CGAGCCTGGCG-3’ (N代表A、T、C和G四種堿基)(SEQ ID N0.3)，g卩，該隨機(jī)單鏈DNA文庫理論庫容量為442條DNA ；
[0042]上游引物:5’-異硫氰酸熒光素-ACCGACCGTGCTGGACTCA-3’ (SEQ ID N0.4)；
[0043]下游引物:5’-生物素-CGCCAGGCTCGCTCATAGT-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0044](2)正篩選:
[0045]2.1孵育:用結(jié)合緩沖液(D-PBS，5mM氯化鎂)溶解上述的隨機(jī)核酸文庫，95°C恒溫變性5分鐘，迅速放入冰中；然后與已經(jīng)培養(yǎng)和預(yù)處理好的胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株P(guān)L45在4°C孵育I小時(shí)。
[0046]2.2解離:孵育完成后移除孵育培養(yǎng)皿中溶液，用洗滌緩沖液(PBS，含0.45%的葡萄糖，5mM氯化鎂)洗滌孵育培養(yǎng)皿中的細(xì)胞；用ImL無菌水刮取孵育培養(yǎng)皿中細(xì)胞，置于1.5mL離心管，95°C加熱變性10分鐘，5500轉(zhuǎn)每秒離心后取上清，分離結(jié)合PL45細(xì)胞的核酸序列，即為PL45細(xì)胞的第一輪篩選的核酸文庫。
[0047](3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增文庫:取步驟2中篩選所得的核酸文庫進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，上游引物:5’ -異硫氰酸熒光素-ACCGACCGTGCTGGACTCA-3’ ；下游引物:5’ -生物素-CGCCAGGCTCGCTCATAGT-3’;擴(kuò)增條件為:95°C，3 分鐘；95°C，30 秒；58.5°C，30 秒，72°C，30秒，經(jīng)合適循環(huán)輪數(shù)，720C，5min。第一輪篩選后將全部所得的PL45細(xì)胞的第一輪篩選的核酸文庫進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增8個(gè)循環(huán)，然后以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板再進(jìn)行大量擴(kuò)增。
[0048](4)制備DNA單鏈文庫:用鏈霉親和素葡聚糖微球分離生物素標(biāo)記步驟(3)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；然后利用0.2M氫氧化鈉使雙鏈DNA變性解鏈，收集異硫氰酸熒光素標(biāo)記的DNA單鏈文庫；
[0049](5)反篩:將步驟⑷所得到的DNA單鏈文庫與非靶細(xì)胞HPNE細(xì)胞株孵育，然后收集細(xì)胞孵育后的上清，即排除掉非特異性結(jié)合的核酸序列；
[0050](6)正篩:將步驟(5)中所制上清液與靶細(xì)胞孵育，洗脫保留結(jié)合靶細(xì)胞的核酸序列，即為第二次篩選的核酸文庫；
[0051](7)核酸適配體循環(huán)篩選:以步驟(6)所得的核酸文庫取代步驟(2)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，并重復(fù)步驟⑷?(6)的篩選過程，直到篩選得到與靶細(xì)胞PL45細(xì)胞株結(jié)合能力強(qiáng)的核酸文庫；
[0052](8)將篩選獲得的最終核酸文庫進(jìn)行高通量測序，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測所得測序所得DNA序列與PL45細(xì)胞株的結(jié)合選擇性和親和力，確定核酸適配體。
[0053]核酸適配體XQ-2序列為:
[0054]5， -ACCGACCGTGCTGGACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATAYTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC GAGCCTGGCG-3’ (SEQ ID N0.1)；
[0055]核酸適配體XQ_2d序列為:
[0056]5’-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATAYTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3’ (SEQ IDN0.2)
[0057]實(shí)施例2:胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞特異性核酸適配體的篩選
[0058]將得到的核酸適配體在5’端標(biāo)記熒光分子制成分子探針，分別取0nM、20nM、40ηΜ、60ηΜ、80ηΜ、ΙΟΟηΜ、120nM、140nM、160nM、200nM、300nM、400nM、500nM 的分子探針溶液，與3 X 15個(gè)PL45細(xì)胞進(jìn)行冰上孵育I小時(shí)，然后用洗滌緩沖液洗滌兩次，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度。如細(xì)胞能結(jié)合熒光標(biāo)記的核酸適配體，則以熒光強(qiáng)度對(duì)探針濃度作圖，用公式Y(jié) = BmaxX/(Kd+X)計(jì)算核酸適配體的平衡解離常數(shù)Kd。結(jié)果表明，核酸適配體的平衡解離常數(shù)均在納摩爾范圍內(nèi)。
[0059]實(shí)施例3:核酸適配體(SEQ ID N0.2)在完全培養(yǎng)基中穩(wěn)定性的分析
[0060]3微摩異硫氰酸熒光素標(biāo)記的核酸適配體(SEQ ID N0.2)分別置于200微升含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中。在不同考察時(shí)間點(diǎn)，將樣品置于干冰一乙醇中快速冷卻后置于一 80度冰箱保存。當(dāng)所有時(shí)間點(diǎn)樣品收集完畢，將樣品置于4度，待其溶解后，取20微升樣品于4%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離，然后進(jìn)行成像分析。如圖4可見:核酸適配體(SEQ ID N0.2)能在上述培養(yǎng)基穩(wěn)定存在6小時(shí)。
[0061]實(shí)施例4:3-吲哚菁類染料(Cy5)標(biāo)記的核酸適配體在臨床胰島管腺癌組織切片中的應(yīng)用測試
[0062](I)臨床樣本組織切片于60°C烤箱中烘烤I小時(shí)后，立刻置于第一缸二甲苯中15分鐘，而后置入第二缸二甲苯中15分鐘進(jìn)行脫蠟；再將已脫蠟的組織切片依次放置于無水乙醇中10分鐘，95%乙醇5分鐘，70%乙醇5分鐘；蒸餾水潤組織切片后對(duì)將其置于TE buffer (pH 8.0)，將切片放入盛有修復(fù)液的容器中，于微波爐內(nèi)加熱至沸騰，然后停止加熱，使其溫度保持在95°C?98°C之間。15分鐘后，取出切片，蒸餾水沖洗后，再用PBS (0.01M, pH7.4)浸泡3次，每次5分鐘(保證第一次浸泡的是新配的PBS)。
[0063](2)將已抗原修復(fù)的組織切片與含20% FBS和lmg/ml鯡魚精DNA的結(jié)合緩沖溶液室溫孵育60分鐘；洗滌后與200微升含0.25微摩Cy5標(biāo)記的核酸適配體(SEQ ID N0.2)或起始文庫于室溫孵育60分鐘。用洗滌緩沖液洗滌三次后，將組織切片晾干，并用20%甘油封片，觀察。由圖5可見:核酸適配體(SEQ ID N0.2)具有對(duì)胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞的特異性結(jié)合能力，在臨床實(shí)際標(biāo)本切片的檢測中可看到核酸適配體(SEQ ID N0.2)對(duì)胰導(dǎo)管腺癌腫瘤具有良好的識(shí)別檢測能力，能夠區(qū)分正常胰腺組織和胰導(dǎo)管腺癌腫瘤組織。正常胰腺組織和胰導(dǎo)管腺癌腫瘤組織均不能與單鏈DNA文庫(SEQ ID N0.3)結(jié)合。
[0064]實(shí)施例5:Cy5標(biāo)記的核酸適配體在裸鼠模型中的應(yīng)用測試
[0065]購買四周裸鼠，待裸鼠適應(yīng)新環(huán)境后，每只裸鼠皮下注射5百萬個(gè)PL45細(xì)胞，使裸鼠成瘤，約2周裸鼠長成瘤。通過尾靜脈注射的方法，給裸鼠注射Cy5標(biāo)記的核酸適配體(SEQ ID N0.2)或起始文庫和文庫4.5nmol后，用小動(dòng)物成像儀進(jìn)行拍照觀察。由圖6可見:在胰導(dǎo)管腺癌裸鼠模型中通過尾部靜脈注射核酸適配體(SEQ ID N0.2)5分鐘后，腫瘤位置就出現(xiàn)熒光信號(hào)；1小時(shí)后，該位置的熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，2小時(shí)后，熒光信號(hào)明顯降低；3小時(shí)時(shí)，熒光信號(hào)幾乎完全消失。然而在注射單鏈DNA文庫(SEQ ID N0.3)的胰腺癌裸鼠模型中，在整個(gè)考察過程中，腫瘤位置都沒有可觀察到的熒光信號(hào)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測胰腺導(dǎo)管癌的核酸適配體，其特征在于，所述核酸適配體序列如SEQ IDN0.1所示，命名為核酸適配體XQ-2。
2.—種檢測胰腺導(dǎo)管癌的核酸適配體，其特征在于，所述核酸適配體的序列是將核酸適配體XQ-2的5’端14個(gè)堿基及3’端10個(gè)堿基截去后所得的保守序列，保守序列如SEQID N0.2所示，所述核酸適配體命名為核酸適配體XQ_2d，核酸適配體XQ_2d與核酸適配體XQ-2功能相同。
3.—種檢測胰腺導(dǎo)管癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有權(quán)利要求1或/和2所述的核酸適配體。
4.篩選權(quán)利要求1或2所述核酸適配體的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)合成序列如SEQID N0.3所示的隨機(jī)單鏈DNA文庫，以及序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的引物，SEQ ID N0.4所示序列的5’端被異硫氰酸熒光素標(biāo)記，SEQ IDN0.5所示序列的5’端被生物素標(biāo)記； (2)將隨機(jī)單鏈DNA文庫與靶細(xì)胞胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株P(guān)L45孵育；孵育完成后收集胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株P(guān)L45 ;95°C加熱變性分離結(jié)合胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株P(guān)L45的核酸適配體，作為第一次篩選出的核酸文庫； (3)以步驟(I)所述的引物對(duì)第一次篩選出的核酸文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； (4)用鏈霉親和素葡聚糖微球分離生物素標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；然后利用2M氫氧化鈉使雙鏈DNA變性解鏈，收集異硫氰酸熒光素標(biāo)記的DNA單鏈文庫； (5)將DNA單鏈文庫與非靶細(xì)胞HPNE細(xì)胞株孵育，孵育完成后收集細(xì)胞孵育后的上清液，排除掉非特異性結(jié)合的核酸序列； (6)將步驟(5)所得的上清液與靶細(xì)胞胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株P(guān)L45孵育，洗脫結(jié)合在胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株P(guān)L45表面的核酸適配體，作為第二次篩選出的核酸文庫； (7)用第二次篩選出的核酸文庫取代步驟(3)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，并重復(fù)步驟(4)?(6)的篩選過程，篩選得到與靶細(xì)胞PL45細(xì)胞株結(jié)合的最終核酸文庫； (8)將最終核酸文庫進(jìn)行高通量測序，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測最終核酸文庫中DNA序列與PL45細(xì)胞株的結(jié)合選擇性和親和力，確定核酸適配體。
【專利摘要】一種檢測胰腺導(dǎo)管癌的核酸適配體、試劑盒及方法。所述核酸適配體序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明的可識(shí)別胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株P(guān)L45的核酸適配體均能特異性且高親和力的識(shí)別胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞株P(guān)L45，且結(jié)合能力強(qiáng)。利用本發(fā)明的核酸適配體可從分子角度對(duì)腫瘤的危險(xiǎn)性進(jìn)行分層；其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移灶的特異性識(shí)別、結(jié)合，對(duì)靶標(biāo)的鑒定，可為轉(zhuǎn)移灶的診斷和治療提供很好的手段，這對(duì)于胰腺導(dǎo)管癌的早期檢測具有重要意義。
【IPC分類】C12N15-115, C12Q1-04, C12N15-10
【公開號(hào)】CN104593372
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510066356
【發(fā)明人】譚蔚泓, 趙子龍, 武曉秋, 葉茂, 白華榮
【申請(qǐng)人】湖南大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日