一種編碼缺刻緣綠藻油體鈣蛋白的dna序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種編碼缺刻緣綠藻油體鈣蛋白 (MiClo)的DNA序列及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 能源是人類社會發(fā)展的基礎(chǔ)。目前全球正面臨著能源危機，石油資源供應(yīng)緊張， 而可再生性使生物能源的開發(fā)越來越受到社會的關(guān)注。微藻生物柴油以其不與人爭糧、 不與糧爭地、不與畜爭料的獨特優(yōu)勢吸引了越來越多科研工作者的關(guān)注。為了提高各種 油料作物的產(chǎn)油量，油體（oilbody, 0B)以及油體結(jié)合蛋白（proteinassociatedoil bodies)逐漸成為植物生物技術(shù)的新研宄目標(biāo)。不同種類的微藻積累油滴的能力不同，其 中綠藻、硅藻等真核微藻的油脂含量比較高，有希望成為生物柴油的生產(chǎn)藻種。實驗中所使 用的缺刻緣綠藻（MyrmeciaincisaReisiglH4301)是一種淡水單細胞微藻，隸屬綠藻門 (Chlorophyta)。該藻能大量積累三酰甘油（TAG)，尤其是在缺氮條件下，這些TAG包裹在半 單位膜內(nèi)以油滴的形式存在于細胞中，是潛在的微藻生物柴油藻種。
[0003]細胞的油體也稱脂質(zhì)體（lipidbody,LB)或脂滴（lipiddroplet,LD)，它們將為 細胞的未來生長提供所貯存的碳源和能量。細胞內(nèi)的油體為了避免與質(zhì)膜及細胞內(nèi)膜的融 合，在其半單位膜上鑲嵌著油體結(jié)合蛋白。研宄表明，這些油體結(jié)合蛋白中的油體鈣蛋白 (caleosin)主要存在于真菌或者單細胞藻類，而油質(zhì)蛋白（oleosin)主要存在于高等植物 中。某些低等植物例如蘚類、蘇鐵類等植物也是以油體鈣蛋白而不是油質(zhì)蛋白作為它們的 主要油體結(jié)合蛋白。這表明油體鈣蛋白具有維持油體結(jié)構(gòu)完整性的保守功能。植物特別是 其種子中的油體可用來表達高附加值的蛋白質(zhì)或攜帶疏水性的藥物，通過油體結(jié)合蛋白也 能成功地生產(chǎn)出具有生物活性的葡萄醛酸酶（GUS)、木聚糖酶和水蛭素等。此外，植物油體 結(jié)合蛋白還可以通過與營養(yǎng)價值高的外源蛋白或多肽融合，改善種子的營養(yǎng)成分、提高種 子食用及作為飼料的品質(zhì)、在作物高產(chǎn)和基因工程安全性等方面發(fā)揮著作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種分離的DNA序列。
[0005] 本發(fā)明的再一的目的是，提供上述分離的DNA序列的用途。
[0006] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種表達重組載體。
[0007] 本發(fā)明的第四個目的是，提供上述重組表達載體的用途。
[0008] 本發(fā)明的第五個目的是，提供一種基因工程化的宿主細胞。
[0009] 本發(fā)明的第六個目的是，提供上述基因工程化的宿主細胞的用途。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0011] 一種分離的DNA序列，所述的DNA序列為：
[0012]a)SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所述的核苷酸序列；或
[0013]b)與a)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
[0014] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0015] 如上所述的DNA序列在編碼油體鈣蛋白、增強糧油作物中油體的穩(wěn)定性或增加糧 油作物的油脂產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0016] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0017] -種重組表達載體，所述的載體是由如上所述的核苷酸序列與質(zhì)?；虿《舅鶚?gòu)建 的重組表達載體。
[0018] 優(yōu)選的，所述的質(zhì)粒是PYES2質(zhì)粒。
[0019] 為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0020] 如上所述的重組表達載體在編碼油體鈣蛋白、增強糧油作物中油體的穩(wěn)定性或增 加糧油作物的油脂產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0021] 為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0022] 一種基因工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞選自于下列中的一種：
[0023]a)用如上所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞及其后代細胞；
[0024]b)用如上所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞及其后代細胞。
[0025] 所述的宿主細胞是細菌細胞、真菌細胞，或這些宿主細胞的后代。
[0026] 優(yōu)選的，所述的宿主細胞是酵母細胞。
[0027] 為實現(xiàn)上述第六個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0028] 如上所述的宿主細胞在編碼油體鈣蛋白、增強糧油作物中油體的穩(wěn)定性或增加糧 油作物的油脂產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明提供了缺刻緣綠藻油體鈣蛋白（MiClo)基因序列并對其進行功能鑒定。該 基因是特異性錨定于油體表面的結(jié)構(gòu)蛋白，在糧油作物中過表達能增強油體的穩(wěn)定性，因 而能導(dǎo)致油體的過積累以增加油脂產(chǎn)量。
[0030] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0031] 1、本發(fā)明基于缺刻緣綠藻轉(zhuǎn)錄組高通量的測序數(shù)據(jù)，篩選出一條與已知油體鈣蛋 白基因有很高相似性的一條長810bp的片段?；谠撈涡蛄性O(shè)計引物并利用cDNA末端 快速擴增（RACE)技術(shù)克隆到該基因的全長cDNA序列，通過同源比對確定該基因為油體鈣 蛋白基因家族，將此命名為MiClo,并進一步獲得了MiClo的DNA全長序列。
[0032] 2、本發(fā)明通過在真核模式生物酵母BY4741菌株中與增強型黃色熒光蛋白（eYFP) 融合表達該基因，即基因過表達實驗，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白確實定位在酵母細胞的油體上， 從而證實了MiClo基因所編碼的蛋白能準(zhǔn)確地錨定于油體上，具有維持油體結(jié)構(gòu)完整性的 功能。
【附圖說明】
[0033] 附圖1是缺刻緣綠藻MiClo的基因結(jié)構(gòu)示意圖，圖中灰色線是非翻譯區(qū)，黑色線為 內(nèi)含子，黑色框為外顯子。
[0034] 附圖2是酵母細胞的熒光圖片，從上到下依次為酵母菌株BY4741，轉(zhuǎn)攜帶eYFP載 體pY-eYFP的BY4741菌株，轉(zhuǎn)攜帶目的基因的eYFP融合表達載體pY-MiClo-eYFP的BY4741 菌株。Bright為明場圖，Yellow為eYFP發(fā)射的黃色熒光蛋白信號圖，Red為NileRed染 色后發(fā)射的紅色熒光信號圖，Merged為前面三幅圖的疊加圖。
[0035] 附圖3是pMD19T載體圖譜。
[0036] 附圖4是pYES2載體圖譜。
【具體實施方式】
[0037] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0038] 本發(fā)明的技術(shù)路線是：
[0039] 1)在溫度為25°C、光照強度為115ymolphotonsm^V1的條件下，于BG-11培養(yǎng) 基中培養(yǎng)缺刻緣綠藻。收集藻細胞，并提取基因組DNA和RNA。
[0040] 2)自缺刻緣綠藻轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩選得到一條與已知油體鈣蛋白基因有很高 相似性的長810bp的片段，基于該片段序列，利用RACE技術(shù)得到油體鈣蛋白基因的cDNA序 列全長，我們將其命名為MiClo。然后，利用缺刻緣綠藻RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版對MiClo 的cDNA全長序列進行該序列驗證。
[0041] 3)根據(jù)MiClo全長的cDNA序列設(shè)計引物，利用缺刻緣綠藻DNA作為模版進行PCR 擴增，得到MiClo的DNA全長序列。
[0042] 4)根據(jù)MiClo的cDNA全長序列以及eYFP(enhancedyellowfluorescent protein，增強型黃色熒光蛋白）的序列設(shè)計引物，利用PCR構(gòu)建pMD19T/MiClo和pMD19T/ eYFP質(zhì)粒。
[0043]5)對pYES2載體和pMD19T/eYFP質(zhì)粒進行雙酶切（EcoRI/Xbal)，回收目的片段， 再用T4連接酶連接得到攜帶eYFP的重組表達載體pY-eYFP。
[0044] 6)接著對pY-eYFP載體和pMD19T/MiClo質(zhì)粒進行雙酶切（Hindlll/EcoRI)， 回收目的片段，再用T4連接酶連接得到攜帶目的基因與eYFP融合表達的重組載體 pY-MiClo-eYFP。
[0045] 7)分別將重組載體pY-eYFP和pY-MiClo-eYFP用電穿孔儀電擊法轉(zhuǎn)化酵母 BY4741，應(yīng)用尿嘧啶缺陷的合成培養(yǎng)基（SC-U)篩選轉(zhuǎn)化株，篩選得到轉(zhuǎn)基因酵母pY-eYFP 和pY-MiClo-eYFP。
[0046] 8)將轉(zhuǎn)目的基因、轉(zhuǎn)空載體（S卩只攜帶eYFP的pYES2載體）和未轉(zhuǎn)基因的酵母 BY4741接種于SC培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后收集酵母。
[0047] 9)利用油體特異性熒光染料尼羅紅（NileRed)對酵母菌株及轉(zhuǎn)基因酵母進行細 胞染色，利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：在轉(zhuǎn)PY-eYFP的酵母細胞內(nèi)黃色熒光呈彌散狀； 而在轉(zhuǎn)目的基因MiClo與eYFP融合表達載體的酵母細胞中，黃色熒光與染油體的紅色熒光 重合。該結(jié)果證明了MiClo所編碼的蛋白定位于油體上，具有維持油體結(jié)構(gòu)完整性的功能。 [0048] 實施例
[0049] 1、實驗材料
[0050] 1)缺刻緣綠藻（MyrmeciaincisaReisiglH4301)購自捷克布拉格查理斯大學(xué)藻 類培養(yǎng)中心（CAUP)。在溫度為25°C、光照強度為115ymolphotonsm-2 ?s-1，光/暗比為 12h/12h的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為BG-11，購自上海滬宇生物科技有限公司。
[0051] 2)pMD19T載體（載體圖譜見圖3)、pYES2載體（載體圖譜見圖4)購自Invitrogen 公司。酵母缺陷株BY4741(Matahis3Aleu2Ametl5Aura3A)購自德國EUROSCARF。將酵 母接種于SC培養(yǎng)基，在30°C下以200轉(zhuǎn)/分鐘（rpm)轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。SC培養(yǎng)基購自上海 酶聯(lián)生物科技有限公司。
[0052] 2、實驗方法
[0053] 1)取100mg新鮮的缺刻緣綠藻細胞置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分研磨。
[0054] 2)分別利用CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）和TRIzol法提取藻細胞的基因 組DNA和總RNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0055] 3)在缺刻緣綠藻轉(zhuǎn)錄組高通量測序數(shù)據(jù)庫中篩選到一條與Auxenochlorella protothecoides這種綠藻的油體媽蛋白編碼序列有81 %相似性的長810bp片段 (Contig2882_5)，根據(jù)其序列設(shè)計引物，利用Clontech公司的SMART?RACEcDNA擴增試劑盒 進行PCR擴增。5' -RACE采用巣式PCR，第一輪的PCR反應(yīng)條件為：94°C變性30s、68°C退 火 30s及 72°C延伸 2min，20 個循環(huán)，引物為GSP1 (AGCACAGTTCTGTTGGCACTGGGTTTG，SEQID NO. 3)和試劑盒中的UPM;第二輪PCR反應(yīng)取1. 5yL第一輪PCR產(chǎn)物直接作為第二輪反應(yīng) 模板，反應(yīng)條件為94°〇變性308