTSSEIITKDLKEKKEVVEEAEQ。
[0038] 所述類人胸腺肽a 1的制備方法，包括以下步驟： (1)以編碼類人胸腺肽a1基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增； 以編碼類人胸腺肽a1基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，首先進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)目的 在于在基因的C端加上限制性內(nèi)切酶BslI酶切位點(diǎn)，N端段加上限制性內(nèi)切酶AlwnI酶切 位點(diǎn)，引物序列設(shè)計(jì)如下： 上游引物 5'-ATACCTAATGTCGGATGCTGCGGTCGATACCAGC-3' ； 下游引物 5' -ATACAGCATCTGCTCGGCTTCTTCCACAACCTCTT-3' ； PCR擴(kuò)增體系： 類人胸腺肽a1基因，0.liiL; 上游引物，lOOuM0. 5iiL; 下游引物，lOOuM0. 5iiL; PCR擴(kuò)增Mix，12.5iiL; 三蒸水，11. 4uL。
[0039] ?〇?擴(kuò)增程序：預(yù)變性951：5111111，951：308、601：308，721：308,30個(gè)循環(huán)， 72。。lOmin。
[0040] (2)酶切、自連接；構(gòu)建含有類人胸腺肽a1基因序列不同拷貝數(shù)目的重組質(zhì)粒表 達(dá)載體； ①目的基因自連 將步驟（1)中PCR產(chǎn)物在37°C條件下先用酶AlwnI切割4h，酶切體系為： 酶AlwnI，10000U/mL0? 5iiL， CutSmartBuffer(隨酶提供），2uL; 步驟（1)中PCR產(chǎn)物，lOiiL; 三蒸水，7. 5iiL。
[0041] 酶切完成后將溫度逐漸升高到5