膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系biu87特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及篩選腫瘤組織特異性結(jié)合肽，具體為一種膀胱移 行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87特異性結(jié)合的多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 膀胱癌（Bladdercarcinoma)是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中75%_85% 為淺表性膀胱腫瘤，又稱為非肌肉浸潤(rùn)性腫瘤（Nonmuscleinvasivebladdertumor， 匪IBC)。雖然采取膀胱癌手術(shù)及術(shù)后綜合療法顯著提高了患者5年生存率，但因膀胱癌早 期血尿?？勺孕袦p輕或停止，易給患者造成"好轉(zhuǎn)"或"治愈"的錯(cuò)覺(jué)而貽誤治療。因此，針 對(duì)膀胱原位癌診斷困難、術(shù)中腫瘤不易識(shí)別和術(shù)后需膀胱鏡復(fù)查的臨床問(wèn)題，積極尋找特 異性強(qiáng)、陽(yáng)性率高、能識(shí)別微小腫瘤的腫瘤標(biāo)志物將是改變膀胱癌診療現(xiàn)狀的有效手段之 〇
[0003] 菌體展示技術(shù)于1985年由Sminth等首次創(chuàng)造性的提出，現(xiàn)已成為發(fā)現(xiàn)新功能 多肽和改變已有多肽性質(zhì)的有效工具，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程和細(xì)胞生物學(xué)。其原理為通 過(guò)將一定的外源蛋白質(zhì)或多肽的基因表達(dá)產(chǎn)物融合到噬菌體衣殼蛋白PIII或PW端，并在 噬菌體顆粒表面展示該基因編碼的蛋白，同時(shí)將遺傳密碼信息整合到個(gè)體噬菌體的基因 組中，從而在基因與蛋白質(zhì)或多肽間建立直接聯(lián)系。1996年，Pasqualini等在菌體展示 技術(shù)體外篩選的基礎(chǔ)上，發(fā)展了體內(nèi)篩選方法。噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選方法將噬菌體展 示技術(shù)施以體內(nèi)選擇壓力，進(jìn)行腫瘤組織或其內(nèi)部血管特異性配體的篩選，從而能夠獲得 具有靶向作用的噬菌體表面展示的小分子多肽序列。因此，為實(shí)現(xiàn)膀胱癌微小腫瘤的分子 診斷和靶向治療，采用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選人膀胱癌的特異性靶向多肽標(biāo)志物，為膀 胱癌早期診斷和靶向治療提供理論基礎(chǔ)。
[0004] 目前，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選已得到針對(duì)不同腫瘤組織或血管的特異性 靶向多肽配體，這些靶向多肽配體可顯示腫瘤組織或血管，或利用特異靶向多肽配體阻斷 生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合，或攜帶細(xì)胞毒性藥物攻擊腫瘤組織，從而用于腫瘤診斷和治療。Lee 等通過(guò)17噬菌體展示肽庫(kù)篩選出人膀胱癌HT-1367細(xì)胞系特異性導(dǎo)向肽CSNRDARRC，并 證實(shí)該肽對(duì)膀胱癌患者的尿液及病理組織有一定的結(jié)合特異性；趙揚(yáng)等證明FITC標(biāo)記肽 CSNRDARRC可與膀胱癌T24細(xì)胞系及人膀胱癌患者病理組織相結(jié)合，但結(jié)合特異性有待提 高。到目前為止未見有以人膀胱癌細(xì)胞BIU87為研宄對(duì)象，并篩選出與其能進(jìn)行特異性結(jié) 合的多肽的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87特異性結(jié)合的多肽及 其應(yīng)用，利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到特異性結(jié)合多肽NYZL1，經(jīng)過(guò)鑒定，與人膀胱移行細(xì) 胞癌細(xì)胞系BIU87有較強(qiáng)親和力和特異性。
[0006] 本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87特異性結(jié) 合的多肽，命名為NYZL1，編碼該多肽的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，即Y-GCAATGACG ACCAATCGGCGACGAACA-3r 〇
[0007] -種膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87特異性結(jié)合的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2m：^;JPCysSerSerP;roIleGlyArgHisCys〇
[0008] 一種膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87特異性結(jié)合的多肽在制備膀胱癌藥物中的應(yīng) 用。
[0009] 本發(fā)明利用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選與人膀胱移行細(xì)胞癌特異性結(jié)合的小分子 多肽，首先將人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞BIU87接種于裸鼠體內(nèi)，制備膀胱癌荷瘤小鼠模型，尾 靜脈注射噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)，然后篩選與膀胱移行細(xì)胞癌特異性結(jié)合的含外源多肽的噬 菌體，經(jīng)過(guò)3輪體內(nèi)篩選后，免疫組織化學(xué)法及ELISA法鑒定單克隆噬菌體對(duì)BIU87的親和 力。提取陽(yáng)性單克隆噬菌體單鏈DNA進(jìn)行測(cè)序，并推導(dǎo)出外源多肽氨基酸序列，化學(xué)合成多 肽、制備分子探針后采用激光掃描共焦顯微鏡術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)鑒定多肽對(duì)膀胱癌細(xì)胞和組 織的特異性。結(jié)果3輪體內(nèi)篩選后，噬菌體富集率達(dá)到4. 334X102倍，免疫組化結(jié)果顯示， 腫瘤組織中噬菌體肽的含量隨著每一輪篩選呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且結(jié)合逐漸增強(qiáng)，同時(shí)由于噬菌 體經(jīng)肝、腎代謝，可見肝臟結(jié)合大量非特異性的噬菌體；ELISA結(jié)果顯示，隨機(jī)挑選的30個(gè) 單克隆噬菌體斑中，有24個(gè)陽(yáng)性噬菌體，其中10個(gè)噬菌體對(duì)BIU87有較強(qiáng)的親和力，對(duì)其 測(cè)序獲得3種多肽序列，重復(fù)率最高的序列CSSPIGRHC(8/10)命名為NYZL1。對(duì)以上噬菌體 克隆外源多肽進(jìn)行生物信息學(xué)分析，序列由Ser、Pro、lie、Gly、Arg、His六種氨基酸組成， 兩端以Cys通過(guò)二硫鍵連接成為構(gòu)像穩(wěn)定的小分子多肽，該序列與NCBI/BLAST、SwissProt 等數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因和蛋白無(wú)同源性，且國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均未見報(bào)道。本發(fā)明通過(guò)激光掃描共 焦顯微鏡術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)多肽NYZL1對(duì)膀胱癌細(xì)胞的特異性，顯示人膀胱移行 細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87表面有多肽NYZL1的特異性結(jié)合位點(diǎn)。
[0010] 本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，以我國(guó)第一株自建人膀胱癌細(xì)胞BIU87為靶細(xì)胞， 旨在快速、高效的篩選出與人膀胱癌BIU87細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體克隆，從而獲得能與 人膀胱癌靶向結(jié)合的氨基酸序列。相比體外培養(yǎng)的細(xì)胞，裸鼠移植瘤模型有著不可比擬的 優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于模擬人體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制等研宄。本發(fā)明采用荷瘤動(dòng) 物模型進(jìn)行完全體內(nèi)篩選，最大限度的模擬膀胱癌組織中的實(shí)際內(nèi)環(huán)境，借助自身組織、器 官為對(duì)照，豐富了篩選靶蛋白的范圍，同時(shí)采用活體心臟灌注生理鹽水盡可能的減少體內(nèi) 非特異性噬菌體的殘留，提高篩選的特異性，為膀胱癌早期診斷、抗腫瘤藥物制備提供一定 的理論依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為接種人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞后的荷瘤裸鼠模型； 圖2為荷瘤裸鼠腫瘤組織HE染色（X200)熒光圖； 圖3為免疫組化鑒定噬菌體肽庫(kù)體內(nèi)分布的免疫組織化學(xué)染色熒光圖，其中A為腫 瘤組織空白對(duì)照染色；B為第一輪篩選腫瘤組織中噬菌體染色；C為第二輪篩選腫瘤組織中 噬菌體染色；D為第三輪篩選腫瘤組織中噬菌體染色；E為肝臟組織中噬菌體染色；F為腎 臟組織中噬菌體染色；G為肺組織中噬菌體染色；H為肌肉組織中噬菌體染色；箭頭所指為 DAB陽(yáng)性染色。
[0012] 圖4為單克隆噬菌體對(duì)BIU87的親和力柱狀圖； 圖5為噬菌體R2、R6、R8、Rll、R13、R14、R15、R30提取DNA后瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖6為噬菌體R2、R6、R8、Rll、R13、R14、R15、R30提取DNA測(cè)序結(jié)果； 圖7為FITC-C6-NYZL1高效液相層析及質(zhì)譜分析純化圖譜； 圖8為激光共焦顯微鏡鑒定FITC-C6-NYZL1對(duì)BIU87結(jié)合特異性的熒光圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 結(jié)合以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0014] -、本發(fā)明實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑如下： 噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)試劑盒（Ph.D.-C7CTMP印tideLibraryKit)購(gòu)自NEWENGLAND BioLabs，包括噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)（?lX1013pfu/ml);宿主菌E.coliER2738; - 96gill 測(cè)序引物Y-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3< ;SPF級(jí)BALB/C雄性裸鼠購(gòu)自湖南斯萊 克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，3?4周齡，體重15?18g;人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87購(gòu) 自北京醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研宄所；人膀胱正常移行上皮細(xì)胞iMBT購(gòu)自武漢原生原代生物 醫(yī)藥科技有限公司；M13噬菌體單鏈基因組DNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技 有限公司；HRP/Anti_M13單克隆抗體購(gòu)自GEHealthcare;Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司。； 兔抗M13噬菌體抗體、羊抗兔-HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自SIGMA;I