一種檢測胰腺導管癌的核酸適配體、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測胰腺導管癌的核酸適配體、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胰腺癌(Pancreatic carcinoma)是發(fā)生于胰腺的癌癥，可發(fā)生于胰腺的頭、體、尾部及整個胰腺。胰腺癌在病理上有胰導管腺癌、特殊類型導管起源的癌、腺泡細胞癌、小腺體癌、大嗜酸性顆粒細胞性癌和小細胞癌等分型，其中胰腺導管腺癌占胰腺癌病例的80-90%。近年來，胰腺癌發(fā)病率在我國呈明顯上升趨勢。據(jù)〈〈2012中國腫瘤登記年報》統(tǒng)計，胰腺癌發(fā)病率已位居我國所有惡性腫瘤發(fā)病率的第九位。目前，根治性手術(shù)切除是治療胰腺癌最有效的手段，其療效與患者所處分期密切相關(guān)，直徑< Icm的胰腺癌患者術(shù)后5年生存率可達67%。然而，胰腺癌位置隱蔽、臨床表現(xiàn)極不典型，且無有效的腫瘤標志物。同時，核磁共振成像(MRI)、計算機X射線層析掃描技術(shù)(CT)、內(nèi)鏡逆行胰膽管造影(ERCP)和超聲內(nèi)鏡(EUS)等常規(guī)影像技術(shù)的敏感性不能滿足胰腺癌早期診斷的需求。90%胰腺癌患者確診時已處于中晚期，不能進行根治性手術(shù)切除。同時，胰腺癌患者對傳統(tǒng)的放射和化學治療易產(chǎn)生抗性。這些原因使胰腺癌患者中位生存期僅為6-9個月，五年生存率不足5%。因此，胰腺癌的早期診斷和預后是目前亟需建立和發(fā)展高靈敏和高特異性的分子探針是改善胰腺癌預后的重要手段。
[0003]隨著人類基因組學、蛋白質(zhì)組學和表觀遺傳學的發(fā)展，人們逐步了解基因遺傳學和表觀遺傳學的變異會導致腫瘤細胞與正常細胞之間產(chǎn)生分子差異。這些反映腫瘤細胞存在的分子差異(腫瘤標志物)可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前研宄腫瘤等重大疾病的主要分子探針為蛋白質(zhì)抗體。然而，一方面，抗體具有制備周期長、成本高、容易失活、具有免疫原性和不易進行化學修飾等多種缺陷；另一方面，胰腺癌臨床腫瘤標志物(如糖抗原CA19-9、CA-50和癌胚抗原)缺乏特異性。另外上述腫瘤標志物對早期胰腺癌也缺乏敏感性。這些問題限制了基于抗體的靶向分子探針在胰腺癌早期診斷和治療中的應(yīng)用。因此，發(fā)展識別胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵蛋白的分子探針將有助于我們從分子水平上了解胰腺癌的發(fā)病機制，為實現(xiàn)胰腺癌早期診斷和靶向治療提供新的分子工具。
[0004]在發(fā)展識別癌變細胞/組織與正常細胞/組織之間分子差異的分子探針技術(shù)中，基于以完整腫瘤細胞為靶標的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Cell-SELEX)有著無與倫比的優(yōu)勢。Cell-SELEX是指以活性細胞為靶標，通過DNA/RNA文庫在細胞表面重復吸附分配、洗脫回收及聚合酶鏈擴增三個基本步驟，從人工合成的DNA/RNA文庫中篩選得到的、能夠高親合性高特異性結(jié)合靶細胞的單鏈寡核苷酸(即核酸適配體，又稱適配體，適配子)?；罴毎鳛楹Y選靶標具有以下優(yōu)點:細胞表面膜蛋白保持天然構(gòu)象和生物學功能；不需要了解蛋白分子信息即可篩選獲得能識別腫瘤細胞的核酸適配體；通過以正常細胞作為反篩靶標，可以獲取區(qū)分正常細胞和病變細胞之間分子差異的核酸適配體；整個篩選過程是在細胞膜上進行，細胞膜上蛋白的多樣性使同時篩選得到識別不同蛋白的核酸適配體成為可能。核酸適配體的親和力與抗體相當甚至高于抗體。而且與蛋白質(zhì)分子探針相比，核酸適配體具有以下優(yōu)點:體外篩選且周期短、容易合成和進行化學修飾、不同批次之間差異小、穩(wěn)定性好、可常溫運輸、免疫原性小和快速的組織穿透能力。因此，核酸適配體已成為蛋白質(zhì)科學和細胞生物學等研宄領(lǐng)域的一個重要分子工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測胰腺導管癌的核酸適配體、試劑盒及方法。
[0006]為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0007]所述檢測胰腺導管癌的核酸適配體序列如SEQ ID N0.1所示，命名為核酸適配體XQ-2。所述核酸適配體的序列還可以是將核酸適配體XQ-2的5’端14個堿基及3’端10個堿基截去后所得的保守序列(結(jié)合靶細胞的核心序列)，保守序列如SEQ ID N0.2所示，所述核酸適配體命名為核酸適配體XQ_2d，核酸適配體XQ-2d與核酸適配體XQ-2功能相同。
[0008]核酸適配體XQ-2:
[0009]5， -ACCGACCGTGCTGGACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATAYTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC GAGCCTGGCG-3’ (SEQ ID N0.1)；
[0010]在保持XQ-2保守序列(下劃線部分)不變的情況下可將核酸適配體進行修飾和改造，得到核酸適配體的衍生物，核酸適配體的衍生物可以為:
[0011]a)對所述核酸適配體XQ-2的兩端的核苷酸進行刪減，得到與XQ-2功能相同的核酸適配體的衍生物，如核酸適配體XQ_2d:
[0012]5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATAYTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3’ (SEQ IDN0.2) ο
[0013]b)對所述核酸適配體XQ-2兩端核苷酸的堿基進行人工堿基替換，得到與XQ-2功能相同的核酸適配體的衍生物。
[0014]c)將上述核酸適配體連接上熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、治療性物質(zhì)、生物素、酶標記等物質(zhì)后，得到的與所述核酸適配體具有相同結(jié)合能力的核酸適配體衍生物。
[0015]所述檢測胰腺導管癌的試劑盒中含有權(quán)利要求1或/和2所述的核酸適配體。
[0016]篩選權(quán)利要求1或2所述核酸適配體的方法包括如下步驟:
[0017](I)合成序列如SEQ ID N0.3所示的隨機單鏈DNA文庫，以及序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的引物，SEQ ID N0.4所示序列的5’端被異硫氰酸熒光素標記，SEQ IDN0.5所示序列的5’端被生物素標記；
[0018](2)將隨機單鏈DNA文庫與靶細胞胰腺導管癌細胞株P(guān)L45孵育；孵育完成后收集胰腺導管癌細胞株P(guān)L45 ;95°C加熱變性分離結(jié)合胰腺導管癌細胞株P(guān)L45的核酸適配體，作為第一次篩選出的核酸文庫；
[0019](3)以步驟(I)所述的引物對第一次篩選出的核酸文庫進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；
[0020](4)用鏈霉親和素葡聚糖微球分離生物素標記PCR擴增產(chǎn)物；然后利用0.2M氫氧化鈉使雙鏈DNA變性解鏈，收集異硫氰酸熒光素標記的DNA單鏈文庫；
[0021](5)將DNA單鏈文庫與非靶細胞HPNE細胞株孵育，孵育完成后收集細胞孵育后的上清液，排除掉非特異性結(jié)合的核酸序列；
[0022](6)將步驟(5)所得的上清液與靶細胞胰腺導管癌細胞株P(guān)L45孵育，洗脫結(jié)合在胰腺導管癌細胞株P(guān)L45表面的核酸適配體，作為第二次篩選出的核酸文庫；
[0023](7)用第二次篩選出的核酸文庫取代步驟(3)所得到的擴增產(chǎn)物，并重復步驟
(4)?
[0024](6)的篩選過程，篩選得到與靶細胞PL45細胞株結(jié)合的最終核酸文庫；
[0025](8)將最終核酸文庫進行高通量測序，利用流式細胞術(shù)檢測最終核酸文庫中DNA序列與PL45細胞株的結(jié)合選擇性和親和力，確定核酸適配體。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0027]本發(fā)明通過篩選得到的核酸適配體具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠體外化學合成，分子量小，可以對不同部位進行修飾和取代，且序列穩(wěn)定，易于保存；便于標記(不需要標記的二抗)等。采用本發(fā)明的核酸適配體進行前列腺癌細胞的檢測時，操作更為簡單、迅速，并且本發(fā)明核酸適配體的合成成本較抗體制備成本低，且周期短，重現(xiàn)性好。
[0028]本發(fā)明的可識別胰腺導管癌細胞株P(guān)L45的核酸適配體均能特異性且高親和力的識別胰腺導管癌細胞株P(guān)L45，且結(jié)合能力強。利用本發(fā)明的核酸適配體可從分子角度對腫瘤的危險性進行分層；其對腫瘤轉(zhuǎn)移灶的特異性識別、結(jié)合，對靶標的鑒定，可為轉(zhuǎn)移灶的診斷和治療提供很好的手段，這對于胰腺導管癌的早期檢測具有重要意義。
【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明實施例篩選過程中適配體文庫的富集過程:峰形代表PL45細胞與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的初始文庫和第8輪、12輪、15輪篩選產(chǎn)物結(jié)合后的熒光強度；
[0030]圖2為本發(fā)明實施例中核酸適配體(SEQ ID N0.1)與靶細胞PL45及非靶細胞HPNE結(jié)合能力的流式檢測結(jié)果；
[0031]圖3為本發(fā)明實施例中核酸適配體(SEQ ID N0.1)的序列優(yōu)化分析及與靶細胞結(jié)合的擬合曲線及解離常數(shù)(Kd)；
[0032]圖4為本發(fā)明實施例中核酸適配體(SEQ ID N0.2)在完全培養(yǎng)基中穩(wěn)定性的分析；
[0033]圖5為本發(fā)明實施例中核酸適配體(SEQ ID N0.2)與胰腺導管正常組織、胰腺導管癌組織染色熒光強度差異比較；
[0034]圖6為本發(fā)明實施例中核酸適配體(SEQ ID N0.2)在胰導管腺癌裸鼠模型中的識別作用。
【具體實施方式】
[0035]細胞來源:
[0036]本實驗篩選所用兩種細胞株(胰導管腺癌PL45株和HPNE細胞株)來自美國ATCC細胞庫。實驗其它所用細胞系來自湘雅醫(yī)院細胞庫。
[0037]本發(fā)明利用核酸適配體的體外篩選技術(shù)SELEX技術(shù)，以胰腺導管腺癌PL45細胞株為正篩靶標，以胰腺導管永生化HPNE細胞株為反篩靶標，從體外合成的隨機寡聚DNA文庫中篩選出與所述胰腺導管癌細胞株P(guān)L45特異結(jié)合的核酸適配體。
[0038]實施例1:胰腺導管癌細胞特異性核酸適配體的篩選
[0039](I)所用核酸文庫和引物的設(shè)計:
[0040]隨機單鏈DNA文庫:
[0041 ] 5，-ACCGACCGTGCTGGACTCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTATGAG