專利名稱：Scirr69基因、調(diào)節(jié)bdnf轉(zhuǎn)錄及在生物醫(yī)學(xué)研究、生物治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。特別涉及SCIRR69基因、調(diào)節(jié)BDNF轉(zhuǎn)錄及在生 物醫(yī)學(xué)研究、生物治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用；具體涉及一種從大鼠分離的脊髓損傷 修復(fù)相關(guān)基因及其編碼蛋白，脊髓損傷修復(fù)過程中起作用的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼序列。
背景技術(shù)：
脊髓損傷后的修復(fù)成為亟待解決的世界性難題。近年來，關(guān)于脊髓損傷修復(fù) 分子機(jī)理的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展[1"，這些研究為重新認(rèn)識脊髓損傷并提供有 針對性的干預(yù)手段奠定了基礎(chǔ)。例如，人們通過認(rèn)識Nogo分子w對神經(jīng)再生的抑 制作用，根據(jù)其結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的抗體，用以阻斷Nogo對神經(jīng)再生的抑制，使 動(dòng)物損傷后的修復(fù)效果有了明顯改善w。根據(jù)Nogo分子及其受體的結(jié)構(gòu)，通過酵 母雙雜交技術(shù)篩選出多種阻斷Nogo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多肽[5—6]，用這些多肽消除 Nogo分子對脊髓損傷后再生的抑制作用，取得了矚目的效果。由于脊髓損傷修復(fù) 過程涉及相當(dāng)多的基因，它們之間的相互作用錯(cuò)綜復(fù)雜，雖然目前對損傷修復(fù)分 子機(jī)理的認(rèn)識有了較大進(jìn)步，但脊髓損傷修復(fù)的分子機(jī)理還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有搞清楚[7—9]。 至于脊髓損傷修復(fù)過程中起作用的轉(zhuǎn)錄因子，了解的更少。
發(fā)明內(nèi)窖
本發(fā)明的目的是提供一種SCIRR 69基因、調(diào)節(jié)BDNF轉(zhuǎn)錄及在生物醫(yī)學(xué)研究、 生物治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用。其目的之一是提供在脊髓損傷修復(fù)過程中起作用的 轉(zhuǎn)錄因子及其編碼序列。
本發(fā)明的另一目的是提供上述蛋白或各種剪切長度的蛋白在制備治療神經(jīng) 損傷、老年癡呆、巴金森氏病等神經(jīng)退行性變疾患以及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥 物或研究、診斷試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述蛋白質(zhì)作為抗原的應(yīng)用以及利用所述抗原 制備的抗體。
本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)錄因子是一種如下(a)或(b)所述的蛋白質(zhì)-.
(a) 具有序列表中SEQ ID NO. 1(圖4)所述的氨基酸序列，
(b) 在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代,缺失或疊加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生 的蛋白質(zhì)，且與(a)的蛋白質(zhì)具有相同的功能，所述功能是作為BDNF的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 因子,所述BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員。
脊髓損傷修復(fù)過程中，在基因水平上發(fā)生一系列復(fù)雜的變化[1"]。消減雜交技 術(shù)是分離組織或細(xì)胞間差異基因的有效方法。發(fā)明人采用基于PCR的消減雜交方 法，并在經(jīng)典消減雜交的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，引進(jìn)了 Cap-finder、長距離PCR、 Biotin-dNTP、磁性分離系統(tǒng)和S印hacryl離心柱分離等技術(shù)。在建立的大鼠脊 髓全橫斷模型基礎(chǔ)上，通過改良的消減雜交技術(shù)構(gòu)建脊髓損傷后4.5天的cDNA 消減文庫，然后隨機(jī)挑取文庫中的110個(gè)克隆進(jìn)行酶切鑒定和測序，分析結(jié)果顯 示這些克隆代表了 51個(gè)ESTs。進(jìn)一步通過反向點(diǎn)雜交剔除11個(gè)假陽性克隆，最 終得到40個(gè)差異ESTs，其中32個(gè)代表已知基因，其余8個(gè)代表新基因。32個(gè) 已知基因中，包括Synuclein、 Clusterin 、 Gaa、 Vimentin、 Reticulon、 Neurofascirrn等與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、退行性病變、神經(jīng)細(xì)胞的存活及軸突延伸密 切相關(guān)的分子。其中EST-69長度為720bp (GenBank accession no. BU744264)， 它代表一個(gè)全新基因。在該EST片斷預(yù)測的編碼框內(nèi)部包含一個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)，該 結(jié)構(gòu)是轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列特異性結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域之一，提示EST-69代表的
新基因編碼產(chǎn)物可能作為轉(zhuǎn)錄因子在脊髓損傷修復(fù)過程中起一定作用，發(fā)明人將 其命名為Scirr69。
首先通過5' -RACE和3' -RACE技術(shù)克隆到該基因的完整cDNA序列，長度 為3321bp,該基因定位于大鼠染色體4q22，由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成。 我們將這一序列在Genbank進(jìn)行了登陸，獲得的登錄號為AY546001。其預(yù)測的 編碼區(qū)位于334 bp -1899 bp，編碼521個(gè)氨基酸。半定量RT-PCR及原位雜交結(jié) 果均表明，Scirr69 mRNA在損傷5天脊髓中的表達(dá)水平明顯高于對照組。
進(jìn)一步對該蛋白的優(yōu)勢表位進(jìn)行計(jì)算、分析。構(gòu)建優(yōu)勢抗原表位原核表達(dá)載 體，在原核系統(tǒng)大量誘導(dǎo)表達(dá)抗原表位。經(jīng)純化后免疫動(dòng)物，制備多克隆和單克隆抗體。ELISA檢測結(jié)果顯示制備的抗體效價(jià)均達(dá)到104以上；WB鑒定表明所述
抗體的特異性較好，而且WB檢測到的蛋白水平的表達(dá)變化趨勢與mRNA水平相一 致。
為研究該基因在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況，以地高辛標(biāo)記的RNA探針通過 小鼠胚胎整體原位雜交，結(jié)果顯示，mRNA的表達(dá)最早見于E10天的端腦與間腦的 腹側(cè)，在E11-E12天時(shí)，在端腦、間腦和后腦表達(dá)量均比較高，說明該基因可能 在胚胎發(fā)育過程中參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)。RT-PCR結(jié)果顯示，在所檢測 的成年大鼠的心、肝、脾、肺、胃、腎、胰、胸腺、大腸、小腸、骨骼肌、睪丸、 腦干、大腦、小腦、脊髓這16種組織中均存在Scirr69 mRNA較高水平的表達(dá)。 此外，Scirr69mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布十分廣泛，尤以神經(jīng)元功能活動(dòng)頻繁 的大腦皮層、丘腦、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和弓狀核、乳頭體、海馬、紅核、腦橋灰質(zhì)、 巨細(xì)胞網(wǎng)狀核等部位為多，說明該基因?qū)τ诰S持各個(gè)組織的正常功能具有普遍意 義。
計(jì)算機(jī)分析結(jié)果顯示，SCIRR69蛋白的296aa-357aa存在一個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)，379 aa-398 aa存在一個(gè)跨膜區(qū)。GFP共定位實(shí)驗(yàn)證明，完整的69號蛋白(laa-521aa) 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而跨膜區(qū)缺失突變體(laa-375aa)則定位于細(xì)胞核。據(jù)此推測， 69號蛋白在一定條件下在跨膜區(qū)發(fā)生切割，然后N端進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作 用。為確定SCIRR69是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性，我們將其與GAL4-DBD融合表達(dá)， 與pFR-Luc報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCIRR69蛋白可顯著激活報(bào) 告基因螢火蟲熒光素酶的表達(dá)(約為陰性對照的20倍)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu) 建一系列N端、C端缺失體尋找其轉(zhuǎn)錄激活部位(transcriptional activation domain, TAD),并最終確定其TAD位于laa-60aa。
SCIRR69蛋白屬于CREB/ATF家族的轉(zhuǎn)錄因子。正常狀態(tài)下該家族分子定位于 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上(N端朝向胞漿)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激試劑th鄰sigargin (Ca2+ATPase的抑 制劑)或timicamycin (N端糖基化的抑制劑)存在時(shí)，這些分子在跨膜區(qū)發(fā)生切 割，N端進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。但在我們的研究中，當(dāng)TG、 Tm存在時(shí)， SCIRR69蛋白并沒有發(fā)生切割，提示SCIRR69可能是通過另外的途徑被活化。用 原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元切割損傷模型，并通過SCIRR69單克隆抗體的免疫熒光標(biāo)記
檢測該蛋白的定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常神經(jīng)元中，免疫標(biāo)記特異出現(xiàn)在細(xì)胞漿中，
而在損傷神經(jīng)元中，胞漿和胞核均有標(biāo)記，尤其是在損傷后lhr和12hr這一現(xiàn) 象最為明顯，該結(jié)果表明在神經(jīng)元損傷時(shí)，SCIRR69可以在跨膜區(qū)發(fā)生切割而進(jìn) 入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。
原代神經(jīng)元表達(dá)SCIRR 69基因和蛋白。劃傷導(dǎo)致SCIRR 69編碼蛋白由細(xì)胞 質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核。但細(xì)胞核SCIRR 69蛋白陽性的神經(jīng)元與損傷線距離無正相關(guān)關(guān) 系。說明損傷不是引起SCIRR 69蛋白入核的直接因素，而可能是損傷因素導(dǎo)致 神經(jīng)元內(nèi)物質(zhì)釋放到細(xì)胞外，后者引起SCIRR 69蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。分析由神經(jīng) 元釋出的物質(zhì)最大可能包括Glu， CaCL和KC1。接著的實(shí)驗(yàn)確定了 KC1是導(dǎo)致 SCIRR69蛋白入核的關(guān)鍵因素。Western blot實(shí)驗(yàn)也證明，KC1作用原代神經(jīng)元 后導(dǎo)致SCIRR69蛋白發(fā)生切割，在50kD處出現(xiàn)一新的條帶。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)KC1 可使BDNF表達(dá)上調(diào)。說明這兩者之間可能存在特異的鏈條環(huán)節(jié)。
通過染色質(zhì)免疫沉淀及PCR方法(ChIP on PCR)證實(shí)SCIRR-69蛋白能直接 與BDNF啟動(dòng)子DNA相互作用。將構(gòu)建有BDNF啟動(dòng)子載體及SCIRR 69全長和各 截短型載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)SCIRR-69蛋白截短型與 BDNF啟動(dòng)子相互作用能明顯促進(jìn)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。再次確認(rèn)了 SCIRR 69蛋白與BDNF 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之間的關(guān)系——SCIRR 69截短型(1-378)具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄激活活性， 可以促進(jìn)BDNF轉(zhuǎn)錄。通過RNAi沉默SCIRR 69基因的表達(dá)，觀察到干擾SCIRR 69 基因后BDNF表達(dá)也出現(xiàn)相應(yīng)下調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)確認(rèn)SCIRR 69蛋白作為BDNF轉(zhuǎn)錄 因子在BDNF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。
將1-378插入pcDNA3. l表達(dá)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，培養(yǎng)12小時(shí)制備 條件培養(yǎng)液。分離新生大鼠大腦，將之剪成lmm見方的組織快。然后用條件培養(yǎng) 液培養(yǎng)。以空載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞的條件培養(yǎng)液以及BDNF作對照。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染SCIRR 69 1-378后制備的條件培養(yǎng)液具有明確的促進(jìn)皮質(zhì)組織塊神經(jīng)再生作用。
本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明所提供的SCIRR69蛋白及其突變體為BDNF新的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，確認(rèn)
SCIRR 69蛋白作為BDNF轉(zhuǎn)錄因子在BDNF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用。
BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員。SCIRR69蛋白在神經(jīng)元的生長、分化以及 軸突可塑性方面具有重要作用。SCIRR69蛋白在神經(jīng)元的生長、分化以及軸突可 塑性方面具有重要作用；特異性的抗原和基于抗原制備特異性抗體；可能用于制 備促進(jìn)BDNF轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)神經(jīng)再生，治療神經(jīng)損傷、老年癡呆、巴金森氏病等神 經(jīng)退行性變疾患的藥物；可用于制備修復(fù)脊髓損傷的藥物和研究試劑。
本發(fā)明所提供的SCIRR69蛋白結(jié)構(gòu)清楚，易于制備。同時(shí)可作為抗原制備特 異性抗體。


圖1為5' -RACE-PCR (A)和3， -RACE-PCR(B)產(chǎn)物電泳圖結(jié)果。 圖2為Scirr69 mRNA序列。加粗字體代表編碼區(qū)序列，無下劃線代表短剪 切體序列。
圖3為The cDNA sequence of SCIRR-69cDNA序列和在Gene Bank登錄結(jié)果。 圖4為SCIRR-69蛋白的氨基酸序列分析。
圖5為(A) SCIRR-69蛋白與OASIS蛋白序列比較.(B)圖顯示SCIRR-69 蛋白與其它CREB/ATF家族的亮氨酸拉鏈序列比較。
圖6為SCIRR-69蛋白與其它CREB/ATF家族的結(jié)構(gòu)比較。
圖7為(A)大鼠cDNA文庫PCR擴(kuò)增BCE 。 (B) pET-32a-BCE重組質(zhì)粒測序結(jié)果。
圖8為(A) SDS-PAGE檢測BCE重組蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)。Lane 1代表 細(xì)菌未誘導(dǎo)；Lane 2代表細(xì)菌誘導(dǎo)后；Lane 3代表細(xì)菌超聲后上清，表明重組 蛋白以可溶性形式存在；Lane 4代表細(xì)菌超聲后沉淀；Lane 5純化后重組蛋白. (B) BCE重組蛋白MALDI-TOF-MS結(jié)果。
圖9為ELISA檢驗(yàn)免疫動(dòng)物得到的抗SCIRR 69蛋白優(yōu)勢表位血清效價(jià)結(jié)果。 圖10為用Western Blot (A)和免疫熒光技術(shù)(B)檢驗(yàn)抗SCIRR 69血清。 照片al-a4為空載體轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞，可見僅熒光蛋白被顯示(al)。而 pEGFP-Nl-SCIRR-69FL轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞也被定位與細(xì)胞質(zhì)(b2)，多克隆抗體標(biāo)
記(紅色)與載體熒光蛋白定位(綠色)(bl)重合。
圖11為大鼠脊髓Western Blot分析顯不在示80kD處有一單一條帶(圖A)。 用抗SCIRR 69單克隆抗體標(biāo)記的原代神經(jīng)元熒光標(biāo)記物存在于細(xì)胞質(zhì)。標(biāo)尺 二100u m。
圖12為整體原位雜交顯示SCIRR-69mRNA在小鼠不同胚胎階段的表達(dá)。Bars
二2 mm。
圖13為RT-PCR展示SCIRR-69 mRNA在多種器官的分布。
圖14A為原位雜交技術(shù)顯不SCIRR-69 mRNA在成年大鼠大腦中的分布。
Bar=2mmc
圖MB為原位雜交技術(shù)顯示SCIRR-69 mRNA在成年大鼠腦干和小腦中的分 布。Bar=2mm。
圖14C為原位雜交技術(shù)顯示SCIRR-69 mRNA在成年大鼠脊髓不同節(jié)段中的分 布。
Bar=0. 5mm 。
圖15為昆示SCIRR 69在大鼠大腦原代培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)。Bars=]00tim.
圖16為抗SCIRR 69蛋白，抗KDEL和GFP三標(biāo)記技術(shù)展示SCIRR-69蛋白全 長及跨膜區(qū)缺失突變體的細(xì)胞內(nèi)定位。Bar二50um.
圖17為用RT-PCR (A)和Western Blot (B)技術(shù)分別展示SCIRR 69mRNA 和蛋白表達(dá)與脊髓損傷、修復(fù)的關(guān)系。
圖]8為SCIRR 69基因全長和各種缺失突變體PCR擴(kuò)增。
圖19A為TG和TM對SCIRR 69激活情況。Bar二50 u m。
圖19B為顯示原代神經(jīng)元損傷應(yīng)激前(al-a3)、后不同時(shí)間(bl-c3) ， SCIRR 69蛋白進(jìn)入細(xì)胞核Bars二50nm。
圖20為分別展示大鼠脊髓(A)和原代神經(jīng)元，(B)損傷應(yīng)激致SCIRR 69切 割入核后導(dǎo)致蛋白分子發(fā)生切割變化，表現(xiàn)在電泳圖上除了 80kD條帶外，50kD 處也出現(xiàn)一條帶
圖21為染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)SCIRR 69直接與BDNF啟動(dòng)子結(jié)合。 圖22.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)SCIRR-69蛋白截短型與BDNF啟動(dòng)子相互作用。 圖23為沉默PC 12細(xì)胞SCIRR 69基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BDNF表達(dá)也出現(xiàn)相應(yīng)下調(diào)。
圖21為SCIRR69-378截短型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞收集上清能顯著促進(jìn)胎鼠皮層組 織塊突起生長。CI:空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞收集上清；C2: PC12細(xì)胞培養(yǎng)液；C3:皮層組 織塊常規(guī)培養(yǎng)液；C4: BDNF (終濃度12. 5ng/ml); C5: SCIRR69-378截短型質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染細(xì)胞收集上清。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種SCIRR 69基因、調(diào)節(jié)BDNF轉(zhuǎn)錄及在生物醫(yī)學(xué)研究、生物治 療藥物研發(fā)中的應(yīng)用。在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā) 明的范圍。
SCIRR 69基因全長序列的獲得及分析
(1) 用Race技術(shù)獲得SCIRR 69號基因cDNA全長。(見圖1)
(2) 基因測序及拼接5' -RACE-PCR在1.2kb處有單一條帶，該條帶測序 結(jié)果能夠與EST-69拼接到一起，所以我們成功獲得了SCIRR-69的5'端序列； 3' -RACE-PCR主要有兩條擴(kuò)增帶，分別為1.5kb和1.95kb (圖1A)。測序結(jié)果 表明，1. 95Kb條帶的序列包含了 1.5Kb條帶的序列，兩者都能與EST-69拼接到 一起，而且這兩條序列都具有polyA結(jié)構(gòu)，說明SCIRR-69存在長度不同的兩個(gè) mRNA剪接體。
將5， -RACE-PCR和3， -RACE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果跟已知EST-69序列 拼接，得到該基因的完整cDNA序列。為確證該基因的存在，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì) 引物，從損傷大鼠脊髓中成功擴(kuò)增到該基因的完整cDNA序列(見圖2)。
(3) SCIRR-69 mRNA序列及分析；將EST-69代表的新基因命名為SCIRR-69 (spinal gord jjijury regeneration ^elated gene no. 塑)，并將其mRNA序 列在Genbank進(jìn)行登陸(GenBank accession no. AY546001)，詳細(xì)登陸信息見 附錄3。 SCIRR-69 mRNA較長的剪接體為3321bp (Fig. 1.2)，與之相比，較短的
剪接體在3，端polyA結(jié)構(gòu)前缺少459bp (underlined)。利用ORF finder軟件 (http:〃麗.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)預(yù)測該基因的編碼產(chǎn)物，顯 示SCIRR-69基因可信度最高的編碼框位于334bp-1899bp (bold type),編碼 521aa，起始密碼子AUG附近的核苷酸序列符合Kodak規(guī)律(A/GNNAUGG)。SCIRR-69 基因定位于大鼠染色體4q22，由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成。(見圖3) SCIRR-的蛋白的特性
對SCIRR-69蛋白序列進(jìn)行蛋白質(zhì)家族和功能結(jié)構(gòu)域分析。在297aa-357aa 存在一個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)(斜體代表堿性區(qū)，方框部分代表Leu Zipper)，其下游 379aa-398aa存在一個(gè)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)(下劃線部分)，C端存在一個(gè)Sl蛋白酶識別 位點(diǎn)(陰影部分)(圖.4)。根據(jù)這些線索，我們推測SCIRR-69蛋白是一個(gè)跨膜的 轉(zhuǎn)錄因子。對蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，搜索到兩條與SCIRR-69蛋白高度同 源的序列，它們分別是人的CREB3L2和小鼠的CREB3L2，這兩者與SCIRR-69蛋白 的同源性分別高達(dá)90%, 97%。據(jù)此推測，SCIRR-69蛋白可能相當(dāng)于大鼠的 CREB3L2。 SCIRR-69蛋白的氨基酸序列與CREB/ATF轉(zhuǎn)錄因子家族成員OASIS m 具有46.56%的同源性(圖5 A) 。 SCIRR-69蛋白bZIP結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成與該 家族多個(gè)成員都有很高的相似性，如0ASIS、 CREB-H、 CREB3和CREB4 (圖5B)。 此外，SCIRR-69蛋白的整體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與CREB/ATF家族分子相同(圖6)，它是 該家族的一個(gè)新成員。
SCIRR-69蛋白作為抗原的應(yīng)用
1. 1抗原表位的計(jì)算
為提高針對SCIRR-69抗體的特異性，避免跟其它bZIP家族分子之間的交叉 反應(yīng)，我們采用優(yōu)勢抗原表位免疫動(dòng)物制備抗體的方法。在進(jìn)行抗原表位預(yù)測時(shí)， 綜合考慮親水性、抗原性、撓性、可及性、極性、外露表面、拐角等方面的因素， 分析發(fā)現(xiàn)，SCIRR-69蛋白N端特異性較高、抗原表位分布集中，最終確定對 14aa-160aa進(jìn)行表達(dá)，將這一片段命名為BCE (B Cell Epitope)。
1.2. BCE編碼片斷的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定
采用高保真PCR從大鼠脊髓cDNA文庫中擴(kuò)增到BCE蛋白片段對應(yīng)的編碼序 列，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期一致(圖7A)。將該片段按常規(guī)分子克隆技術(shù) 插入到編碼His tag的pET-32a質(zhì)粒建立重組表達(dá)載體pET-32a-BCE。重組克隆 測序結(jié)果表明，質(zhì)粒構(gòu)建完全正確(圖7B)，可用于下一步表達(dá)實(shí)驗(yàn)。 1. 3構(gòu)建原核重組表達(dá)載體
1) 將BCE編碼片段與pET-32a質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行BamH I +Xhol I雙酶切；
2) 雙酶切的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，方法同前；
3) 雙酶切回收的BCE片段與雙酶切的pET-32a載體在T4 DNA Ligase作用 下連接；
4) 連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化新鮮制備的BL21感受態(tài)細(xì)菌；
5) 挑克隆以菌落PCR或BamH I +Xhol I雙酶切鑒定；
6) 鑒定插入片段大小正確的重組子進(jìn)行測序驗(yàn)證，插入序列完全正確的克 隆用于下一步誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
1.4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
1 )取pET-32a-BCE菌種接種于5ml LB液體(Amp+)中，37。C振蕩培養(yǎng)12-16hr;
2) 次日將過夜培養(yǎng)的飽和菌液按h IOO擴(kuò)大至LB液體(Amp+)中；
3) 培養(yǎng)至0D-0.4 0.6(大約2 3h)時(shí)，力B IPTG (終濃度為lmM)進(jìn)行誘 導(dǎo)表達(dá)；
4) 37。C誘導(dǎo)表達(dá)5hr后離心收集菌體(7700g， 4。C離心30min);
5) 將菌體進(jìn)行超聲破碎，離心后同時(shí)收集沉淀和上清以備作電泳分析；
6) SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的存在形式及豐度。 1.5重組蛋白純化
1) 誘導(dǎo)后收集的菌體稱濕重、重懸于Lysis buffer (2 5ml/g);
2) 加入溶菌酶(終濃度lmg/ml)，冰浴30min;
3) 超聲破碎菌體，lOOOOg離心30min,收集上清用于后續(xù)的分離純化；
4) 以5V Lysis buffer平衡填有Ni-NTA agarose的純化柱，流速小于 2ml/min;
5) 超聲上淸過濾后上柱，流速控制在0.5 lml/min，收集上樣流出液做SDS
一PAGE電泳分析；
6) 以5 10V Wash buffer清洗純化柱，以除去吸附和非特異性結(jié)合的蛋白， 收集流出液以備做SDS—PAGE電泳分析；
7) 以5V Elution buffer洗脫目的蛋白，分步收集洗脫產(chǎn)物，目的蛋白一 般在2V 3V時(shí)洗脫下來，洗脫得到的目的蛋白測濃度后分裝存于-7(TC備用；
8) SDS—PAGE電泳檢測每個(gè)收集管中的蛋白。
1. 6重組蛋白在原核系統(tǒng)中的大量誘導(dǎo)表達(dá)與純化
挑選測序正確的重組子，在37。C， lmM IPTG條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)5h 后，融合蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)(圖8A lane 2)，且以可溶性形式存在于超聲后上清 中(圖8Alane3)， SDS-PAGE電泳檢測到的融合蛋白分子量在42kDa左右(圖8A lane 5)，而這一蛋白的理論分子量為34kDa。由于在原核表達(dá)系統(tǒng)中不存在翻譯 后修飾，為確認(rèn)純化得到的蛋白是我們表達(dá)的BCE目的蛋白，將其進(jìn)行了 MALDI-TOF-MS鑒定，結(jié)果表明這一條帶能夠與BCE目的蛋白序列匹配(圖8B)， 證明這就是表達(dá)的BCE重組蛋白。
BCE重組蛋白帶有His tag，通過填有Ni-NTA agarose的純化柱將其分離純 化。純化后的目的蛋白純度達(dá)90%以上(圖8A lane5)，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。
1. 7融合蛋白的Thrombin酶切及目的片段的回收
以上表達(dá)、純化的重組蛋白包含了pET-32a載體自身表達(dá)的His tag端片段 和BCE目的片段，以該重組蛋白免疫動(dòng)物可能會對His tag端片段產(chǎn)生免疫應(yīng)答 從而產(chǎn)生針對BCE目的蛋白的抗體。為了在ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測針對BCE目的蛋白 的抗血清效價(jià)，我們對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行了 thrombin酶切以去除His tag端 片段，然后將BCE目的片段以Ni-NTA agarose回收用于后續(xù)ELISA實(shí)驗(yàn)。酶切 后His tag端片段由129aa組成，理論分子量為14. 2kD， BCE目的片段端由181aa 組成，理論分子量為19. 9kD， SDS-PAGE檢測到的酶切產(chǎn)物各片段大小與預(yù)期一 致。
動(dòng)物免瘇及抗缽制備免疫動(dòng)物
l)初次兔疫純化的重組蛋白與等體積弗式完全佐劑充分混勻，日本大耳白
兔背部注射簡U g蛋白/只，Balb/c小鼠腹股溝注射100 ix g蛋白/只；
2) 首次加強(qiáng)免疫初次免疫后4wks進(jìn)行首次加強(qiáng)免疫，每只日本大耳白兔 注射500 u g重組蛋白，每只Balb/c小鼠注射50 u g重組蛋白；
3) 第二次加強(qiáng)免疫首次加強(qiáng),疫后4wks進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，劑量同上；
4) 第三次免疫后7-10d取血(兔從耳緣靜脈取血，鼠從尾靜脈取血)進(jìn)行 ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測抗體的特異性及效價(jià)；
5) ELISA檢測兔抗血清效價(jià)理想時(shí)，從頸動(dòng)脈采血，采集的血液室溫斜置 30min，然后移至4'C待血清析出，收集血清后1000rpm離心10min，分裝-70。C 保存；
6) ELISA檢測小鼠抗血清特異性及效價(jià)理想時(shí)，再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫準(zhǔn)備進(jìn)
行單克隆抗體制備。
Thrombin酶切重組表達(dá)蛋白
1) 按Thrombin說明書，每毫克重組蛋白采用5ml反應(yīng)體系，室溫酶切16h;
2) 將酶切產(chǎn)物過Ni-NTA agarose純化柱，則BCE目的片段存在于流出液中， 載體自身攜帶的His tag端片段與Ni-NTA agarose結(jié)合；
3) 用洗脫液將His tag端片段洗脫下來；
4) SDS-PAGE檢測BCE目的片段與His tag端片段。
5) BCE目的蛋白定量后分裝凍存?zhèn)溆谩?ELISA法榼鍘擾血情效價(jià)
1) 稀釋抗原用CB將酶切得到的目的蛋白稀釋至所需濃度2-15l!g/ml;
2) 包被抗原于96孔板中每孔加100ul稀釋的目的蛋白，4。C包被過夜；
3) 傾盡孔中液體，PBST洗漆5minX3';
4) 封閉:加封閉液200ul/孔；37。C封閉lh，然后PBST洗5minX3，；
5) —抗反應(yīng)加入倍比稀釋的抗-SCIRR69兔血清，100ul/孔，37。C孵育lh;
6) 傾盡孔中液體，PBST洗滌5minX4';
7) 二抗反應(yīng)每孔加100ul以PBST稀釋的HRP-IgG (1: 5000)， 37。C孵育
lh;
8) 傾盡孔中液體，PBST洗滌5minX4';
9) 顯色每孔加100ul底物反應(yīng)液，于暗處室溫顯色1-5min;
10) 終止顯色合適時(shí)，每孔加50ul 2M H2S04終止反應(yīng)，測0.D450。
10)結(jié)果第三次免疫10d后，分別從日本大耳白兔和小鼠取少量血分離抗 血清，通過ELISA方法檢測抗體的效價(jià)及特異性。包被的抗原為切去His tag的 BCE目的片段。以免疫前抽取正常動(dòng)物的血清作為對照，抗原包被量為5-15 ug/ml 。經(jīng)檢驗(yàn)，兔及小鼠抗血清效價(jià)均在104以上(圖9)。
多克隆抗血清鑒定
提取脊髓組織總蛋白進(jìn)行WB，檢測BCE重組蛋白免疫的兔多克隆抗血清的特 異性。結(jié)果顯示，在80kD左右有一條帶，此外在60kD左右也有兩條清晰的帶(圖 10A)。 SCI-69蛋白的理論分子量是57kD， 60kD左右的條帶基本與之吻合。文獻(xiàn) 報(bào)道，與SCI-69蛋白具有相同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的OASIS蛋白(519aa)、ATF6蛋白(670aa) 都存在N端糖基化修飾，以它們各自特異性抗體進(jìn)行WB時(shí)，免疫印跡條帶分別 出現(xiàn)在80kD和90kD。據(jù)此分析，以多克隆抗血清檢測到的80kD左右條帶可能 SCI-69蛋白的糖基化形式。
為了檢測兔多克隆抗血清用于免疫標(biāo)記的效果，我們將構(gòu)建的GFP融合表達(dá) 載體pEGFP-N1-SCI-69轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞，以多克隆抗血清對轉(zhuǎn)染SCI-69與GFP融 合蛋白的細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-Nl的對照組細(xì)胞 未見免疫標(biāo)記(圖10Bal-a4);在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組，未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有標(biāo)記， 只有表達(dá)SCI-69蛋白的細(xì)胞才能被多克隆抗血清標(biāo)記，而且標(biāo)記信號與GFP分 布完全重疊(圖10Bbl-b4)，證明多克隆抗血清用于免疫標(biāo)記時(shí)具有較高的特異 性。
單克睹抗體制備及鑒定
為深入研究SCIRR69的功能，我們進(jìn)一步制備了單克隆抗體。單克隆抗體的 特異性及效價(jià)檢測，以脊髓組織總蛋白進(jìn)行WB檢測，免疫印跡結(jié)果顯示，在80kD 處有單一條帶(圖11A)。這與上面多克隆抗血清鑒定結(jié)果中出現(xiàn)的80kD左右條 帶相吻合，也說明該抗體具有良好的特異性。進(jìn)一步以單克隆抗體對原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元進(jìn)行免疫標(biāo)記，SCIRR-69 蛋白的標(biāo)記信號特異的出現(xiàn)在神經(jīng)元的胞漿和突起中，細(xì)胞核未見標(biāo)記，說明 SCI服-69蛋白定位于神經(jīng)元的胞漿中(圖11B)。
單克隆抗體制備步驟
1) 在融合前兩周復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，保證融合時(shí)骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期；
2) 融合前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞(小鼠腹腔巨噬細(xì)胞) ，
3) 最后一次加強(qiáng)免疫3d后，無菌條件下取出脾臟，用不完全培養(yǎng)液洗一次， 置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液；
4) 取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0， 1000rpm離心5min，棄上清，用不完全 培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次；
5) 同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次；
6) 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 : 5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi) 用不完全培養(yǎng)液洗1次，1500rpm離心5min;
7) 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)；
8) 細(xì)胞融合:lmin內(nèi)加入預(yù)熱的lml銜EG (含5%畫)，邊加邊攪拌；
9) 加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔2min分別加入lml， 2ml， 3ml， 4ml， 5ml和10ml;
10) 離心，800rpm， 7min，棄上清;用6ml含20%小牛血清的RPMI1640重
懸；
11) 根據(jù)所用96孔板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，10ml/96孔板，將融合后細(xì)
12) 懸液加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，100ixl/孔，37°C、 5%0)2孵箱 培養(yǎng)；融合24h后，加HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周；
13) 通過有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞克隆化；
14) 待克隆長出后，通過ELISA方法篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞。 Western blot—檢瀾單克隆抗體的特異性
l)配制蛋白裂解液(20mM HEPES(PH7.2), l%Triton X-100， 1%去氧膽酸鈉， 10ug/ml Leup印tin, 10ug/ml Aprotinin, ImM PMSF);
2) 取正常大鼠脊髓，剪碎、稱重后放入裂解液中(lml/200mg組織)，冰上勻
漿；
3) 13000g， 4"C離心30min，總蛋白存在于離心上清中，定量后分裝存于-70
。C;
4) 取上述提取的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離；電泳結(jié)束后將凝膠放入電 轉(zhuǎn)緩沖液中平衡10min;
5) 依凝膠大小，裁剪大小相同的濾紙和NC膜，電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡5min;
6) 在半干式電轉(zhuǎn)儀的正極極板上依次放置4層厚濾紙、NC膜、凝膠和4層厚 濾紙，趕走氣泡，壓上負(fù)極極板，15v轉(zhuǎn)移60min;
7) 電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于麗春紅染液中染色，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)膜的效果；
8) 封閉將膜放入適量封閉液中，室溫封閉2h-3h或4'C過夜；
9) 一抗反應(yīng):按照0. lml/cm2的比例加入以封閉液稀釋的自制的anti-SCI-69 單克隆抗體，室溫孵育lh;用TBS-T洗滌10minX3，；
10) 二抗反應(yīng):按照O. lml/cm2的比例加入以封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的二抗， 室溫孵育lh;用TBS-T洗滌:10minX3，;
11) 取等體積ECL試劑A液、B液混合，將ECL混合液加到NC膜上；
12) 用保鮮膜覆蓋NC膜，在暗室壓X光片，沖片觀察結(jié)果。 體外培養(yǎng)的皮層原代神經(jīng)元免疫熒光染色一檢測制備的單克隆抗體
(1) 將培養(yǎng)皿中的神經(jīng)元以0.01M KPBS快速?zèng)_洗一次；
(2) 立刻加入4W多聚甲醛室溫固定30min，.0.01M KPBS漂洗10minX3，;
(3) 0.3%Triton X-100作用30min;
(4) 加入以抗體稀釋液稀釋至工作濃度的SCI-69單克隆抗體，4'C孵育過
夜；
(5) 0.01M KPBS中漂洗，10minX3'，除去吸附和非特異性結(jié)合的一抗；
(6) 加入以0.01M KPBS (1: 50)稀釋的FITC-IgG，室溫孵育lh，
(7) O.OIMKPBS漂洗10minX3，;
(8) 復(fù)染細(xì)胞核Hoechst33258室溫孵育15min; O.OIMKPBS漂洗:10min X3 ，；
干燥后以Moviol封片，激光共聚焦顯微鏡下紀(jì)錄標(biāo)記結(jié)果。
(9) 將培養(yǎng)皿中的神經(jīng)元以0.01M KPBS快速?zèng)_洗一次；
(10) 立刻加入4l多聚甲醛室溫固定30min,0.01MKPBS漂洗10minX3，；
(11) 0. 3%Triton X-100作用30min;
(12) 加入以抗體稀釋液稀釋至工作濃度的SCI-69單克隆抗體，fC孵育
過夜；
(13) O.OIMKPBS中漂洗，10minX3，，除去吸附和非特異性結(jié)合的一抗；
(14) 加入以0.01M KPBS (1: 50)稀釋的FITC-IgG，室溫孵育lh，
(15) 0.01M KPBS漂洗10minX3，；
(16) 復(fù)染細(xì)胞核Hoechst33258室溫孵育15min;0. OlMKPBS漂洗lOmin X3 ，；
干燥后以Moviol封片，激光共聚焦顯微鏡下紀(jì)錄標(biāo)記結(jié)果。 SCIRR-飽irilNA在胚胎發(fā)育早期的表達(dá)
采用地髙辛標(biāo)記的RNA探針通過小鼠胚胎整體原位雜交技術(shù)檢測SCIRR-69 mRNA在不同胎齢的小鼠胚胎中的表達(dá)分布情況(圖12)。實(shí)驗(yàn)組使用antisense probe (與mRNA序列反向互補(bǔ))，對照組使用sense probe (與mRNA序列一致)。 在E9和E9. 5時(shí)，未見標(biāo)記信號。SCIRR-69 mRNA的表達(dá)最早見于E10. 5天，在 前腦泡存在較淺的標(biāo)記(箭頭)。在E11.5天，標(biāo)記范圍擴(kuò)大，在前腦泡(中空 箭頭)、中腦泡(黑箭頭)和后腦泡(三角形)都有明顯的標(biāo)記，其中后腦泡標(biāo) 記最深。在E12天，標(biāo)記范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，在前腦泡(中空箭頭)、中腦泡(黑 箭頭)和后腦泡(三角形)部位都有很深的標(biāo)記，此時(shí)標(biāo)記范圍最廣，信號最強(qiáng)。 在E13天，標(biāo)記強(qiáng)度明顯降低，僅在前腦(中空箭頭)、中腦(黑箭頭)和后腦 (三角形)的小范圍內(nèi)出現(xiàn)較弱的標(biāo)記。
SC1RR-6經(jīng)基因在正常大鼠體內(nèi)的組織分布
分別以來源于成年大鼠的大腦、小腦、腦干、脊髓、心、肝、脾、腎、肺、 胸腺、骨骼肌、胰、胃、小腸、大腸、睪丸組織的總RNA為模板，利用SCIRR-69
基因特異性引物進(jìn)行半定量RT-PCR，檢測SCIRR-69 mRNA在大鼠各種組織中的表 達(dá)情況，同時(shí)擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果顯示，SCIRR-69 基因在檢測的16種組織中都存在較高水平的表達(dá)(圖13)，同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)參G3PDH 在各組織中的表達(dá)水平基本一致。(可以去掉此段落) SCIRR"69 mRM在成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)
前面的研究結(jié)果表明，SCIRR-69 mRNA在成年大鼠具有十分廣泛的組織分布。 本研究重點(diǎn)關(guān)注它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)分布情況。本節(jié)利用地高辛標(biāo)記的 RNA探針通過組織冰凍切片原位雜交研究SCIRR-69 mRNA在成年大鼠腦組織及脊 髓組織不同層面的表達(dá)模式。結(jié)果見圖14 A，B，C。
SCIRR-柳蛋白在原代神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)分布
對混合培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記，即同時(shí)采用抗SCIRR-69蛋白 的抗體和神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細(xì)胞/少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體進(jìn)行標(biāo)記，檢測 SCIRR-69蛋白在各種細(xì)胞中的表達(dá)情況。激光共聚焦顯微鏡下觀察，在神經(jīng)元的 胞漿和突起都有較強(qiáng)的SCIRR-69蛋白的免疫標(biāo)記信號，細(xì)胞核未見標(biāo)記(圖15 al-a4)。在少突膠質(zhì)細(xì)胞中，也有SCIRR-69蛋白的表達(dá)(圖15bl-b4)。少數(shù)星 形膠質(zhì)細(xì)胞中可見SCIRR-69蛋白的弱標(biāo)記信號(圖15cl-c4)，大多數(shù)星形膠質(zhì) 細(xì)胞中未見SCIRR"69蛋白標(biāo)記信號(圖15 d1-d4)。
SCIRR-輸?shù)鞍兹L及跨膜區(qū)缺失體在細(xì)胞內(nèi)定位
將SCIRR-69全長蛋白及跨膜區(qū)缺失突變體與綠色熒光蛋白(GFP)融合表達(dá)， 然后轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過WB檢測融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。觀察GFP 融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，確定SCIRR-69蛋白及跨膜區(qū)缺失突變體的細(xì)胞內(nèi)定 位。由于SCIRR-69蛋白的結(jié)構(gòu)與CREB/ATF轉(zhuǎn)錄因子家族非常相似，而該家族的 多個(gè)分子定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，我們采用anti-KDEL抗體(識別定位于ER的 Grp78(Bip)分子)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記，探討SCIRR-69蛋白是否也定位于 ER。
SCIRR-6錢蛋白全長及跨胰區(qū)缺失突變體的細(xì)胞內(nèi)定位
將融合表達(dá)載體pEGFP-69FL和pEGFP-69delTM轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞，熒光顯微鏡
下觀察SCIRR-69蛋白全長及跨膜區(qū)缺失體與GFP融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。 結(jié)果表明，SCIRR-69全長與GFP融合蛋白定位于細(xì)胞漿，而跨膜區(qū)缺失體與GFP 融合蛋白主要定位于細(xì)胞核(圖16)。轉(zhuǎn)染pEGFP-Nl空載質(zhì)粒的對照組，GFP在 細(xì)胞漿和細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻分布(圖片未顯示)。為了確定SCIRR-69蛋白全長是否 同OASIS等分子一樣定位于ER，對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行了 anti-KDEL抗體的免疫標(biāo)記， 該抗體特異識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Grp78(Bip)。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示， SCIRR-69全長與GFP融合表達(dá)蛋白的分布能夠與anti-KDEL抗體標(biāo)記信號完全重 疊，說明SCIRR-69蛋白全長在i細(xì)胞內(nèi)定位于ER (圖16)。 SCIRR-S9在脊 搨傷后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)
提取正常及損傷2h、 ld、 5d、 7d的成年大鼠脊髓組織的總RNA,通過RT-PCR 檢測SCIRR"69 mRNA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。SCIRR-69 mRNA在正常脊髓組織 中有一定量的表達(dá)，損傷后2h明顯低于對照組，損傷后ld恢復(fù)到略高于正常組 的水平，損傷后5d表達(dá)量達(dá)到最高，7d時(shí)又下降至略低于正常組的水平(圖17A)。
然后分別提取正常及損傷2h、 ld、 5d、 7d的大鼠脊髓組織的總蛋白，以 anti-SCIRR"69單克隆抗體進(jìn)行WB研究SCIRR-69蛋白在不同時(shí)間的表達(dá)。結(jié)果 表明，SCIRR-69蛋白的表達(dá)變化趨勢基本與SCIRR-69 mRNA的變化趨勢相一致(圖 17B)。
SCIRR,蜜白活性的檢測及轉(zhuǎn)錄激活部位的確定 系列缺失突變缽擴(kuò)增
通過高保真PO 從前期構(gòu)建的pEGFP-69FL重組質(zhì)粒中擴(kuò)增SCIRR-69全長蛋 白及各缺失體對應(yīng)的編碼序列，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物大小均與預(yù)期相符(圖18)。 將各片段按常規(guī)方法克隆入pM質(zhì)粒建立不同長度的SCIRR-69蛋白與GAL4融合 表達(dá)的重組表達(dá)載體。
在喻乳動(dòng)物細(xì)廳中檢測SCIRR~69蛋白的轉(zhuǎn)錄撖活活性
SCIRR-69蛋白全長FL1-521定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并不是作為轉(zhuǎn)錄因子起作用的活 性形式，而跨膜區(qū)缺失突變體卻能定位于細(xì)胞核，很可能是它的活性形式，所以 我們重點(diǎn)關(guān)注跨膜區(qū)缺失突變體的轉(zhuǎn)錄激活活性。實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建了兩個(gè)跨膜區(qū)
缺失體，分別為1-375aa和1-357aa。分別將SCIRR-69蛋白全長FL1-521或跨膜 區(qū)缺失突變體1-375和1-357插入pM載體，建立表達(dá)GAL4融合蛋白的重組質(zhì)粒。 將重組質(zhì)粒與pFR-luc、 pRL-TK共轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞，pM空載質(zhì)粒作為陰性對照， pM3-VP16 (存在于單純皰疹病毒中的轉(zhuǎn)錄激活因子)作為陽性對照，轉(zhuǎn)染24h后 檢測相對熒光素酶活性，以相對熒光素酶活性的高低衡量SCIRR-69蛋白及其缺 失體的轉(zhuǎn)錄激活活性。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，進(jìn)行三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，取三次 結(jié)果的均值士方差作為最終數(shù)值。熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)L1-521具有較 高的轉(zhuǎn)錄激活活性(空載體的20倍)，1-375跨膜區(qū)缺失體無轉(zhuǎn)錄激活活性，1-357 跨膜區(qū)缺失體具有較低的轉(zhuǎn)錄激活活性(空載體的2.6倍)。此外，我們將上述 質(zhì)粒按同樣的方法轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞及大鼠B104細(xì)胞，結(jié)果與在C0S7中得到的細(xì) 胞一致，說明SCIRR-69蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍具有轉(zhuǎn)錄激活活性。 SCIRR-69蛋白轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的確定
構(gòu)建了系列C端和N端缺失突變體，6個(gè)C端缺失體根據(jù)缺失片段長度的不 同分別命名為CDEL1-375 、 CDEL1-357 、 CDEL1-318 、 CDEL1-250 、 CDEL1-150 、 CDEL1-60 ， 2個(gè)N端缺失體分別命名為NDEL 51-521 、 NDEL 101-521。將各缺 失體對應(yīng)的編碼序列分別插入pM載體構(gòu)建GAL4融合表達(dá)重組質(zhì)粒，然后與 pFR-luc和pRL-TK共轉(zhuǎn)染C0S7細(xì)胞，24h后檢測相對熒光素酶活性。pM空載質(zhì) 粒作為陰性對照，pM3-VP16作為陽性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Leucine Zi卯er缺失后 (1-318)，轉(zhuǎn)錄激活活性有了很大幅度的提高，說明Leucine Zipper區(qū)的空間 結(jié)構(gòu)可能抑制了融合蛋白的活性。當(dāng)缺失到僅剩N端60aa時(shí)，還具有相當(dāng)高的 轉(zhuǎn)錄激活活性；但當(dāng)N端50aa缺失時(shí)，只有很低的轉(zhuǎn)錄激活活性；當(dāng)N端100aa 缺失時(shí)，已經(jīng)完全喪失了轉(zhuǎn)錄激活活性，說明SCIRR-69蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)位于 laa-60aa的片段內(nèi)。
細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)時(shí)SCIRR-69蛋白的定位
在大鼠皮層原代神經(jīng)元培養(yǎng)液中加入引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的試劑[5]: luMTG (ER Ca" ATPase抑制劑)或3 u g/ml Tm(N-端糖基化抑制劑)作用2h后，以
anti-SCIRR-69單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記檢測SCIRR-69蛋白的定位。結(jié)果顯 示，在TG或Tm處理組，SCIRR-69蛋白的免疫標(biāo)記信號與對照組神經(jīng)元一樣，僅 出現(xiàn)于細(xì)胞漿(圖19A)，細(xì)胞核未見明確標(biāo)記，說明與OASIS、 ATF6等CREB/ATF 家族分予不同，SCIRR-69蛋白不能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生切割，它可能通過別 的途徑被激活。
神經(jīng)元損傷時(shí)SCIRR-69蛋白的定位
將大鼠皮層原代神經(jīng)元?jiǎng)潅?，以anU-SCIRR-69單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光 標(biāo)記檢測SCIRR-69蛋白在損傷神經(jīng)元中的表達(dá)定位。在正常神經(jīng)元中，SCIRR-69 蛋白的免疫標(biāo)記信號僅出現(xiàn)于細(xì)胞漿(圖19B)，而當(dāng)神經(jīng)元發(fā)生損傷后，有些細(xì) 胞的胞漿和胞核都能被anti-SCIRR-69抗體標(biāo)記，而且細(xì)胞核中的標(biāo)記信號強(qiáng)度 同胞漿基本一致，說明在這些細(xì)胞中，SCIRR-69蛋白能夠以某種形式進(jìn)入細(xì)胞核， 這--現(xiàn)象在損傷后lh (圖19B bl-b3)和12h (圖19B. cl-c3)尤為明顯。觀察 還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞漿和細(xì)胞核均被anti-SCIRR-69抗體標(biāo)記的神經(jīng)元在整個(gè)培養(yǎng)皿中 呈均勻分布，與細(xì)胞距離損傷線的遠(yuǎn)近無關(guān)。
損傷應(yīng)激致SCIRR 69切割入核導(dǎo)致蛋白分子發(fā)生切割變化
提取正常及損傷后不同時(shí)間的大鼠脊髓組織總蛋白，以anti-SCIRR-69單克 隆抗體通過WB檢測在脊髓組織發(fā)生損傷時(shí)SCIRR-69蛋白免疫印跡條帶的分布。在 正常脊髓蛋白中，僅出現(xiàn)一條分子量約為80kD的條帶，而在損傷4h、 12h、 ld、 3d和5d的脊髓蛋白中，除80kD條帶外，還有一條較弱的50kD條帶(圖20A)，這一 條帶可能是SCIRR-69蛋白在損傷應(yīng)激條件下切割產(chǎn)生的N端活性形式。
同樣地，以正常大鼠皮層原代神經(jīng)元細(xì)胞總蛋白進(jìn)行WB時(shí)，僅在80 kD處 出現(xiàn)條帶，而當(dāng)原代神經(jīng)元損傷lh、 12h后，除80kD條帶還有一條微弱的50kD 條帶(圖2()B)?？赡苡捎谕ㄟ^剪切產(chǎn)生的活性蛋白的豐度很低，所以通過WB只 能檢測到條帶很弱的緣故。
多種技術(shù)發(fā)現(xiàn)SCIRR69直接調(diào)節(jié)BDNF轉(zhuǎn)錄
通過染色質(zhì)免疫沉淀及PCR方法證實(shí)SCIRR-69蛋白能與BDNF啟動(dòng)子DNA相
互作用(圖21)。將構(gòu)建有BDNF啟動(dòng)子載體及SCIRR 69全長和各截短型載體共 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)SCIRR-69蛋白截短型與BDNF啟動(dòng)子相互 作用能明顯促進(jìn)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄(圖22)。為再次確認(rèn)SCIRR 69蛋白與BDNF轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)之間的關(guān)系，通過RNAi沉默SCIRR 69基因的表達(dá)，觀察到干擾SCIRR 69 基因后BDNF表達(dá)也出現(xiàn)相應(yīng)下調(diào)(圖23)。以上實(shí)驗(yàn)確認(rèn)SCIRR 69蛋白作為BDNF 轉(zhuǎn)錄因子在BDNF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。用該基因378截短型構(gòu)建真核表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行胎鼠皮層組織塊培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)378截短型 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后收集上清能顯著促進(jìn)胎鼠皮層組織突起生長，突起生長密度 及長度明顯優(yōu)于BDNF處理組(圖24)。
通過上述實(shí)施例，本發(fā)明可能用于制備促進(jìn)BDNF轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)神經(jīng)再生，治 療神經(jīng)損傷、老年癡呆、巴金森氏病等神經(jīng)退行性變疾患的藥物；可用于制備修 復(fù)脊髓損傷的藥物和研究試劑。
權(quán)利要求
1.一種SCIRR 69號基因和編碼蛋白為如下(a)或(b)所述的蛋白質(zhì)(a)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的氨基酸序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或疊加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的蛋白質(zhì)且與(a)的蛋白質(zhì)具有相同的功能，所述功能是作為BDNF的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。
2. —種基于SCIRR 69號基因和蛋白序列新命名的基因和蛋白，它編碼如權(quán) 利要求l所述蛋白質(zhì)。
3. 按照權(quán)利要求1或2所述的SCIRR 69基因，具有各種突變形式。
4. 按照權(quán)利要求1所述SCIRR 69號基因編碼蛋白作為抗原的應(yīng)用，具有特異抗原及基于抗原制備的特異性抗體。
5. 按照權(quán)利要求4所述SCIRR 69號基因編碼蛋白的特異抗原磷酸化位點(diǎn)及 基于磷酸化位點(diǎn)制備的特異性抗體。
6. 按照權(quán)利要求1所述SCIRR 69號基因編碼蛋白的功能；包括直接和/或間 接調(diào)節(jié)BDNF轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)損傷的神經(jīng)再生，以及尚待發(fā)現(xiàn)的其他功能。
7. 按照權(quán)利要求1或2所述的SCIRR 69基因、編碼蛋白或各種剪切長度的 蛋白在制備治療神經(jīng)損傷、老年癡呆、巴金森氏病等神經(jīng)退行性變疾患治療藥物 中的應(yīng)用。
8. 按照權(quán)利要求1或2所述的SCIRR 69基因、編碼蛋白或各種剪切長度的 蛋白在制備治療神經(jīng)損傷、老年癡呆、巴金森氏病等神經(jīng)退行性變疾患以及其他 相關(guān)疾病研究、診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于基因工程領(lǐng)域的涉及SCIRR 69基因、調(diào)節(jié)BDNF轉(zhuǎn)錄及在生物醫(yī)學(xué)研究、生物治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用。具體涉及從大鼠分離的脊髓損傷修復(fù)相關(guān)(SCIRR 69)基因及其編碼蛋白，特異性抗原表位，以及該基因在脊髓損傷修復(fù)過程中起作用的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼序列。調(diào)節(jié)BDNF轉(zhuǎn)錄的作用及尚待發(fā)現(xiàn)其它功能；SCIRR69蛋白在神經(jīng)元的生長、分化以及軸突可塑性方面具有重要作用；特異性的抗原和基于抗原制備特異性抗體；可能用于制備促進(jìn)BDNF轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)神經(jīng)再生，治療神經(jīng)損傷、老年癡呆、巴金森氏病等神經(jīng)退行性變疾患的藥物；可用于制備修復(fù)脊髓損傷的藥物；可用于開發(fā)相關(guān)研究和診斷試劑。所提供的SCIRR69蛋白結(jié)構(gòu)清楚，易于制備。同時(shí)可作為抗原制備特異性抗體。
文檔編號C12N15/12GK101173279SQ200710063848
公開日2008年5月7日 申請日期2007年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月13日
發(fā)明者倪艷麗, 勇 劉, 濤 劉, 劉少君, 超 常, 時(shí)小燕, 景書謙, 欣 李, 闕海萍, 馬振蓮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所