一種獲得山羊mef2c基因新轉(zhuǎn)錄剪切體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種獲得山羊基因新轉(zhuǎn)錄剪 切體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 量F光基因D參與調(diào)控細胞增殖和肌肉分化的重要 調(diào)節(jié)因子，屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MADS-Box家族成員之一(該家族成員還包括：MCMI、AGAM0US、 DEFICIENS和SRF)。MEF2C基因是MEF2基因家族中，在骨骼肌中表達最早的基因，在細胞分 化過程必不可少，控制著肌細胞分化過程中的基因轉(zhuǎn)錄。MEF2轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)主要分為N 端和C端，其N端在不同物種中幾乎相同，都含有一個MADS-box結(jié)構(gòu)域和與其直接相鄰的 MEF2結(jié)構(gòu)域。
[0003] MADS-box是含有57個氨基酸的DNA結(jié)合區(qū)域，具有高度保守性，擁有一些不變的 殘基，能與富含A/TDNA序列結(jié)合，并介導(dǎo)MADS-box因子的二聚化；MEF2結(jié)構(gòu)域由MADS-box 臨近的29個氨基酸組成，是MEF2因子所特有的結(jié)構(gòu)域，其主要功能是有助于提高DNA結(jié)合 的親和力和蛋白質(zhì)的二聚化，同時也為MEF2與其它輔因子間相互作用提供場所。MEF2的 C末端是一個轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，含有磷酸化位點，是多種激酶的靶點，與啟動基因表達有關(guān)，是其 活性調(diào)節(jié)及發(fā)揮功能的主要區(qū)域，由Pre-mRNA選擇性拼接形成不同的剪接體。由于該轉(zhuǎn)錄 活性區(qū)域由選擇性拼接產(chǎn)生，因此，無論從它的基因結(jié)構(gòu)或其蛋白質(zhì)的形式都決定了MEF2C 功能上的復(fù)雜性。
[0004] 目前，NCBI記載的人MEF2C剪接體有6種，在豬發(fā)現(xiàn)2種剪接體，鴨2種剪接體。 目前在山羊上還未見有關(guān)MEF2C基因不同轉(zhuǎn)錄剪切體的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供山羊基因的新轉(zhuǎn)錄剪切體、其擴增引物及擴增方 法。
[0006] 本發(fā)明所述的山羊撒F光基因，有三種轉(zhuǎn)錄剪切體撒Fi^-AS1，撒FI-AS2和 撒Fi^-AS3,其核苷酸序列分別如SED ID N0. 1，SED ID N0. 2和SED ID N0. 3所示。
[0007] 本發(fā)明提供了用于擴增山羊基因的一組擴增引物： 正向引物MEF2C-F的核苷酸序列如SED ID N0. 4所示； 反向引物MEF2C-R的核苷酸序列如SED ID NO. 5所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種擴增山羊撒FI基因，包括三種轉(zhuǎn)錄剪切體撒Fi^-AS1， MFi^-AS2和MFi^-AS3的方法，步驟如下： 步驟1 :提取山羊肌肉組織的總RNA ; 步驟2 :從近緣物種人，小鼠，牛和綿羊基因序列中分析保守序列，以此作為參考 來設(shè)計所述引物； 步驟3:以步驟1所得總RNA為模板，PCR擴增獲得山羊基因的片段。
[0009] 對所得序列用NCBI網(wǎng)站進行blastn在線分析，與量序列一致性最高的序列 都是在哺乳動物中的同源序列，可以確定所得序列為山羊基因。
[0010] 利用ClustalxV2. 0軟件對山羊撒F光基因（包括三種轉(zhuǎn)錄剪切體撒Fi^-ASl， 麗Fi^-AS2和麗FJ?C-AS3)的核苷酸序列進行比對分析并使用MEGA5. 2軟件構(gòu)建NJ樹。
[0011] 本發(fā)明以山羊肌肉組織為材料，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR)，對山羊 基因進行了研究，首次從山羊肌肉組織中克隆得到了 基因三種轉(zhuǎn)錄剪切體 (iffiTHS1，和)，并對其同源性和進化地位進行了分析，對研究 山羊基因不同轉(zhuǎn)錄剪切體在肌肉生長發(fā)育過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能具有重要意 義。
【附圖說明】
[0012] 序列表SEQIDN0:1是本發(fā)明克隆的山羊#你況'基因的轉(zhuǎn)錄剪切體1序列片 段。
[0013] 序列表SEQIDN0 :2是本發(fā)明克隆的山羊#你況'基因的轉(zhuǎn)錄剪切體2序列片 段。
[0014] 序列表SEQIDN0 :3是本發(fā)明克隆的山羊#你況'基因的轉(zhuǎn)錄剪切體3序列片 段。
[0015] 圖1:山羊MFI基因不同轉(zhuǎn)錄剪切體PCR產(chǎn)物電泳檢測圖。
[0016] 圖2:山羊基因不同轉(zhuǎn)錄剪切的示意圖。
[0017] 圖3:近緣哺乳動物基因編碼區(qū)序列的NJ系統(tǒng)進化樹。 具體實施方案
[0018] 以下結(jié)合附圖，通過實施例對本發(fā)明進一步詳細說明。
[0019] 本發(fā)明中山羊采自四川省南江黃羊育種場，RNA提取純化等試劑購自Invitrogen 公司，PCR試劑購自寶生物(大連）有限公司（Takara)。
[0020] 總RNA提?。喝?00mg山羊肌肉組織在研缽中加液氮研磨，用Trizol法提取總 RNA，Trizol試劑購自Invitrogen公司，提取方法根據(jù)使用說明書。
[0021] 山羊量基因序列的克隆，包括三個轉(zhuǎn)錄剪切體量72C-AS1，量72C-AS2和 MEF2C-KS3： 通過比對已公開的近緣哺乳動物(人、小鼠、牛和綿羊）的基因序列得到保守區(qū)， 在保守區(qū)序列設(shè)計引物擴增山羊基因。
[0022] 山羊量基因的克?。?使用正向外引物MEF2C-F與反向外引物MEF2C-R進行PCR擴增，獲得山羊撒基因 的目的片段； MEF2C-F:5' -TTACGAGGATTATGGATGAACG-3' MEF2C-R:5'-GGGGTGGTGGTACGGTCT-3' 擴增反應(yīng)體系如下：
【主權(quán)項】
1. 作為山羊MEF2C基因的轉(zhuǎn)錄剪切體，它們的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1，SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 所述。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因片段，其特征在于：其中SEQ ID NO :1片段完全缺失第 四外顯子序列；；SEQ ID NO :2片段完全缺失第三外顯子序列；SEQ ID NO :3完全缺失第三 和第四外顯子序列。
3. 檢測權(quán)利要求1所述遺傳標記的正、反向引物的DNA序列如下所示： MEF2C-F :5'- TTACGAGGATTATGGATGAACG-3' MEF2C-R:5'-GGGGTGGTGGTACGGTCT-3'。
4. 制備如權(quán)利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步驟： 利用NCBI數(shù)據(jù)庫信息，比對人、小鼠、牛和豬MEF2C基因得到保守區(qū)，在保守區(qū)設(shè)計引 物擴增山羊基因，提取山羊肌肉組織RNA，設(shè)計引物，PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和測序， 獲得如序列表SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所述的核苷酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種獲得山羊MEF2C基因三種轉(zhuǎn)錄剪切體的方法。首先從南江黃羊肌肉組織中分離出核糖核酸；設(shè)計特定的引物，利用PCR擴增出cDNA片段。經(jīng)過克隆和測序分析證實了在山羊MEF2C基因轉(zhuǎn)錄過程中存在3種剪切形式，包含外顯子的缺失。這一發(fā)現(xiàn)為研究山羊MEF2C基因的表達及功能究奠定了重要基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15-10, C12N15-12, C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104593375
【申請?zhí)枴緾N201310529631
【發(fā)明人】沈并兵, 占思遠, 李利, 張紅平, 王林杰, 仲濤
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2013年11月1日