促進(jìn)水產(chǎn)動物腸道健康的復(fù)合微生物菌劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種促進(jìn)水產(chǎn)動物腸道健康的復(fù)合微生物 菌劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾年來食品安全備受關(guān)注，水產(chǎn)品的健康養(yǎng)殖勢在必行，目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程 中，多數(shù)使用光合細(xì)菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌等微生物制劑改善養(yǎng)殖環(huán)境，降低疾病的發(fā) 生，取得了較好的效果，然而水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的疾病發(fā)生還與水產(chǎn)動物機體本身有關(guān)，因此這 幾年來針對水產(chǎn)動物腸道健康的研究較多，其中也有一部分利用微生物促進(jìn)水產(chǎn)動物的腸 道健康。如羅源、江海英等申請的中國專利（專利號=201210029204.9)公開了一種短小芽 孢桿菌、益生菌制劑及其制備方法和應(yīng)用。發(fā)明的有益效果是：利用短小芽孢桿菌具有強的 胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，對弧菌具有廣泛的抑制性，起到抑制對蝦腸道病原弧菌 生長、減少對蝦弧菌病的發(fā)生，同時促進(jìn)對蝦生長、降低餌料系數(shù)；但其缺陷在于：對病原 菌的抑制性較為單一，只提及對弧菌類病原菌有廣泛的抑制作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種促進(jìn)水產(chǎn)動物腸道健康的復(fù)合微生物 菌劑，并同時揭露了該復(fù)合微生物菌劑的制備方法。
[0004] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的： 一種促進(jìn)水產(chǎn)動物腸道健康的復(fù)合微生物菌劑，其由以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成： 經(jīng)培養(yǎng)、濃縮及固化后的菌株FA08 5-25% ； 經(jīng)擴(kuò)培、濃縮與固定后的菌株DS31 10-25% ； 余量為載體； 其中：載體為硅藻土或沸石粉或麥飯石粉，且硅藻土、沸石粉、麥飯石粉的粉碎細(xì)度均 為120-250目； 所述菌株FA08為地衣芽抱桿菌菌株FA08 于2014年08 月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCCNo:9544 ; 所述菌株DS31為干釀乳桿菌菌株DS31 casei)，于2014年11月28 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCCNo:10073。
[0005] 同時揭露了上述促進(jìn)水產(chǎn)動物腸道健康的復(fù)合微生物菌劑的制備方法，其具體步 驟為： (1)地衣芽孢桿菌菌株FA08的培養(yǎng)：取所述的地衣芽孢桿菌菌株FA08 )并將其接種至LB培養(yǎng)基中，且于28-40°C、150-200rpm下活化培養(yǎng)5-10h;活化好即得種子液，接著按1-10%接種量將種子液接種至LB培養(yǎng)基，并于28-40°C、 150-200rpm條件下培養(yǎng) 12-24h; (2) 地衣芽孢桿菌菌株FA08的濃縮與固化：將經(jīng)步驟（1)培養(yǎng)所得的菌液置于 8000-10000rpm離心5-10min，棄上清得濕菌液；于所得濕菌液中添加粉碎細(xì)度為120-250 目的硅藻土或麥飯石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，之后30-40°C條件下進(jìn)行干燥，得固化 后的地衣芽孢桿菌菌株FA08,備用； (3) 干酪乳桿菌菌株DS31的擴(kuò)培：取所述的干酪乳桿菌菌株DS31 (Lacte知ciBm 并將其接種至MRS培養(yǎng)基中，且于30-45°C、搖床150-200rpm下活化培養(yǎng)5-10h; 活化好即得種子液，接著按1-10%接種量將種子液接種至MRS培養(yǎng)基，并于30-45°C、搖床 150-200rpm條件下培養(yǎng) 12-24h; (4) 菌株吸附：于步驟（3)擴(kuò)培后的菌液中添加粉碎細(xì)度120-250目的硅藻土或麥飯石 粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附l-5h; (5) 濃縮與固定：步驟（4)吸附后的菌液于8000-10000印111下離心5-10111；[11，棄上清得濕 菌液，并加入0. 1-1. 0ml/L的保護(hù)劑，30-40°C攪拌干燥，得固定后的干酪乳桿菌菌株DS31， 備用； (6) 復(fù)配：先按照下列質(zhì)量百分?jǐn)?shù)稱取組分：5-25%步驟（2)所得的固化后的地衣芽 孢桿菌菌株FA08、10-25%步驟（5)所得的固定后的干酪乳桿菌菌株DS31、余量為粉碎細(xì)度 120-250目的硅藻土或沸石粉或麥飯石；接著將稱取好的各組分混合并攪拌均勻，之后進(jìn) 行分裝包裝即得所述的復(fù)合微生物菌劑。
[0006] 進(jìn)一步地，所述LB培養(yǎng)基的組分均為：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，H20 1000 mL。
[0007] 進(jìn)一步地，所述保護(hù)劑為甘油、海藻酸鈉、糊精中的任一種。
[0008] 進(jìn)一步地，所述MRS培養(yǎng)基的組分均為：蛋白胨10. 0g、牛肉膏10. 0g、酵母膏 5.0g、檸檬酸三銨 2.0g、葡萄糖 20.0g、Tween-80 1.0mL、NaAc5.0g、K2HP04 2.0g、 MgS04 ? 7H20 0? 58g、MnS04 ?H20 0? 25g、H20 1000mL、pH6. 2-6. 6。
[0009] 本發(fā)明的有益效果在于：通過利用地衣芽孢桿菌菌株FA08 與干酪乳桿菌菌株DS31 casei)所制得的復(fù)合微生物菌 齊U，其對水產(chǎn)常見的病原菌溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌都有抑制作用；且該復(fù)合微生物菌劑利 用二者的協(xié)同作用，能夠降低水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的餌料系數(shù)，更為有效的促進(jìn)水產(chǎn)動物腸道的 健康與對飼料的利用率，從而能提高水產(chǎn)動物成活率。
【具體實施方式】
[0010] 本發(fā)明中涉及兩菌株即地衣芽孢桿菌菌株FA08及干酪乳桿菌菌株DS31，其中，地 衣芽孢桿菌菌株FA08是從采自福建省寧德市養(yǎng)殖池底泥樣品中分離并篩選得到能夠改善 水產(chǎn)養(yǎng)殖動物腸道的菌株，通過對該菌株進(jìn)行生理生化特性測定和16srDNA鑒定，最終確 認(rèn)其為地衣芽孢桿菌JicAefli/bu's)的一個菌株；干酪乳桿菌菌株DS31是從 米自福建省寧德市網(wǎng)箱養(yǎng)殖的健康大黃魚的魚腸中分離并篩選得到對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物腸道 的改良具有促進(jìn)作用的功能菌株，通過對該菌株進(jìn)行生理生化特性測定和16srDNA鑒定， 最終確認(rèn)其為干酪乳桿菌casei)的一個菌株。
[0011] 一、第一個菌株的分離與鑒定： 1、初篩： 稱取l〇g采自福建省寧德市養(yǎng)殖池底泥樣品，加入lOOmL0.85%NaCl中，攪拌后取上 層濁液置于LB培養(yǎng)基，之后于37°C、180rpm條件下富集培養(yǎng)30h，富集培養(yǎng)所得菌液置于 75°C水浴20min，水浴后的菌液進(jìn)行梯度稀釋及LB平板涂布法分離操作，然后挑取LB平板 上長起的形態(tài)不一的菌落，保存?zhèn)溆谩?br>[0012] 2、復(fù)篩： 取初篩得到的各菌落并分別置于LB試管中，于37°C、180rpm下活化6h;活化好的菌液 按10%接種量接種至CMC-Na產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37°C，180rpm發(fā)酵48h;所得發(fā)酵液經(jīng)lOOOOrpm 離心6min，得各菌落的上清液，備用； 配制CMC-Na平板，打孔后，分別在各孔內(nèi)添加50uL所得的上清液，之后置于37°C過夜 反應(yīng)；反應(yīng)后的平板用剛果紅染色lh，接著用0. 85%NaCl脫色，觀察比較各孔中上清液水 解圈的大小，進(jìn)而篩選出產(chǎn)酶能力較強的菌株，將該菌株標(biāo)記為菌株FA08。
[0013] 其中，CMC-Na產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組分為：蛋白胨10. 0g，酵母膏9. 0g，CMC-Na5. 0g， pH8. 0 ;CMC-Na平板的組分為：CMC-Na15. 0g、硫酸銨1. 0g、酵母膏1. 0g、硫酸鎂1. 0g、磷 酸二氫鉀l.〇g、H20 1000mL、Agar20.0g。
[0014] 3、鑒定： 將篩選所得菌株FA08接種至LB固體培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)，并觀察菌落形態(tài)，并做部 分生理生化特性的測定，結(jié)果如下：菌落白色微黃，中間凸起，表面光滑，邊緣不規(guī)則，革蘭 氏陽性，產(chǎn)芽孢，葡萄糖發(fā)酵陽性，水解淀粉陽性。同時對該菌株進(jìn)行16SrDNA鑒定，得其 16srDNA序列如SEQIDN0 :1 所示。
[0015] 將測得的16srDNA序列輸入NCBI進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)其相似度最高的為地衣 芽孢桿菌則結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果及16srDNA序列數(shù)據(jù)庫比 對結(jié)果，確定該菌株FA08為地衣芽孢桿菌（ifeciBys/icAefli/bu's)的一個菌株。
[0016] 二、第二個菌株的分離與鑒定： 1、 初篩： 將新鮮大黃魚于冰盤上進(jìn)行解剖，刮取魚腸內(nèi)壁粘膜置于〇. 85%NaCl中，攪拌均勻后 經(jīng)梯度稀釋并涂布于BCP培養(yǎng)基，于37°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h直至菌落長出，挑取周 圍變黃的菌落，保存到MRS斜面?zhèn)溆谩?br>[0017]本發(fā)明中，BCP培養(yǎng)基的組分：酵母膏25g、蛋白胨5. 0g、葡萄糖5. 0g、溴甲酚紫 0. 004g、瓊脂15g、水1000ml，pH7. 0;MRS培養(yǎng)基的組分為：蛋白胨10. 0g、牛肉膏10. 0g、 酵母膏 5.0g、檸檬酸三銨 2.0g、葡萄糖 20.0g、Tween-80 1.0mL、NaAc5.0g、K2HP04 2.0 g、MgS04 ? 7H20 0? 58g、MnS04 ?H20 0? 25g、H20 1000mL、瓊脂 15g，pH6. 2-6. 6 ; 2、 復(fù)篩： 挑取初篩保存的菌落并接種至MRS試管中活化6h，活化好的菌液按5%接種量接種至MRS培養(yǎng)基中，于37°C、180rpm、搖床培養(yǎng)24h，搖床培養(yǎng)期間每隔2h取樣測pH，進(jìn)而篩選出 產(chǎn)酸能力最強的菌株，將該菌株標(biāo)記為菌株DS31。
[0018] 3、鑒定： 將篩選所得菌株DS31接種至MRS固體培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并做部分 生理生化特性的測定，結(jié)果如下：菌落乳白色，表面光滑，邊緣整齊，不透明，革蘭氏陽性，無 芽孢，葡萄糖發(fā)酵陽性，乳糖發(fā)酵陽性。同時對該菌株進(jìn)行16SrDNA鑒定，得其16srDNA序列如SEQIDNO:2所示。
[0019] 將測得的16srDNA序列輸入NCBI進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)其相似度最高的為干酪 乳桿菌;則結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果及16srDNA序列數(shù)據(jù)庫比對結(jié) 果，確定該菌株DS31為干酪乳桿菌casei)的一個菌株。
[0020] 三、復(fù)合微生物菌劑及其制備方法 一種促進(jìn)水產(chǎn)動物腸道健康的復(fù)合微生物菌劑，其由以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成： 經(jīng)培養(yǎng)、濃縮及固化后的菌株FA08 5-25% ； 經(jīng)擴(kuò)培、濃縮與固定后的菌株DS31 10-25% ； 余量為載體； 其中：載體為硅藻土或沸石粉或麥飯石粉，且硅藻土、沸石粉、麥飯石粉的粉碎細(xì)度均 為 120-250 目。
[0021] 且該復(fù)合微生物菌劑的制備方法的具體操作步驟如下： (1) 地衣芽孢桿菌菌株FA08的培養(yǎng)：取所述的地衣芽孢桿菌菌株FA08 )并將其接種至LB培養(yǎng)基中，且于28-40°C、150-200rpm下活化培養(yǎng) 5-10h;活化好即得種子液，接著按1-10%接種量將種子液接種至LB培養(yǎng)基，并于28-40°C、 150-200rpm條件下培養(yǎng) 12-24h; (2) 地衣芽孢桿菌菌株FA08的濃縮與固化：將經(jīng)步驟（1)培養(yǎng)所得的菌液置于 8000-10000rpm離心5-10min，棄上清得濕菌液；于所得濕菌液中添加粉碎細(xì)度為120-250 目的硅藻土或麥飯石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，之后30-40°C條件下進(jìn)行干燥，得固化 后的地衣芽孢桿菌菌株FA08,備用； (3) 干酪乳桿菌菌株DS31的擴(kuò)培：取所述的干酪乳桿菌菌株DS31 (Lacte知ciBm 并將其接種至MRS培養(yǎng)基中，且于30-45°C、搖床150-200rpm下活化培養(yǎng)5-10h; 活化好即得種子液，接著按1-10%接種量將種子液接種至MRS培養(yǎng)基，并于30-45°C、搖床 150-200rpm條件下培養(yǎng) 12-24h; (4) 菌株吸附：于步驟（3)擴(kuò)培后的菌液中添加粉碎細(xì)度120-250目的硅藻土或麥飯石 粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附l-5h; (5) 濃