具有延長的體內(nèi)半壽期的因子ix類似物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是國際申請日為2007年5月24日、國際申請?zhí)枮镻CT/EP2007/055031、進 入國家階段的申請?zhí)枮?00780019090. 7、發(fā)明名稱為"具有延長的體內(nèi)半壽期的因子IX類 似物"的PCT申請的分案申請。
技術(shù)領域
[0002] 本發(fā)明涉及凝血因子IX(FIX)類似物及衍生物，與天然的因子IX相比，它們在血 流中的循環(huán)時間延長。
【背景技術(shù)】
[0003] 因子IXa(FIXa)是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，在止血過程中發(fā)揮重要作用，它是 凝血因子X酶復合物的組成部分，產(chǎn)生大部分的因子Xa，因子Xa在凝血過程中參與凝血酶 的形成（見綜述（Hoffman和Monroe，III2001))。先天性因子IXa缺乏導致X-連鎖出血 性疾病-血友病B，男性發(fā)病率約為1 : 100, 000。目前，血友病B的治療主要是使用重組 或血漿凝血因子IX的替代療法。然而，目前的觀點正由傳統(tǒng)的按需治療轉(zhuǎn)變?yōu)轭A防性治 療。當前的預防性治療需要每周多次給藥，但要達到最佳的血漿濃度和藥效，最好每天注射 一次。但考慮到每天給藥的實用性和經(jīng)濟限制，目前尚不能用于患者的治療。因而，顯然需 要一種長效的重組因子IX藥物。
[0004]W0 2006005058涉及因子IX的一部分與一種或多種分子量為5-150kDa的水溶 性聚合物的結(jié)合體。W0 2006018204涉及修飾的維生素K依賴性多肽，包括修飾的激活 肽。W0 2004101740涉及嵌合蛋白，至少包括一種凝血因子和部分免疫球蛋白恒定區(qū)。TO 2005001025涉及嵌合單體-二聚體雜交蛋白，其中該蛋白的第一條多肽鏈包括部分免疫球 蛋白恒定區(qū)和生物活性分子，第二條多肽鏈包括不含生物活性分子的部分免疫球蛋白恒定 區(qū)。US2006040856涉及因子IX和聚乙二醇的結(jié)合，聚乙二醇通過完整的糖基連接起來并 連接到多肽和修飾基上。
[0005]SE9501285A公開了使用一種混合物在體外合成具有適當折疊和二硫化物交聯(lián) 的生物活性蛋白的方法，該混合物包括蛋白二硫化物氧化還原酶（如蛋白二硫化物異構(gòu)酶 (roi))，谷氧還蛋白和氧化還原體系。參考文獻主要是關于參與分子內(nèi)二硫鍵形成的半胱 氨酸殘基。
[0006]W0 2006/134173涉及至少包含一個非天然半胱氨酸殘基的重組工程化蛋白的選 擇性還原和衍生方法，重組蛋白包括因子IX多肽在內(nèi)。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供修飾的FIX類似物或衍生物，與天然FIX相比，它們在血流中 的循環(huán)時間延長，但仍能維持足夠的生物活性參與凝血。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] -方面，本發(fā)明涉及循環(huán)半壽期延長的FIX類似物，其中在下列位點的天然氨基 酸殘基中至少有一個被結(jié)合（conjugate)化學基團的半胱氨酸殘基殘基取代，所述化學基 團使得FIX多肽的分子量增加，所述位點為第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、 80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、 125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、 240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、 372、374、391、392、406、410、413 或 415 位。
[0009] 在優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點的天然氨基酸殘基中至少有一個被結(jié) 合化學基團的半胱氨酸殘基取代，所述化學基團使得FIX多肽的分子量增加，所述位點為 第 44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80 或 84 位。
[0010] 在另一優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點的天然氨基酸殘基中至少有一個 被結(jié)合化學基團的半胱氨酸殘基取代，所述化學基團使得FIX多肽的分子量增加，所述位 點為第 87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、 125、129、138、140、141 或 142 位。
[0011] 在另一優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點的天然氨基酸殘基中至少有一 個被結(jié)合化學基團的半胱氨酸殘基取代，所述化學基團使得FIX多肽的分子量增加，所述 位點為第 185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、 257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、 413 或 415 位。
[0012] 在另一優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)IX類似物在位點146-180的天然氨基酸殘基中至少有 一個被結(jié)合化學基團的半胱氨酸殘基取代，所述化學基團使得FIX多肽的分子量增加。
[0013] 可以理解，由于位點146-180相當于FIX的活性肽，該活性肽在FIX激活時被釋放 (remove)，那么，對于這樣一種FIX類似物，其中在選自位點146-180的天然氨基酸殘基中 至少有一個被半胱氨酸殘基取代，所述半胱氨酸殘基結(jié)合了使FIX多肽的分子量增加的化 學基團，在類似物激活后，所述化學基團將不存在于類似物中。
[0014] 在另一優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點的天然氨基酸殘基中至少有一個 被結(jié)合化學基團的半胱氨酸殘基取代，所述化學基團使得FIX多肽的分子量增加，所述位 點選自第 155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、167、168、169、170、171、172、173、 174、175、176、177 位。
[0015] 在另一優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)IX類似物在下列位點的天然氨基酸殘基中至少有一個 被結(jié)合化學基團的半胱氨酸殘基取代，所述化學基團使得FIX多肽的分子量增加，所述位 點選自第 160、161、162、163、164、165 和 166 位。
[0016] 在另一優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)IX類似物的氨基酸殘基E162被結(jié)合化學基團的半胱氨 酸殘基取代，所述化學基團使得FIX多肽的分子量增加。
[0017] 另一方面，本發(fā)明涉及循環(huán)半壽期延長的FIX類似物，其C-末端T415后至少附加 一個半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基與化學基團結(jié)合，所述化學基團使得FIX多肽的分子 量增加。
[0018] 在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，與非天然半胱氨酸殘基結(jié)合的化學基團是聚乙二 醇（PEG)。在進一步的優(yōu)選實驗方案中，聚乙二醇的平均分子量是500-100, 000,例如 1000-75, 000 或 2, 000-60, 000。
[0019] 優(yōu)選的FIX類似物，其循環(huán)半壽期至少是野生型FIX半壽期的1. 5倍。
[0020] 在進行凝血實驗時，本發(fā)明優(yōu)選的FIX類似物，其生物活性至少是野生型FIX的 20%。
[0021] 另一方面，本發(fā)明涉及FIX類似物的制備方法，包括以下步驟：a)選擇性還原工程 化（engineered)FIX多肽，該多肽在下列位點至少包含一個非天然半胱氨酸，所述位點選 自第 44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、 104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、 186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、 262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413 或 415 位， 所述非天然半胱氨酸殘基通過二硫鍵與低分子量的硫醇（thiol) (RS-CYS)結(jié)合，方法是使 結(jié)合低分子量硫醇的FIX和含有氧化還原緩沖體系的混合物反應；b)同時或其后，將至少 一個選擇性還原的半胱氨酸（HS-Cys)部分與化學基團結(jié)合。
[0022] 在優(yōu)選實施方案中，制備方法包含氧化還原緩沖體系（redoxbuffer)，氧化還原 緩沖體系包括含有還原型和氧化型谷胱甘肽的混合物。在進一步的優(yōu)選實施方案中，氧化 還原緩沖體系還包括谷氧還蛋白。
[0023] 另一方面，本發(fā)明涉及FIX類似物的制備方法，包括以下步驟：a)選擇性還原工程 化FIX多肽，該多肽在下列位點至少包含一個非天然半胱氨酸，所述位點選自第44、46、47、 50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、 108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、