包含e-鈣粘蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抑制劑的組合療法
【專利摘要】本發(fā)明是基于我們使用E-鈣粘蛋白、包括這種整合膜糖蛋白的可溶性部分進(jìn)行的工作。本發(fā)明的組合物包括治療有效量的靶向E-鈣粘蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域EC2-EC5亞結(jié)構(gòu)域(包括脫落的sEcad片段中的這些結(jié)構(gòu)域)中的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)的表位的第一藥劑，以及抑制下列一種或多種功能或物質(zhì)的第二藥劑：內(nèi)皮管形成；血管生成；人類表皮生長(zhǎng)因子受體家族(即HER1-4)；胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)；任何其他受體酪氨酸激酶受體家族成員；PI3K-MAPK途徑；和PI3K/Akt/mTOR途徑。所述組合物可用于上皮癌的治療，并且可以有效地抑制細(xì)胞增殖、遷移和/或侵入。因此，本發(fā)明的組合物可用于抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的組合物可用于“三陰性”乳腺癌患者(其中乳腺癌細(xì)胞對(duì)雌激素受體、孕酮受體和HER2的試驗(yàn)陰性)以及HER2陽(yáng)性和其他HER2陰性腫瘤的治療。除了治療性和預(yù)防性治療方法之外，本發(fā)明特征性描述了在全長(zhǎng)(FL)E-鈣粘蛋白與可溶性E-鈣粘蛋白(sEcad)的相對(duì)量和/或與癌癥的另一種預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，對(duì)癌癥進(jìn)行分級(jí)的方法。sEcad的量相對(duì)于FL E-鈣粘蛋白的量越大，所述癌癥階段越高。
【專利說(shuō)明】包含E-鈣粘蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抑制劑的組合療法
[0001] 與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/611，390的提交日期利 益和2012年12月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/736, 475的提交日期利益。這些先前申 請(qǐng)的內(nèi)容以其整體通過(guò)參考并入本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研宄的陳述
[0004] 本發(fā)明是在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研宄院（National Institutes of Health)的資助號(hào)為 CA133910和ES015832的政府支持下做出。美國(guó)政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明的組合物和方法涉及對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞粘附蛋白E-鈣粘蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域的可溶性部分sEcad以及MAPK-PI3K/Akt/mT0R、src和凋亡抑制劑（IAP :XIAP，存活素 (surViVin)，livin，c-IAP-l，c-IAP-2)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的細(xì)胞受體或細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)物兩者的 靶向。

【背景技術(shù)】
[0006] E-鈣粘蛋白是幫助維持內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞粘附的整合跨膜糖蛋白。已證實(shí)，E-鈣 粘蛋白功能（全長(zhǎng)）的喪失在皮膚、肺、胃、腸和乳腺的癌癥中引起細(xì)胞去分化、增殖 和增加的侵入性（Brouxhon 等，Cancer Res. 67 (16) :7654-7664, 2007 ；Hirohashi, Am. T. Pathol. 153(2) :333-339, 1998 ;Chen 等，Cancer Lett. 201:97-106, 2003) 〇 此外，在來(lái)自 于乳腺癌患者的活檢樣本中E-鈣粘蛋白染色的喪失，已與不良預(yù)后和短的無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí) 間相關(guān)聯(lián)（Pederson 等，Brit. J. Cancer §1:1281-1286, 2002) 〇
[0007] 全長(zhǎng)蛋白由被命名為EC1-EC5的5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、單一跨膜區(qū) 和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成（參見Shiraishi等，J. Immunol. 175(2) : 1014-1021，2005)。距離細(xì) 胞膜表面最遠(yuǎn)的ECl亞結(jié)構(gòu)域含有在表達(dá)鈣粘蛋白的細(xì)胞（包括表達(dá)E-、N-、P-和R-鈣粘 蛋白的細(xì)胞）中存在的組氨酸-丙氨酸-纈氨酸（HAV)三聯(lián)體，并且該亞結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為對(duì) 于促進(jìn)由E-媽粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸來(lái)說(shuō)是必需的（Beavon, European J. Cancer 並：1607-1620, 2000)。
[0008] 全長(zhǎng)E-鈣粘蛋白在跨膜結(jié)構(gòu)域附近含有用于各種蛋白酶的切割位點(diǎn)，并且在所 述位點(diǎn)處的切割產(chǎn)生被稱為可溶性E-鈣粘蛋白（sEcad)的?80-84kDa的可溶性N-端 肽。sEcad的脫落在正常的未受刺激的上皮細(xì)胞中以低水平組成性地發(fā)生，并且在患有 上皮來(lái)源的腫瘤例如乳腺、皮膚、肺、前列腺、胃和結(jié)腸直腸的癌癥的患者中以高水平發(fā) 生（Banks 等，.Τ· Clin. Pathol. 48:179-180, 1995 :Baranwal 等，13;[0。116111.13;[0卩115^.1^8· Com. 384(1) :6-11. 2009 ：Chan 等，Gut 48:808-811, 2001 ;Charalabopoulos 等，Exp. Oncol.28(I):83-85, 2006 ；Kuefer 等，Clin. Cancer Res. 6447-6452,2003 ;Shirahama 等，J. Dermatol. Sci. 30-36, 1996 ;Velikova 等，Br. J. Cancer 11:1857-1863, 1998)。也 已報(bào)道，在正常的、非癌性狗腎細(xì)胞中，在誘導(dǎo)凋亡后sEcad的脫落增加（Steinhusen等， J. Biol. Chem. 276:4972-4980.2001)0
[0009] 盡管sEcad水平在癌癥患者的尿液或血清中增加，并且在正常細(xì)胞經(jīng) 歷凋亡時(shí)提高，但該脫落的蛋白質(zhì)的生物活性沒(méi)有被充分理解。大量研宄證 實(shí)，sEcad破壞正常的上皮細(xì)胞-細(xì)胞粘附，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分散，并增加腫瘤細(xì) 胞增殖、遷移和侵入（Gil 等，Gynecol. Oncol. 108(2) :361-369. 2008 ：Maretzky 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA102 (26) : 9182-9187, 2005 ;Marambaud 等，EMBO J. 11(8) : 1948-1956, 2002 ;Najy 等，J. Biol. Chem. 283(26) : 18393-18401，2008 ;Noe 等，J. Cell Sci. 114:111-118, 2001 ；Ryniers 等，Biol. Chem.卿：159-165, 2002 ;和 Symowicz等，Cancer Res.^I(5):2030-2039, 2007)。調(diào)節(jié)這些生物功能的信號(hào)傳導(dǎo)途 徑仍不清楚。使用SKBr3乳腺癌細(xì)胞系的研宄證實(shí)，sEcad-HER2復(fù)合物受到純化的細(xì) 胞外融合蛋白（Fc-sEcad)的外源添加、引起細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶（ERK)激活的誘導(dǎo) (Najy 等，J. Biol. Chem. 283 (26) : 18393-18401，2008)。人類 EGF 受體屬于受體酪氨酸 激酶的ErbB或HER家族，其在許多上皮腫瘤中過(guò)表達(dá)或失調(diào)（Mendelsohn和Baselga， Oncogene 19:6550-6565. 2000 ：Burgess. Growth Factors 並：263-274,2008)。這個(gè) 受體家族激活下游信號(hào)傳導(dǎo)分子例如ERK，其進(jìn)而激活各種癌細(xì)胞行為，包括細(xì)胞增 殖、遷移、侵入和血管生成（Hanahan 和 Weinberg, Cell 100:57-70, 2000 :Shields 等, Trends Cell Biol.邊:147-154, 2000)。因此，已開發(fā)了大量抗EGF療法。這些療法包 括小分子酪氨酸激酶抑制劑、單克隆抗體和癌癥疫苗（Fukuoka等，Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 2Λ: 292a Absl 188, 2002 ;Lage 等，A nn. Med.迎：327-336 (2003) ;Mateo 等， Immunotechnology2:71-81，1997 ;Slamon 等，Ν· Engl. J. Med. 344:783-792, 2001 ;和 Yu 等， J. Clin. Invest. UO:289-294, 2002)。這些治療策略的限制在于只有一些腫瘤在確定的成 熟階段表達(dá)所述特定受體/抗原，不是所有具有一定組織學(xué)和階段的腫瘤都過(guò)表達(dá)目標(biāo) 受體/抗原（只有20%至50%的乳腺癌過(guò)表達(dá)EGF受體）。因此，對(duì)這些類型的藥物的 響應(yīng)率仍然低（Mendelson 和 Baselga, Oncogene 6550-6565, 2000 ;0rtega 等，Cancer Control 11(1) :7-15, 2010)。此外，一開始對(duì)這些藥物具有響應(yīng)性的腫瘤最終發(fā)展出獲得 性抗性（Jackman 等，Clin. Cancer Res. 3908-3914, 2006 ;0rtega 等，Cancer Control 11(1) :7-15, 2010 ;和 Riely 等，Clin. Cancer Res. 1^:839-844, 2006) 〇
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明是基于我們使用E-鈣粘蛋白、包括這種整合膜糖蛋白的膜結(jié)合和可溶性 部分兩者的工作。更具體來(lái)說(shuō)，本文中描述的組合物和方法至少部分涉及我們證實(shí)了可溶 性E-鈣粘蛋白調(diào)節(jié)受體酪氨酸激酶、有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK)和P13K/Akt/mT0R 信號(hào)傳導(dǎo)的工作。在第一方面中，本發(fā)明的組合物包含治療有效量的第一藥劑，所述第一 藥劑特異性靶向E-鈣粘蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域（分別為EC2、 EC3、EC4和EC5(合稱EC2-EC5))或其可溶性E-鈣粘蛋白（sEcad)片段中的這些亞結(jié)構(gòu) 域中的一個(gè)或多個(gè)，但是不特異性靶向E-鈣粘蛋白或sEcad的第一亞結(jié)構(gòu)域（ECl)。這些 sEcad抑制劑可以與第二藥劑組合或聯(lián)合使用，所述第二藥劑抑制下列一種或多種：內(nèi)皮 管形成；血管生成；胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（例如IGF-1R);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)受 體（VEGFR(例如貝伐單抗）），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體（例如TGFB-I/II)，波形蛋白/波形蛋白 脫落物，src，受體酪氨酸激酶的ErbB家族中的一種受體（例如HERl (前提是排除西妥昔 單抗和帕尼單抗）、HER2 (前提是排除曲妥珠單抗）、HER3和HER4);其他受體酪氨酸激酶 (例如 PDGF、FGF、HGF、RET、Axl、KLG、DDR、LTK、ROR、Tie、Trk、RYK、Eph 或 MuSK 受體家族 中的受體（尤其是通過(guò)MAPK-PI3K/Akt/mT0R信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的受體））；src， Ras-Raf-MEK-ER途徑；以及PI3K/Akt/mT0途徑。第一和第二藥劑的量合在一起是治療有 效的。在特定實(shí)施方式中，所述第一藥劑特異性靶向EC4和/或EC5、特異性靶向EC4或特 異性靶向EC5。
[0012] 在本發(fā)明的藥物組合物中。所述第一藥劑或第二藥劑可以是蛋白質(zhì)支架，并且所 述支架可以是抗體。例如，但所述第一藥劑是抗體時(shí)，它可以是抗體或其生物活性片段，所 述生物活性片段特異性結(jié)合包含以下氨基酸殘基的表位，所述氨基酸殘基在E-鈣粘蛋白 胞外結(jié)構(gòu)域或其sEcad片段的EC2、EC3、EC4或EC5亞結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)中、但不在 E-媽粘蛋白或sEcad的ECl亞結(jié)構(gòu)域中。無(wú)論是起到第一藥劑還是第二藥劑的作用，所述 抗體可以是嵌合、人源化或人類抗體、單鏈抗體或單克隆或多克隆抗體，并且任何抗體或抗 體類型可以偶聯(lián)到藥物以形成抗體藥物偶聯(lián)物。所述抗體可以是免疫球蛋白G(IgG)類或 免疫球蛋白M(IgM)類的。任何抗體可以被可檢測(cè)地標(biāo)記。應(yīng)該理解，在可以使用本文中描 述的抗體的任何情況下，該抗體的生物活性變體也可以使用。
[0013] 所述第二藥劑可以是特異性結(jié)合受體酪氨酸激酶的蛋白質(zhì)支架。例如，所述第二 藥劑可以是本文中寬泛描述的抗體、包括其生物活性片段，其抑制HERl、HER2、HER3和/或 HER4的任何組合或其他受體酪氨酸激酶。因此，所述蛋白質(zhì)支架可以是泛HER抑制劑。盡 管所述蛋白質(zhì)支架不限于通過(guò)任何特定機(jī)制行使其功能的支架，但所述支架可以抑制HER2 的二聚化。更具體來(lái)說(shuō)，所述第二藥劑可以是帕妥珠單抗、厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、 西妥昔單抗或卡奈替尼或其生物活性變體。
[0014] 所述第一和/或第二藥劑也可以是核酸或小分子（例如小的有機(jī)化合物），其抑 制本文中所描述的靶（例如受體酪氨酸激酶如HER1、HER2、HER3、HER4、VEGFR、IGFR (例如 IGF-1R)、FGF、HGF、H)GF、Eph和/或本文中描述的和本領(lǐng)域中已知的任何其他靶）。在一 種實(shí)施方式中，本發(fā)明特征性描述了一種藥物組合物，其包含第一藥劑和第二藥劑，其中所 述第一藥劑特異性靶向E-鈣粘蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的或其可溶性E-鈣粘蛋白（sEcad)片段的 第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域（分別為EC2、EC3、EC4和EC5)中的一個(gè)或多個(gè)，但是不靶 向E-鈣粘蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的或sEcad的第一亞結(jié)構(gòu)域（ECl)，并且所述第二藥劑是阿柏西 普、凡德他尼、AG1024或NVP-ADW742。與本發(fā)明的任何其他雙藥劑組合物中相同，所述第一 和第二藥劑的量合在一起可以是治療有效的。
[0015] 代替給藥特異性結(jié)合本文中所描述的E-鈣粘蛋白亞結(jié)構(gòu)域的第一或第二藥劑， 人們也可以給藥在給定患者中引發(fā)這樣的藥劑（抗體）的生產(chǎn)的藥劑。例如本發(fā)明特征性 描述了包含第一藥劑和第二藥劑的藥物組合物，其中所述第一藥劑是包含來(lái)自于E-鈣粘 蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的或其可溶性E-鈣粘蛋白（sEcad)片段的EC2-EC5亞結(jié)構(gòu)域（正如在其 他實(shí)施方式中那樣，排除ECl亞結(jié)構(gòu)域）中的一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列的抗原性多肽?；?者，所述第一藥劑可以是這些多肽的抗原活性片段或其他變體，或包含編碼所述抗原性多 肽或其抗原活性片段或其他變體的核酸序列的表達(dá)載體。所述第二藥劑可以是本文中描述 的任何第二藥劑。例如，所述第二藥劑可以是阿柏西普、凡德他尼、AG1024或NVP-ADW742。 在其他實(shí)施方式中，所述第二藥劑可以抑制MPK細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑或PI3K/Akt/mTOR信 號(hào)傳導(dǎo)途徑中的效應(yīng)物。
[0016] 在任何本發(fā)明的組合物中，所述第一藥劑或第二藥劑可以被可檢測(cè)地標(biāo)記（允許 治療和診斷兩種或預(yù)后使用）。在任何本發(fā)明的組合物中，所述第二藥劑可以是MEK抑制劑 ⑶C-0973, ERK 抑制劑，PI3K 抑制劑⑶C-0941、GSK1059615、BKM120 或⑶C0941，Akt 抑制劑 哌立福辛或MK2206, mTOR抑制劑坦西莫司、依維莫司、雷帕霉素或AZD8055, p70S6K抑制劑 LY2584702,或 PI3K/mT0R 抑制劑 NVP-BEZ235 或 p70S6K/Akt 抑制劑 LY2780301。
[0017] 本文中描述的任何藥物組合物可以被配制成使得所述組合物殺死表達(dá)E-鈣粘蛋 白的惡性細(xì)胞，但是不以任何明顯的程度殺死非惡性細(xì)胞。盡管本發(fā)明不受其作用機(jī)制的 限制，但表達(dá)E-鈣粘蛋白的惡性細(xì)胞的死亡可以被程序化細(xì)胞死亡、生長(zhǎng)停滯、失巢凋亡、 壞死或自吞噬誘導(dǎo)。在某些情況下，所述組合物可以在表達(dá)E-鈣粘蛋白的惡性細(xì)胞中誘導(dǎo) 衰老或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
[0018] 本文中描述的任何藥物組合物可以不含細(xì)胞毒性量的任何載體、稀釋劑或賦形 劑。同樣地，利用排除，可以從給定組合物中明確排除本文列出的任何給定藥劑。例如，當(dāng) 本發(fā)明人教示組合物可以包括A、B或C時(shí)，應(yīng)該理解所述組合物可以包括例如A和B并排 除C。
[0019] 本文中描述的藥物組合物可以以藥物制劑的形式遞送，使得：(a)在給藥于患者 后，產(chǎn)生約l-50mg/kg(例如約l-8mg/kg)的第一藥劑的血清水平，或者（b)在添加到細(xì)胞 培養(yǎng)物后，產(chǎn)生約1-500 μ g/mL細(xì)胞培養(yǎng)基（例如約200-400 μ g/mL)的第一藥劑濃度。所 述第一和第二藥劑的量合在一起是治療有效的。
[0020] 所述組合物可用于上皮癌的治療，并且可以有效地抑制細(xì)胞增殖、迀移和/或侵 入。因此，本發(fā)明的組合物和方法可用于抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移（例如通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、迀 移和/或侵入）。本發(fā)明的組合物和方法可用于"三陰性"乳腺癌患者（其中乳腺癌細(xì)胞對(duì) 雌激素受體、孕酮受體和HER2的試驗(yàn)陰性）的治療。除了治療性和預(yù)防性治療方法之外， 本發(fā)明特征性描述了根據(jù)全長(zhǎng)（FL)E-鈣粘蛋白和可溶性E-鈣粘蛋白（sEcad)的相對(duì)量對(duì) 癌癥進(jìn)行分級(jí)的方法。sEcad的量相對(duì)于FL E-1?粘蛋白的量越大，所述癌癥等級(jí)越高。
[0021] 給藥抗E-鈣粘蛋白抗體的方法涵蓋了劑量特異性療法，并且所述療法可以被選 擇性地導(dǎo)向乳腺、肺、GI道（例如食管、胃、腸、結(jié)腸）、胰腺、膀胱、前列腺、皮膚、口腔和頭頸 癌癥、其他上皮癌和源自于外胚層的組織（例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼的晶狀體、顱和感覺神經(jīng) 節(jié)和神經(jīng)以及頭中的結(jié)締組織）的癌癥并對(duì)所述癌癥具有細(xì)胞毒性。本文中描述的治療性 和預(yù)防性方法，可以與其他細(xì)胞毒性療法（例如化療、激素療法、放療和小分子抑制劑，基 于抗體的療法（例如抗EGF單克隆抗體療法））相結(jié)合進(jìn)行。
[0022] 更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明特征性描述了通過(guò)向需要治療的患者給藥本文中描述的藥物 組合物來(lái)治療癌癥的方法。所述癌癥可以是上皮化組織內(nèi)的癌癥；所述癌癥可以是消化道 (例如□、咽喉、食管、胃、腸、結(jié)腸、直腸或肛門）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、乳腺、皮膚（例如鱗狀細(xì)胞 癌或黑素瘤）、生殖系統(tǒng)（宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、外陰或陰唇癌、前列腺癌、睪丸癌或男性 生殖道的癌癥）、肺或尿道的癌癥。任何方法均可以包括提供來(lái)自于所述患者的生物樣品， 以及確定所述樣品是否包含高水平的sEcad和/或癌癥的另一種預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的步 驟。所述生物樣品可以是尿液、唾液、腦脊液、血液、糞便或活檢樣品，并且這一步驟可以在 給藥所述藥物組合物之前進(jìn)行。sEcad和/或癌癥的另一種預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的高水平，指 示了所述患者是所述治療的良好候選者。所述評(píng)估步驟也可以在給藥所述藥物組合物后的 一個(gè)或多個(gè)時(shí)間進(jìn)行，并且sEcad和/或癌癥的另一種預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的降低的水平指 示了所述患者對(duì)所述治療響應(yīng)良好。
[0023] 正如在整個(gè)本發(fā)明中注意到的，本發(fā)明的組合物可以包括超過(guò)一種治療藥劑。例 如，抑制sEcad的藥劑（例如抗sEcad抗體）可以與另一種治療藥劑例如細(xì)胞毒性劑或癌 癥化療劑（其許多在本文中具體描述）一起給藥。在本發(fā)明的藥物組合物中，所述第一和 第二藥劑可以被物理合并在單一劑型中。然而，任何組合療法也可以通過(guò)患者接受兩種劑 型（一種含有第一治療藥劑，另一種含有第二治療藥劑）的方法進(jìn)行遞送。因此，在本發(fā)明 的方法中，可以各自不同地遞送兩種或更多種治療藥劑。在某些情況下，患者可以同時(shí)接受 兩種或更多種治療藥劑。在某些情況下，患者可以接受兩種或更多種治療藥劑的并行給藥； 并行給藥不要求所述藥劑在同一時(shí)間或通過(guò)相同途徑給藥，只要在所述藥劑發(fā)揮它們的治 療效果的時(shí)間段中存在重疊即可。本發(fā)明的方法還涵蓋了順序給藥，在這種情況下，在治療 方案中，患者用第一藥劑治療，并且在所述第一藥劑完成后，用第二藥劑治療。兩種藥劑的 給藥可以相隔數(shù)日、數(shù)周或數(shù)月。因此，本發(fā)明不僅涵蓋了含有第一和第二藥劑（本文中描 述的任何第一藥劑和任何第二藥劑）的組合物，而且涵蓋了包含用于組合療法的第一和第 二藥劑（不論是同時(shí)、重疊還是順序）的試劑盒，并且本發(fā)明的方法同樣地涵蓋了同時(shí)、以 重疊方式或順序地使用兩種或更多種藥劑的治療。
[0024] 在特定方面中，本發(fā)明特征性描述了一種藥物組合物，其包括第一藥劑和第二藥 劑，其中：所述第一藥劑是包含以下氨基酸序列的抗原性多肽或其抗原活性片段或其他變 體，或包含編碼所述抗原性多肽或其抗原活性片段或其他變體的核酸序列的表達(dá)載體，所 述氨基酸序列來(lái)自E-鈣粘蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域EC2-EC5亞結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)但是不來(lái) 自ECl亞結(jié)構(gòu)域，所述EC2-EC5亞結(jié)構(gòu)域包括脫落的sEcad片段中的這些胞外結(jié)構(gòu)域；所述 第二藥劑抑制HERl (前提是西妥昔單抗和帕尼單抗除外）；抑制HER2 (前提是曲妥珠單抗 除外）；抑制HER3 ;抑制HER4 ;抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR);或抑制胰島素樣生長(zhǎng) 因子受體（IGFR);或抑制可能通過(guò)或可能不通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)傳導(dǎo)信號(hào) 的任何其他受體酪氨酸激酶受體家族。
[0025] 附圖簡(jiǎn)述
[0026] 圖IA示出了人類E-鈣粘蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO :1)，其中細(xì)胞外亞結(jié)構(gòu) 域EC2-EC5用交替的下劃線標(biāo)明（EC2和EC4用雙線下劃，EC3和EC5用單線下劃）。
[0027] 圖IB是野生型人類E-鈣粘蛋白的示意圖，其中標(biāo)出了 sEcad。所述可溶性片段的 長(zhǎng)度可變，并且可能終止在第四或第五細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中，或者在其他情況下終止在跨膜結(jié) 構(gòu)域中（參見例如 Noe 等，Cell Sci. 114(1) : 111-118. 2000 的研究）。
[0028] 詳細(xì)描述
[0029] 正如下面進(jìn)一步描述的，我們?cè)囼?yàn)了在上皮癌細(xì)胞和非癌性細(xì)胞兩者 的組中，靶向E-鈣粘蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的各種可商購(gòu)的單克隆和多克隆抗 體，包括 Espada 等（J. Cell Physiol. 219:84-93, 2009) > Fouguet 等（了.13;[01· Chem.279(41):43061-43069. 2004)和 Galaz 等（J. Cell Physiol. 205(1):86-96. 2005) 使用的DECM-I抗體的有效性。當(dāng)我們重復(fù)這些試驗(yàn)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)以低至40 μ g/mL的 濃度使用這一抗體，令人吃驚地在癌細(xì)胞（即MCF-7、SCC12b、SCC13、CRL-1555、PAM212、 SP308和KLN205細(xì)胞）和用作對(duì)照的非癌性細(xì)胞（即人類乳腺上皮細(xì)胞以及PHK和 PMK細(xì)胞）兩者中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。此外，以相同濃度（40 μ g/mL)使用對(duì)照IgG同種 型抗體治療這些癌癥和非癌性細(xì)胞，在兩種類型的細(xì)胞中也誘導(dǎo)了相同水平的細(xì)胞死 亡。這些數(shù)據(jù)建議了在抗體施用后細(xì)胞死亡的非特異性誘導(dǎo)。在我們的實(shí)驗(yàn)室中，施 用靶向E-鈣粘蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域EC2-EC5的抗體的更稀的溶液（10-20 μ g/mL的低 劑量），僅在癌細(xì)胞中明顯地通過(guò)凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。我們沒(méi)有觀察到對(duì)非癌性細(xì)胞的 不利效應(yīng)。此外，以10-20 μ g/mL的濃度向非癌性細(xì)胞施用對(duì)照IgG同種型，總的來(lái)說(shuō) 對(duì)細(xì)胞存活性沒(méi)有可檢測(cè)的影響。這些10-20 μ g/mL之間的濃度比Espada等（J. Cell Physiol. 219:84-93. 2009). Fouauet 等(T. Biol. Chem. 279(41) :43061-43069. 2004)和 Galaz 等（J. Cell Physiol. 205 (I) :86-96, 2005)使用的濃度低?20-50 倍。因此，我們預(yù) 計(jì)本發(fā)明的藥物制劑和制備物可以作為低劑量制劑制造并使用（例如以比Espada和其他 人在以前的研宄中所建議的更低的劑量），并且這樣的制劑被本發(fā)明所涵蓋。盡管本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到劑量可以隨著多種考慮因素而變，但本發(fā)明的組合物和方法可以涉 及其中對(duì)癌細(xì)胞觀察到所需效果，同時(shí)非癌性細(xì)胞保持不受影響或基本上不受影響的雙藥 劑組合物的劑量。正如上面描述的，外源施用10-20 μ g/mL的針對(duì)E-鈣粘蛋白的EC2-EC5 亞結(jié)構(gòu)域的抗體（單克隆或多克?。x擇性地殺死一組代表性的人類和小鼠腫瘤細(xì)胞系。 這些濃度在本發(fā)明的組合物和方法中可能有用，或者至少將起到幫助鑒定具有"低劑量"特 點(diǎn)的臨床上有用的制劑的作用。我們還有數(shù)據(jù)顯示這樣的抗體對(duì)HT29人類結(jié)腸細(xì)胞系、 NCI-H292人類肺細(xì)胞系和KLN205鼠類肺癌細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性。因此，本發(fā)明的組合物和 方法可以針對(duì)患有結(jié)腸癌或肺癌（兩種流行和災(zāi)難性的癌癥類型）的患者的治療。此外， 我們證實(shí)了非癌性細(xì)胞、包括正常人類乳腺上皮細(xì)胞、正常人類和小鼠角化細(xì)胞、小鼠3T3 成纖維細(xì)胞和人類內(nèi)皮細(xì)胞，在我們的以低濃度使用靶向所述亞結(jié)構(gòu)域的抗體的分析中保 持不受影響。在上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中靶向E-鈣粘蛋白的EC2-EC5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的各種 組合誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的分子途徑，尚未被闡明。然而，我們證實(shí)了垂死的癌細(xì)胞上調(diào)促凋亡標(biāo) 志物P53 ;在用針對(duì)E-鈣粘蛋白EC2-EC5結(jié)構(gòu)域的抗體治療后，我們?cè)贛CF-7乳腺癌、小鼠 SCC和小鼠 KLN205肺癌細(xì)胞系中觀察到了這種上調(diào)。
[0030] 正如上面提到的，本發(fā)明的組合物包括特異性靶向E-鈣粘蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 的EC2、EC3、EC4和EC5結(jié)構(gòu)域（即EC2-5)、包括脫落的sEcad片段（EC2-5)(在本文中被 稱為sEcad)中的一個(gè)或多個(gè)的藥劑。然而，這些藥劑不特異性革El向ECl亞結(jié)構(gòu)域。所述藥 劑隨后可能抑制sEcad，或者它們可能在腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中結(jié)合、抑制或螯合另一個(gè)靶例如 細(xì)胞存活受體。盡管本發(fā)明的組合物不限于通過(guò)任何特定機(jī)制發(fā)揮其效果的組合物，但我 們的工作假設(shè)是本發(fā)明的藥劑干擾sEcad提供有益于癌細(xì)胞的信號(hào)的能力。例如，我們假 設(shè)癌細(xì)胞將sEcad分泌到微環(huán)境中，在那里它提供模擬正常的細(xì)胞-細(xì)胞接觸的功能性支 架。因此，從腫瘤微環(huán)境真實(shí)或有效地移除sEcad，擾亂了腫瘤細(xì)胞保持粘附和存活的能力。 在其他情況下，本發(fā)明的藥劑可以通過(guò)結(jié)合sEcad上與另一種細(xì)胞靶（例如HER-2)相互作 用的表位來(lái)抑制sEcad活性，從而改變參與細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、細(xì)胞迀移和/或侵入的下 游信號(hào)傳導(dǎo)事件?？商孢x地或此外，藥劑可能不結(jié)合sEcad信號(hào)傳導(dǎo)所需的特定表位，而是 可能以螯合、標(biāo)記或靶向sEcad以進(jìn)行破壞的方式結(jié)合sEcad，從而降低它在腫瘤微環(huán)境中 的濃度并使其不可用于模擬細(xì)胞-細(xì)胞相互作用或結(jié)合于細(xì)胞受體。例如，藥劑和組合物 可能通過(guò)例如結(jié)合E-鈣粘蛋白并阻斷切割位點(diǎn)或以其他方式阻斷或抑制sEcad的釋放，來(lái) 減少sEcad脫落。因此，本文中所描述的組合物或藥劑可以特異性靶向EC2-EC5亞結(jié)構(gòu)域 中的一個(gè)或多個(gè)，通過(guò)干擾特定表位或事實(shí)上降低sEcad水平有效地阻止sEcad提供一種 或多種否則將存在的信號(hào)。
[0031] 為了易于閱讀，我們可以將特異性靶向sEcad的EC2-EC5亞結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或 多個(gè)中的氨基酸殘基但是不特異性靶向sEcad的第一亞結(jié)構(gòu)域（ECl)中的氨基酸殘基的 藥劑，更簡(jiǎn)單地稱為靶向藥劑。本發(fā)明的靶向藥劑可以是蛋白質(zhì)支架例如修飾的纖連蛋白 結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白或其片段或其他變體，其特異性結(jié)合E-鈣粘蛋白和脫落的sEcad的 EC2-EC5亞結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)（而非ECl結(jié)構(gòu)域）中的氨基酸殘基。當(dāng)所述藥劑是或 包括蛋白質(zhì)（例如蛋白質(zhì)支架或抗原性多肽）時(shí)，我們可以將所述藥劑稱為基于蛋白的治 療劑。我們傾向于使用術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"來(lái)指稱較長(zhǎng)的氨基酸聚合物，并且我們傾向于使用術(shù) 語(yǔ)"多肽"來(lái)指稱較短的序列或較大分子或復(fù)合物內(nèi)的氨基酸殘基鏈。然而，兩個(gè)術(shù)語(yǔ)都打 算描述兩個(gè)或更多亞基氨基酸、氨基酸類似物或其他肽模擬物的實(shí)體，不論是否存在翻譯 后修飾（例如酰胺化、磷酸化或糖基化）。亞基氨基酸殘基可以通過(guò)肽鍵或其他鍵例如酯或 醚鍵相連。術(shù)語(yǔ)"氨基酸"和"氨基酸殘基"是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，其可 能是D-或L-型光學(xué)異構(gòu)體。
[0032] 抗sEcad抗體可以采取各種構(gòu)型，并涵蓋由基本上由免疫球蛋白基因編碼的一個(gè) 或多個(gè)多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)?？梢允褂酶鞣N抗體結(jié)構(gòu)中的任一種，包括完整抗體、抗體多聚體 或抗體片段或其包括抗體的功能性抗原結(jié)合區(qū)域的其他變體。我們可以與"抗體"同義地 使用術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"?？贵w在來(lái)源上可能是單克隆或多克隆的。不論抗體的來(lái)源如何， 適合的抗體包括完整抗體例如具有兩條重（H)鏈和兩條輕（L)鏈的IgG四聚體、單鏈抗體、 嵌合抗體、人源化抗體、互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)嫁接抗體和抗體片段例如Fab、Fab'、F(ab'）2、 scFv、Fv，以及源自于這樣的片段的重組抗體，例如camelbodies、微抗體、雙抗體和雙特異 性抗體。
[0033] 完整抗體是包含抗原結(jié)合性可變區(qū)（VjPVJ以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域（CJ和重鏈 恒定結(jié)構(gòu)域C H1、Ch2和Ch3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是本源序列恒定結(jié)構(gòu)域（例如人類本 源序列恒定結(jié)構(gòu)域）或其氨基酸序列變體。正如在本領(lǐng)域中公知的，％和V l區(qū)被進(jìn)一步 細(xì)分成被稱為"互補(bǔ)性決定區(qū)"（CDR)的高變區(qū)，其散布在更保守的框架區(qū)（FR)中。FR 和⑶R的范圍已被確定（參見Kabat等，《免疫學(xué)重要的蛋白質(zhì)的序列》（Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，美國(guó)衛(wèi)生和人類服務(wù)部（U.S. Department of Health and Human Services)，NIH 出版號(hào) 91-3242, 1991，和 Chothia 等，J. Mol. Biol. 1^:901-917 (1987)?？贵w的⑶R通常包括合在一起限定了本源免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn) 的天然Fv區(qū)的結(jié)合親和性和特異性的氨基酸序列。
[0034] 抗sEcad抗體可以來(lái)自于任何類型的免疫球蛋白例如IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(及 其亞型（例如IgG 1UgG^ IgG3和IgG4)),并且免疫球蛋白的輕鏈可以是κ或λ型。公認(rèn) 的人類免疫球蛋白基因包括 κ、λ、a (IgAJP IgA2)、γ (IgGp IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε 和 μ恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。
[0035] 術(shù)語(yǔ)免疫球蛋白或抗體的"抗原結(jié)合部分"一般是指免疫球蛋白的特異性結(jié)合靶 的部分，在本發(fā)明的情形中，所述靶是包含sEcad的第二至第五亞結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè) 內(nèi)或其之間（例如第四和第五亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)或之間）的氨基酸殘基的表位。因此，免疫球蛋 白的抗原結(jié)合部分是其中一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白鏈不是全長(zhǎng)，但是特異性結(jié)合細(xì)胞靶的分 子?？乖Y(jié)合部分或片段的實(shí)例包括：（i)Fab片段，其是由VLC、VHC、CL和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成 的單價(jià)片段；（ii) F (ab'）2片段，其是包含在鉸鏈區(qū)處通過(guò)二硫橋相連的兩個(gè)Fab片段的二 價(jià)片段；（iii)Fv片段，其由抗體的單個(gè)臂的VLC和VHC結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；以及（V)具有足以進(jìn) 行特異性結(jié)合的框架的分離的CDR，例如可變區(qū)的抗原結(jié)合部分。輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部 分和重鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分例如Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VLC和VHC，可以使用重組方法 通過(guò)合成的連接物相連，所述連接物能夠?qū)⑺鼈冎圃斐蓡我坏鞍祖?，其中VLC和VHC區(qū)成對(duì) 以形成單價(jià)分子（被稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird等，Science 242:423-426 (1988)； 以及 Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 班:5879-5883 (1988))。這樣的 scFv 可以是本 發(fā)明的靶向藥劑，并且被術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"所涵蓋。
[0036] "Fv"片段是含有完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。這一區(qū)域由緊密的 非共價(jià)結(jié)合的一條重鏈和一條輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的二聚體構(gòu)成。正是在這種構(gòu)造中，每個(gè) 可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用，以限定V h-'二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。盡管6個(gè) 高變區(qū)賦予抗原結(jié)合特異性，但即使是單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域（或僅包含特異性針對(duì)抗原的3個(gè) 高變區(qū)的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和性比完整的結(jié)合位點(diǎn)低。為了 提高穩(wěn)定性，可以將VH-VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)柔性肽連接物例如（Gly 4Ser)3相連，以形成單鏈Fv 或scFV抗體片段，或者可以通過(guò)在框架區(qū)中引入兩個(gè)半胱氨酸殘基進(jìn)行工程化改造以形 成二硫鍵，從而產(chǎn)生二硫鍵穩(wěn)定化的Fv (dsFv)。
[0037] 正如提到的，其他有用的抗體格式包括雙抗體、微型抗體和雙特異性抗體。雙抗體 是通過(guò)短的肽連接物（約5個(gè)氨基酸或更短）共價(jià)連接的scFv的同二聚體。通過(guò)使用短 到無(wú)法在同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的連接物，可以迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ) 結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)（對(duì)于關(guān)于雙抗體的其他信息，參見例如EP404, 097 和TO 93/11161)。可用于本發(fā)明的組合物和方法的雙抗體變體（(^?￥)2或線性抗體包括 一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段（V h-ChI-Vh-ChI)，其形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)（參見例如Zapata等，Prot. Eng. 1057 (1995))。有用的微型抗體是ScFv-Ch3融合蛋白的同二聚體。在微型抗體的變 體Flex微型抗體中，將scFv融合到IgGl的鉸鏈區(qū)，其進(jìn)而通過(guò)10個(gè)氨基酸的連接物連接 到01 3區(qū)。
[0038] 識(shí)別兩個(gè)不同表位的雙特異性抗體也可以使用，只要一個(gè)臂特異性結(jié)合本文中所 描述的sEcad即可。已經(jīng)開發(fā)了各種不同的雙特異性抗體格式。例如，有用的雙特異性抗 體可以是四價(jià)體瘤，即其中每個(gè)H-L對(duì)源自于不同抗體的完整抗體。四價(jià)體瘤通常通過(guò)兩 種不同的B細(xì)胞雜交瘤的融合，然后對(duì)融合的細(xì)胞進(jìn)行篩選以選擇維持兩套純系型免疫球 蛋白基因的表達(dá)的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。或者，雙特異性抗體可以是重組抗體。雙特異性抗體的示 例性格式包括但不限于其中兩條不同特異性的單鏈通過(guò)肽連接物相連的串聯(lián)的scFv ;雙 抗體和單鏈雙抗體。
[0039] 抗體的片段適合用于所提供的方法中，只要它們保留全長(zhǎng)抗體的所需特異性和/ 或足夠的特異性，以抑制癌細(xì)胞存活、增殖或轉(zhuǎn)移即可。因此，本文中所描述的抗sEcad抗 體的片段，可以保留完整抗體的結(jié)合所列亞結(jié)構(gòu)域的能力。這些抗體部分可以使用本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)來(lái)獲得，并且所述部分可以以與篩選完整抗體作為抗癌藥劑 相同的方式來(lái)篩選使用。
[0040] 制備抗體片段的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且涵蓋生物化學(xué)方法（例如完整 抗體的蛋白水解消化，其隨后可以進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)）和基于重組DNA的方法兩者，在所述基 于重組DNA的方法中，對(duì)免疫球蛋白序列進(jìn)行遺傳工程改造，以指導(dǎo)所需片段的合成。示 例性的生物化學(xué)方法描述在美國(guó)專利號(hào)5, 855, 866、5, 877, 289、5, 965, 132、6, 093, 399、 6, 261，535和6, 004, 555中?？梢员磉_(dá)編碼嵌合或人源化鏈的核酸以產(chǎn)生連續(xù)的多肽。參 見例如Cabilly等，美國(guó)專利號(hào)4, 816, 567 ;Cabilly等，歐洲專利號(hào)0, 125, 023B1 ;Boss等， 美國(guó)專利號(hào) 4, 816, 397 ;Boss 等，歐洲專利號(hào) 0, 120, 694B1 ;Neuberger 等，WO 86/01533 ; Neuberger 等，歐洲專利號(hào) 0, 194, 276B1 ;Winter,美國(guó)專利號(hào) 5, 225, 539 ;和 Winter, 歐洲專利號(hào)〇, 239, 400B1。關(guān)于⑶R嫁接的抗體，也參見Newman等，BioTechnology 叢:1455-1460(1992)，并且關(guān)于單鏈抗體，也參見1^(11^1'等（美國(guó)專利號(hào)4,946,778)和 Bird 等，Science 242:423-426(1988) 〇
[0041] 抗體片段可以通過(guò)完整的免疫球蛋白被非特異性巰基蛋白酶木瓜蛋白酶的蛋白 水解來(lái)獲得。木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生被稱為"Fab片段"的兩個(gè)一致的各自具有單個(gè)抗原結(jié)合 位點(diǎn)的抗原結(jié)合片段，以及剩余的"Fc片段"。各種不同級(jí)份可以通過(guò)蛋白A-Sepharose或 離子交換層析來(lái)分離。從兔和人類來(lái)源的IgG制備F (ab'）2片段的常用程序，是通過(guò)胃蛋白 酶的有限蛋白水解。完整抗體的胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab'） 2片段，其具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn) 并仍能交聯(lián)抗原。Fab片段含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域（CHl)。Fab' 片段與Fab片段的區(qū)別在于在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端處增添了幾個(gè)殘基，包括來(lái)自于抗 體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。F(ab'） 2抗體片段最初作為在其之間具有鉸鏈半胱氨酸 的成對(duì)的Fab'片段產(chǎn)生?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)是已知的。
[0042] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括制造靶向藥劑（例如抗體或其抗原結(jié)合片段或其 他變體）的方法，所述靶向藥劑通過(guò)例如特異性結(jié)合sEcad的第二、第三、第四或第 五亞結(jié)構(gòu)域（或結(jié)合包括兩個(gè)或更多這些亞結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基的表位）來(lái)靶向 sEcad。例如，可以使用PCR突變方法來(lái)構(gòu)建可變區(qū)，以改變編碼免疫球蛋白鏈的DNA序 列（例如使用用于產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的方法；參見例如Kanunan等，Nucl. Acids Res. 17:5404, 1989 ;Sato 等，Cancer Research 53:851-856, 1993 ;Daugherty 等，Nucleic Acids Res. (9) :2471-2476, 1991 ;以及 Lewis 和 Crowe, Gene 101:297-302. 1991)。使用 這些或其他適合的方法，也可以容易地產(chǎn)生變體。例如，在一種實(shí)施方式中，可以將克隆的 可變區(qū)突變，并且可以選擇編碼具有所需特異性的變體的序列（例如從噬菌體文庫(kù)；參見 例如 Krebber 等，美國(guó)專利號(hào) 5, 514, 548 ;和 Hoogenboom 等，WO 93/06213) 〇
[0043] 生產(chǎn)或分離特異性識(shí)別本文中所描述的細(xì)胞靶的免疫球蛋白的其他適合的方法 包括例如依賴于能夠產(chǎn)生人類抗體的完整譜的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（例如小鼠）的免疫的方法（參 見例如 Jakobovits 等，Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:2551-2555, 1993 ;Jakobovits 等， Nature 362:255-258. 1993 ;Lonberg 等，美國(guó)專利號(hào) 5, 545, 806 ;以及 Surani 等，美國(guó)專利 號(hào) 5, 545, 807)。
[0044] 正如在本領(lǐng)域中公知的，單克隆抗體是由抗體產(chǎn)生細(xì)胞的單一克隆產(chǎn)生的具有一 致的抗原特異性的均質(zhì)抗體，多克隆抗體一般識(shí)別同一抗原上的不同表位，并且由抗體產(chǎn) 生細(xì)胞的超過(guò)一個(gè)克隆產(chǎn)生。每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。修飾詞單克隆 指示抗體從基本上均質(zhì)的抗體群體獲得這一特點(diǎn)，并且不應(yīng)被解釋為要求通過(guò)任何特定方 法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，單克隆抗體可以通過(guò)由Kohler等(Nature256:495, 1975)首先描 述的雜交瘤方法或通過(guò)重組DNA方法（參見例如美國(guó)專利號(hào)4, 816, 567)來(lái)制造。單克 隆抗體也可以使用例如在Clackson等（Nature 352:624-628, 1991)和Marks等（上1\1〇1· Biol. ^:581-597, 1991)中描述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫(kù)分離。
[0045] 本文中的單克隆抗體可以包括嵌合抗體，即通常具有一部分重鏈和/或輕鏈與源 自于特定物種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞類的抗體中的相應(yīng)序列一致或同源，而鏈的剩余部 分與源自于另一物種或?qū)儆诹硪活愋突騺嗩惖目贵w中的相應(yīng)序列一致或同源的抗體，以 及這樣的抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出所需生物活性即可（美國(guó)專利號(hào)4, 816, 567 ;以及 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984)。感興趣的嵌合抗體包括靈 長(zhǎng)類化抗體，其包含源自于非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物（例如猿、舊大陸猴、新大陸猴、原猴類）的可變 結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人類恒定區(qū)序列。
[0046] 用于產(chǎn)生單克隆抗體（mAb)的各種方法在本領(lǐng)域中是公知的。參見例如在通過(guò) 參考并入本文的美國(guó)專利號(hào)4, 196, 265中描述的方法。最標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體產(chǎn)生技術(shù)一 般沿著與用于制備多克隆抗體的技術(shù)相同的路線開始（《抗體實(shí)驗(yàn)指南》（Antib 〇dies:A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1988))。通常，可以將適合的動(dòng)物用所選的免疫原免疫以刺激抗體產(chǎn)生細(xì)胞。嚙齒動(dòng)物 例如小鼠和大鼠是示例性動(dòng)物，盡管也可以使用兔、綿羊、娃和雞。小鼠可能是特別有用的 (例如BALB/c小鼠被慣常使用，并且一般給出較高的穩(wěn)定融合百分率）。
[0047] 在免疫后，可以選擇具有生產(chǎn)所需抗體的潛力的體細(xì)胞、特別是B淋巴細(xì)胞（B細(xì) 胞），以用于MAb產(chǎn)生和與永生的骨髓瘤細(xì)胞、一般為與被免疫動(dòng)物相同物種的永生骨髓 瘤細(xì)胞融合。適用于生產(chǎn)雜交瘤的融合程序的骨髓瘤細(xì)胞系通常是不產(chǎn)生抗體的，具有高 的融合效率，并且具有使它們不能在僅支持所需融合細(xì)胞（雜交瘤）生長(zhǎng)的某些選擇性培 養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酶缺陷?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種骨髓瘤細(xì)胞中的任一種。例 如，當(dāng)被免疫的動(dòng)物是小鼠時(shí)，人們可以使用P3_X63/Ag8、X63-Ag8. 653、NS 1/1. Ag 41、 Sp210-Agl4、F0、NS0/U、MPC-ll、MPCll-X45-GTG I. 7 和 S194/5XX0Bul ;對(duì)于大鼠來(lái)說(shuō)，人們 可以使用R210. RCY3、Y3-Ag 1. 2. 3、IR983F、4B210或上面列出的小鼠細(xì)胞系之一。U-266、 GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2和UC729-6,都可以在人類細(xì)胞融合的情形中使用。
[0048] 這種培養(yǎng)可以提供可以從中選擇特定雜交瘤的雜交瘤群體，然后進(jìn)行連續(xù)稀釋并 克隆在單個(gè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞系中，所述細(xì)胞系可以被無(wú)限繁殖用于生產(chǎn)抗體。
[0049] 生產(chǎn)單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以包括純化步驟。例如，抗體 一般可以通過(guò)例如過(guò)濾、離心和各種層析方法例如HPLC或親和層析進(jìn)一步純化，所有這些 都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)。這些純化技術(shù)各自包含分級(jí)，以將所需抗體與混合 物的其他組分分離開。特別適合于抗體制備的分析方法包括例如蛋白A-Sepharose和/或 蛋白G-Sepharose層析。
[0050] 本發(fā)明的抗sEcad抗體可能包括來(lái)自于人類或非人類來(lái)源的CDR。"人源化"抗體 通常是來(lái)自于小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔或其他物種的嵌合或突變的單克隆抗體，其帶有人類恒 定和/或可變區(qū)結(jié)構(gòu)域或特定變化。用于產(chǎn)生所謂的"人源化"抗體的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。
[0051] 免疫球蛋白的框架可以是人類、人源化或非人類（例如被修飾以降低在人類中的 抗原性的鼠類框架）或合成的框架（例如共有序列）。人源化免疫球蛋白是其中框架殘基 對(duì)應(yīng)于人類種系序列，并且CDR得自于V (D) J重組和體細(xì)胞突變的免疫球蛋白。然而人源 化免疫球蛋白也可能包含在人類種系免疫球蛋白核酸序列中未編碼的氨基酸殘基（例如 通過(guò)離體隨機(jī)或定點(diǎn)突變引入的突變）。已證實(shí)，人類可變基因的體內(nèi)體細(xì)胞突變引起框 架殘基的突變（參見Nature Immunol. 2:537, 2001)。盡管存在框架突變，但這樣的抗體根 據(jù)其來(lái)源將被稱為"人類的"。小鼠抗體可變結(jié)構(gòu)域也在框架殘基中含有體細(xì)胞突變（參見 Sem. Immunol. 159, 1996)。因此，含有人類Ig基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生通常被稱為"完全 人類的"免疫球蛋白，盡管它們具有平均4. 5個(gè)框架突變（Nature Genet.垃:146-56, 1997)。 因此，被接受的用法表明，基于種系序列但具有通過(guò)例如體內(nèi)體細(xì)胞突變過(guò)程而引入的框 架突變的抗體可變結(jié)構(gòu)域基因被稱為"人類的"。
[0052] 人源化抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的各種方法進(jìn)行工程化改造，例如：（1)將 非人類互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR)嫁接到人類框架和恒定區(qū)上（在本領(lǐng)域中被稱為人源化的 過(guò)程），或者可替選地（2)移植整個(gè)非人類可變結(jié)構(gòu)域，但是通過(guò)表面殘基的替換為它 們提供類似人類的表面（在本領(lǐng)域中被稱為表面鑲嵌的過(guò)程）。人源化抗體可以包括 人源化和表面鑲嵌的抗體兩者。同樣地，可以通過(guò)將人類免疫球蛋白基因座引入到內(nèi)源 免疫球蛋白基因已被部分或完全失活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如小鼠中，來(lái)制造人類抗體。在 激惹后，觀察到人類抗體生產(chǎn)，其在包括基因重排、組裝和抗體譜的所有方面非常類似 于在人類中觀察到的情況。這種方法被描述在例如美國(guó)專利號(hào)5, 545, 807、5, 545, 806、 5,569,825、5,625, 126、5,633,425、5,661，016 以及下面的科學(xué)出版物中：Marks 等，Bio/ Technology 10:779-783, 1992 ;Lonberg 等，Nature368:856-859, 1994 ；Morrison, Nature 368:812-13, 1994 ;FishwiId 等，Nature BiotechnoIogy 845-51, 1996 ； Neuberger, Nature Biotechnology!^: 826, 1996 ;Lonberg 和 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 1995 ; Jones 等，Nature 321: 522-525, 1986 ;Morrison 等，？1"〇?！?Natl. Acad. Sci, USA, §1:6851-6855, 1984 ;Morrison 和 0i，Adv. Immunol, M: 65-92, 1988 ; Verhoeyer 等，Science 239:1534-1536, 1988 ；Padlan, Molec. Tmmun. 28:489-498, 1991 ； Padlan, Molec. Immunol. 31 (3) : 169-217, 1994 ：以及 Kettleborough, C. A.等，Protein Eng. 4(7) :773-83, 1991 〇
[0053] 除了嵌合和人源化抗體之外，完全人類的抗體可以源自于具有人類免疫球蛋白的 轉(zhuǎn)基因小鼠（參見例如美國(guó)專利號(hào)6, 075, 181、6, 091，001和6, 114, 598)，或源自于人類免 疫球蛋白基因的噬菌體展示文庫(kù)（參見例如McCafferty等，Nature 348:552-554. 1990 ； Clackson 等，Nature352:624-628. 1991 ;以及 Marks 等，J. Mol. Biol. 222:581-597. 1991) 〇 在某些實(shí)施方式中，可以使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)scFv噬菌體展示文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生 和鑒定抗體。
[0054] 可以對(duì)抗sEcad抗體進(jìn)行修飾以調(diào)節(jié)它們的抗原結(jié)合親和性、它們的效應(yīng)功能或 它們的藥物動(dòng)力學(xué)。尤其是，可以在CDR中進(jìn)行隨機(jī)突變，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行篩選以鑒定具有更 高親和性和/或更高特異性的抗體。這樣的突變和選擇在抗體領(lǐng)域中是慣用操作。產(chǎn)生這 樣的代用變體的方便的方式是使用噬菌體展示的親和成熟。
[0055] ⑶R改組和植入技術(shù)可以與例如本文中提供的抗體一起使用。⑶R改組將⑶R序 列插入到特定框架區(qū)中（Jirholt等，Gene 215:471 (1988)) 〇⑶R植入技術(shù)允許⑶R序列 在單個(gè)主框架中隨機(jī)組合（Soderlind等，Immunotechnol. 4:219, 1999 ;以及 Soderlind等， Nature Biotechnol. 18:852, 2000)。使用這樣的技術(shù)，可以例如將抗sEcad抗體的Q)R序列 突變以產(chǎn)生大量不同序列，所述序列可以被并入到支架序列中，并篩選得到的抗體變體的 所需特征例如更高的親和性。在某些實(shí)施方式中，正如本領(lǐng)域中已知的，可以檢查抗sEcad 抗體的序列中T細(xì)胞表位的存在。然后可以改變隱含的序列以除去T細(xì)胞表位，即對(duì)抗體 進(jìn)行"去免疫化"。
[0056] 使用例如噬粒技術(shù)的重組技術(shù)允許從編碼各種抗體的重組基因制備具有所需 特異性的抗體。某些重組技術(shù)包括通過(guò)從分離自被免疫動(dòng)物的脾臟的RNA制備的組 合免疫球蛋白噬菌體表達(dá)文庫(kù)的免疫篩選，來(lái)分離抗體基因（Morrison等，Mt. Sinai J. Med. 53:175, 1986 ;Winter 和 Milstein, Nature 349:293, 1991 ;Barbas 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA型:4457, 1992)。對(duì)于這樣的方法來(lái)說(shuō)，組合免疫球蛋白噬粒文庫(kù)可以從分離 自被免疫動(dòng)物的脾臟的RNA來(lái)制備，并且可以使用表達(dá)抗原的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，通過(guò)淘選 來(lái)選擇表達(dá)適合的抗體的噬粒。這種方法與常規(guī)雜交瘤技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)包括可以在單輪中 產(chǎn)生并篩選多約IO 4倍的抗體，并且通過(guò)H和L鏈組合可以產(chǎn)生新的特異性，這可以進(jìn)一步 提高產(chǎn)生的適合抗體的百分率。
[0057] 用于在細(xì)菌中產(chǎn)生各種抗體分子的大型全譜的一種方法利用λ噬菌體作為載體 (Huse等，Science ^6:1275, 1989) 〇使用λ載體生產(chǎn)抗體包括將重鏈和輕鏈DNA序列群 體克隆到分開的起始載體中。隨后可以將載體隨機(jī)組合以形成指導(dǎo)重鏈和輕鏈共表達(dá)以 形成抗體片段的單一載體。用于絲狀噬菌體展示的通用技術(shù)描述在美國(guó)專利號(hào)5, 658, 727 中。在最廣泛的意義上，所述方法提供了使用單一載體系統(tǒng)從抗體基因全譜中同時(shí)克隆和 篩選預(yù)先選擇的配體結(jié)合特異性的系統(tǒng)。分離的文庫(kù)成員的預(yù)先選擇的配體結(jié)合能力的篩 選，允許將表達(dá)的抗體分子的結(jié)合能力與從文庫(kù)分離編碼成員的基因的常規(guī)手段相關(guān)聯(lián)。 還描述了用于篩選噬粒文庫(kù)的其他方法（美國(guó)專利號(hào)5, 580, 717、5, 427, 908、5, 403, 484和 5, 223, 409)。
[0058] 用于產(chǎn)生和篩選完全或部分合成的抗體結(jié)合位點(diǎn)或補(bǔ)位的大型文庫(kù)的一種方法， 利用了源自于絲狀噬菌體例如Μ13、fl或fd的展示載體（美國(guó)專利號(hào)5, 698, 426,通過(guò)參 考并入本文）。被稱為"噬粒"的絲狀噬菌體展示載體產(chǎn)生具有多樣化和新的免疫特異性的 單克隆抗體的大型文庫(kù)。所述技術(shù)使用絲狀噬菌體外殼蛋白膜錨定結(jié)構(gòu)域作為在絲狀噬菌 體復(fù)制的組裝階段中聯(lián)系基因產(chǎn)物和基因的手段，并且已被用于源自組合文庫(kù)的抗體的克 隆和表達(dá)（Kang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363, 1991 ;以及 Barbas 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA型:7978, 1991)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的親和分離程序，從表面表達(dá)文庫(kù)篩選結(jié)合神經(jīng) 氨酸酶分子的特定Fab片段。所選的Fab片段可以通過(guò)在噬菌體群體擴(kuò)增后對(duì)編碼所述多 肽的核酸進(jìn)行測(cè)序來(lái)表征。
[0059] 用于生產(chǎn)多樣化抗體文庫(kù)和篩選所需結(jié)合特異性的一種方法被描述在美國(guó)專利 號(hào)5, 667, 988和5, 759, 817中。所述方法包括使用簡(jiǎn)并的寡核苷酸和引物延伸反應(yīng)將簡(jiǎn)并 性并入到免疫球蛋白重鏈可變和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR區(qū)中，以噬粒文庫(kù)的形式制備異二 聚體免疫球蛋白分子的文庫(kù)，并將突變的多肽展示在噬粒表面上。隨后，篩選展示蛋白結(jié)合 預(yù)先選擇的抗原的能力。這種用于生產(chǎn)多樣化抗體文庫(kù)和篩選所需結(jié)合特異性的方法的另 一種變化形式描述在美國(guó)專利號(hào)5, 702, 892中，所述專利通過(guò)參考并入本文。在這種方法 中，僅使用重鏈序列，將重鏈序列在編碼CDRI或CDRIII高變區(qū)的所有核苷酸位置處隨機(jī) 化，并且⑶R中的遺傳變化可以獨(dú)立于任何生物過(guò)程產(chǎn)生。
[0060] 除了上面討論的組合免疫球蛋白噬菌體表達(dá)文庫(kù)之外，一種分子克隆方法是從含 有人類抗體文庫(kù)的轉(zhuǎn)基因小鼠制備抗體。這樣的技術(shù)已被描述（美國(guó)專利號(hào)5, 545, 807,通 過(guò)參考并入本文）。這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于生產(chǎn)單一同種型、更具體為B細(xì)胞成熟所必需 的同種型例如IgM以及可能的IgD的人類抗體。產(chǎn)生人類抗體的另一種方法描述在美國(guó)專 利號(hào) 5, 545, 806、5, 569, 825、5, 625, 126、5, 633, 425、5, 661，016 和 5, 770, 429 中，其中描述 了能夠從B細(xì)胞發(fā)育所需的同種型轉(zhuǎn)換到其他同種型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
[0061] 可以對(duì)抗sEcad免疫球蛋白進(jìn)行修飾，以減少或廢除糖基化。缺少糖基化的免疫 球蛋白可能是完全未糖基化、未完全糖基化或者非典型糖基化（即突變體的糖基化模式不 同于相應(yīng)的野生型免疫球蛋白的糖基化模式）的免疫球蛋白。IgG多肽包括一個(gè)或多個(gè)（例 如1、2、3個(gè)或更多個(gè)）弱化糖基化的突變，即導(dǎo)致IgG CH2結(jié)構(gòu)域缺少糖基化或未被完全 糖基化或被非典型糖基化的突變。人類IgGl中297位氨基酸處天冬酰胺殘基的突變，是這 樣的突變的一個(gè)實(shí)例。通過(guò)例如從N-連接的聚糖上消除巖藻糖組成部分，也可以對(duì)寡糖結(jié) 構(gòu)進(jìn)行修飾。
[0062] 也可以通過(guò)偶聯(lián)到非蛋白聚合物例如聚乙二醇對(duì)抗體進(jìn)行修飾，以提高它們的體 內(nèi)穩(wěn)定性或溶解性?？梢允褂萌魏蜳EG化方法，只要抗sEcad抗體保留選擇性結(jié)合sEcad 的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域的能力即可。
[0063] 可以使用廣泛的各種抗體/免疫球蛋白框架或支架，只要得到的多肽包括特異性 針對(duì)靶、即sEcad的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)結(jié)合區(qū)即可。這樣的框架 或支架包括人類免疫球蛋白的5種主要獨(dú)特型或其片段（例如在本文別處公開的），并包括 其他動(dòng)物物種的免疫球蛋白，優(yōu)選地具有人源化特性。就此而言，單重鏈抗體例如在駱駝中 所鑒定到的，是特別重要的。
[0064] 使用其上可以嫁接sEcad抗體的⑶R的非免疫球蛋白支架，人們可以產(chǎn)生基 于非免疫球蛋白的抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何非免疫球蛋白框架和支 架，只要所述框架或支架包括特異性針對(duì)靶的結(jié)合區(qū)即可。免疫球蛋白樣的分子包括 與免疫球蛋白共有某些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)例如β-片層二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。非免疫球蛋白框 架或支架的實(shí)例包括但不限于adnectin(纖連蛋白）、銷蛋白、結(jié)構(gòu)域抗體和Ablynx nv、脂媽蛋白、小型模塊式免疫藥物（Trubion Pharmaceuticals Inc. ,Seattle, WA)、 maxybodies (Avidia, Inc.，Mountain View, CA)、蛋白 A 和 affil in (γ -晶狀體蛋白或遍在 蛋白）（Scil Proteins GmbH, Halle, Germany) 〇
[0065] 本發(fā)明的抗sEcad抗體特異性結(jié)合E-鈣粘蛋白或sEcad的第二、第三、第四或第 五亞結(jié)構(gòu)域上的表位（但是不結(jié)合ECl的表位）。表位是指靶上被補(bǔ)位、即抗體的結(jié)合位點(diǎn) 特異性結(jié)合的抗原決定簇。表位決定簇通常由分子例如氨基酸或糖側(cè)鏈的具有化學(xué)活性的 表面聚集構(gòu)成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。表位一般具有約 4至約10個(gè)毗鄰的氨基酸（連續(xù)表位），或者可以是限定了特定結(jié)構(gòu)的一組非毗鄰氨基酸 (例如構(gòu)象表位）。因此，表位可以由至少4、至少6、至少8、至少10或至少12個(gè)這樣的氨 基酸構(gòu)成。確定氨基酸的空間構(gòu)象的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并包括例如X-射線晶體學(xué) 和2維核磁共振。
[0066] 預(yù)測(cè)抗體可以結(jié)合的其他潛在表位的方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)是公知的，并包括但不限于Kyte-Doolittle分析（Kyte和Dolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982)、Hodd 和 Woods 分析（Hopp 和￥〇〇(18，？1'〇。.似1:1.八。&(1.3。;[· USA 迅：3824-3828, 1981 ;Hopp 和 Woods, Mol. Immunol.避：483-489, 1983 ;Hopp，J. Immunol. Methods 88:1-18, 1986)、Jameson-Wolf 分析（Jameson 和 Wolf Comput. Appl. Biosci. 4:181-186, 1988)以及 Emini 分析（Emini 等，Virology 1巡：13-20, 1985)。在某 些實(shí)施方式中，通過(guò)確定理論的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域來(lái)鑒定潛在表位?？梢允褂梅治鏊惴ɡ?TMpred(參見 Hofmann 和 Stoffel. Biol. Chem. 374:166. 1993)或 TMHMM(Krogh 等，丄]?〇1· Biol. 305(3) :567-580. 2001)來(lái)進(jìn)行這樣的預(yù)測(cè)。其他算法例如 SignalP 3. 0 (Bednsten 等，J. Mol. Biol. (4) : 783-795, 2004)，可用于預(yù)測(cè)信號(hào)肽的存在并預(yù)測(cè)那些肽從全長(zhǎng)蛋 白上切割的位置。蛋白質(zhì)在細(xì)胞外部上的部分可以起到用于抗體相互作用的靶的作用。
[0067] 本發(fā)明的組合物包含的抗體（1)表現(xiàn)出閾值水平的結(jié)合活性；和/或（2)不與已 知的相關(guān)多肽分子發(fā)生顯著的交叉反應(yīng)。抗體的結(jié)合親和性可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通 過(guò)例如 Scatchard 分析（Scatchard, Ann. NY Acad, Sci. 51:660-672, 1949)容易地確定。
[0068] 在某些實(shí)施方式中，對(duì)于靶即sEcad的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域來(lái)說(shuō)，與 被預(yù)測(cè)與E-鈣粘蛋白或sEcad的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域具有一定同源性的其他 蛋白相比，抗sEcad抗體可以至少1. 5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、IO3倍、10 4倍、10 5倍、10 6 倍或更多地結(jié)合于它們的靶表位或模擬誘餌。
[0069] 在某些實(shí)施方式中，抗sEcad抗體以KT4M或更小、KT7M或更小、KT 9M或更小的 高親和性或以小于納摩爾的親和性（〇. 9、0. 8、0. 7、0. 6、0. 5、0. 4、0. 3、0. 2、0. InM或甚至更 ?。┙Y(jié)合。在某些實(shí)施方式中，抗體對(duì)sEcad的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和 性為至少lx l〇6Ka。在某些實(shí)施方式中，抗體對(duì)sEcad的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域的 結(jié)合親和性為至少5xl0 6Ka、至少lxl07Ka、至少2xl07Ka、至少IxlO8Ka或更高?？贵w也可以 根據(jù)它們對(duì)sEcad的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和性來(lái)描述或指定。在某些 實(shí)施方式中，結(jié)合親和性包括具有小于 5x10_2M、10_2M、5x10_3M、10_3M、5x10_ 3M、10_4M、5x10_5M、 IO^5M,5xlO_6Ma〇_6M>5xlO_7MUO _7M,5xlO_8MUO_8M>5xlO_9M,5xlO _10MUO_10M>5xlO_11Ma〇_11M, 5xl0_ 12M、10_12M、5xl0_13M、10_13M、5xl0_ 14M、10_14M、5xl0_15M 或 KT15M 或更小的 Kd 的結(jié)合親和 性·
[0070] 在某些實(shí)施方式中，抗體不結(jié)合已知的相關(guān)多肽分子；例如，它們結(jié)合sEcad多 肽的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域，但是不結(jié)合已知的相關(guān)多肽。可以針對(duì)已知相 關(guān)多肽對(duì)抗體進(jìn)行篩選，以分離特異性結(jié)合sEcad多肽的第二、第三、第四或第五亞結(jié) 構(gòu)域的抗體群體。例如，在適合的緩沖劑條件下，特異性針對(duì)sEcad多肽的第二、第三、 第四或第五亞結(jié)構(gòu)域的抗體，可以通過(guò)包含附著于不溶性基質(zhì)的sEcad多肽相關(guān)蛋白 的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu)域（排除sEcad多肽的第二、第三、第四或第五亞結(jié)構(gòu) 域）的柱子流出。這樣的篩選允許分離與近緣多肽沒(méi)有交叉反應(yīng)性的多克隆和單克隆抗 體（《抗體實(shí)驗(yàn)指南》（Antibodies:A Laboratory Manual)，Harlow 和 Lane 主編，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988;《免疫學(xué)現(xiàn)代方法》（Current so Protocols in Immunology), Cooligan 等 主編，National Institutes of Health, John Wiley and Sons，Inc.，1995)。特定抗體的篩選和分離在本領(lǐng)域中是公知的（參見《基礎(chǔ)免疫 學(xué)》（Fundamental Immunology)，Paul 主編，Raven Press, 1993 ;Getzoff 等，Adv. in Immunol. 43:1-98, 1988 ;《單克隆抗體：原理和實(shí)踐》(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Coding, J. ff.主編，Academic Press Ltd.，1996 ;Benjamin 等，Ann. Rev. Immunol.么67-101，1984)。這樣的測(cè)定法的代表性實(shí)例包括并行免疫電泳，放射免疫測(cè)定 法（RIA)，放射免疫沉淀，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA)，斑點(diǎn)印跡或蛋白質(zhì)印跡測(cè)定法，抑 制或競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法和夾心測(cè)定法。
[0071] 特定抗體選擇性殺死表達(dá)E-鈣粘蛋白的惡性細(xì)胞的能力，可以使用例如在本文 的實(shí)施例中公開的方法來(lái)評(píng)估。
[0072] 抗sEcad抗體可以包括標(biāo)簽，其也可以被稱為報(bào)告物或標(biāo)志物（例如可檢測(cè)標(biāo)志 物）?？蓹z測(cè)標(biāo)志物可以是共價(jià)連接到抗sEcad抗體或其生物活性片段，允許定性和/或 定量評(píng)估帶標(biāo)簽的肽的表達(dá)或活性的任何分子?；钚钥梢园ㄉ锘钚?、物理化學(xué)活性或 其組合?？蓹z測(cè)標(biāo)志物的形式和位置兩者可以變化，只要被標(biāo)記的抗體保留生物活性即可。 可以使用許多不同標(biāo)志物，并且具體標(biāo)志物的選擇取決于所需應(yīng)用。標(biāo)記的抗sEcad抗體 可用于例如評(píng)估生物樣品例如尿液、唾液、腦脊液、血液或活檢樣品中sEcad的水平，或用 于評(píng)估對(duì)sEcad肽治療劑的臨床響應(yīng)。適合的標(biāo)志物包括例如酶、光親和性配體、放射性同 位素和熒光或化學(xué)發(fā)光化合物。將可檢測(cè)標(biāo)志物導(dǎo)入肽中的方法在本領(lǐng)域中是公知的。標(biāo) 志物可以在合成期間或合成后添加。重組抗sEcad抗體或其生物活性變體也可以通過(guò)向轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基添加標(biāo)記的前體（例如放射性標(biāo)記的氨基酸）來(lái)標(biāo)記。在某 些實(shí)施方式中，可以使用肽的類似物或變體，以便于可檢測(cè)標(biāo)志物的摻入。例如，可以將任 何N-端苯丙氨酸殘基用可以容易地用 125I標(biāo)記的近緣芳香族氨基酸例如酪氨酸替換。在 某些實(shí)施方式中，可以向抗sEcad抗體或其生物活性變體的片段添加支持有效標(biāo)記的附加 官能團(tuán)。例如，可以向本源結(jié)構(gòu)的N-端添加3-三丁基錫苯甲?；?；隨后用 125I置換三丁基 錫基團(tuán)將產(chǎn)生放射性標(biāo)記的碘代苯甲?；?。
[0073] 替代給藥抗體或抗體樣治療劑本身，本發(fā)明的方法也可以通過(guò)給藥在體內(nèi)引發(fā)抗 sEcad抗體的生產(chǎn)的蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行。因此，本發(fā)明的組合物包括E-鈣粘蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域的EC2-EC5亞結(jié)構(gòu)域中的抗原性片段（參見圖IA和圖1B)?？梢詫⑦@些多肽融合到異源 多肽以產(chǎn)生免疫原性融合蛋白。例如，可以如美國(guó)專利號(hào)7, 262, 270中所述，將sEcad多肽 融合到流感病毒HA2血細(xì)胞凝集素蛋白的片段。
[0074] 本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括可用于抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)的核酸（例如反義寡核苷 酸或介導(dǎo)RNA干擾的寡核苷酸）。核酸構(gòu)建物也可用于在體內(nèi)或離體（例如在細(xì)胞或組織 培養(yǎng)物中）表達(dá)sEcad的抗原性片段。
[0075] 術(shù)語(yǔ)"核酸"和"多核苷酸"在本文中可互換使用以指稱在本發(fā)明方法的情形中有 用的藥劑，并且這些術(shù)語(yǔ)是指RNA和DNA兩者，包括cDNA、基因組DNA、合成的DNA以及含有 核酸類似物的DNA(或RNA)。多核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)。核酸可以是雙鏈或單鏈的 (即正義鏈或反義鏈）。多核苷酸的非限制性實(shí)例包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信 使RNA(mRNA)及其部分、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、siRNA、micro-RNA、核酶、cDNA、重組多核苷 酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和 引物以及核酸類似物。在本發(fā)明的情形中，核酸可以編碼例如抗體、突變的抗體或其片段或 sEcad或其片段。
[0076] "分離的"核酸可以是例如天然存在的DNA分子或其片段，只要在天然存在的基因 組中正常情況下緊靠所述DNA分子側(cè)翼存在的至少一個(gè)核酸序列被移除或不存在即可。因 此，分離的核酸包括但不限于獨(dú)立于其他序列作為分離的分子存在的DNA分子（例如化學(xué) 合成的核酸，或通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片 段）。分離的核酸也指并入到載體、自主復(fù)制質(zhì)粒、病毒中或原核或真核生物的基因組DNA 中的DNA分子。此外，分離的核酸可以包括工程化改造的核酸，例如作為雜合體或融合核酸 的一部分的DNA分子。存在于例如cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)或含有基因組DNA限制性消化 物的凝膠切片內(nèi)的許多（例如數(shù)十或數(shù)百至數(shù)百萬(wàn)）其他核酸中的核酸，不是分離的核酸。
[0077] 分離的核酸分子可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)。例如，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR) 技術(shù)來(lái)獲得含有本文中描述的核苷酸序列、包括編碼本文中描述的多肽（即工程化蛋白） 的核苷酸序列的分離的核酸。PCR可用于從DNA以及RNA擴(kuò)增特定序列，包括來(lái)自于總基因 組DNA或總細(xì)胞RNA的序列。各種PCR方法描述在例如《PCR引物實(shí)驗(yàn)指南》(PCR Primer: A Laboratory Manual)，DiefTenbach 和 Dveksler 主編，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995中。一般來(lái)說(shuō)，來(lái)自于目標(biāo)區(qū)域末端或之外的序列信息，被用于設(shè)計(jì)在序列上與 待擴(kuò)增模板的相反鏈一致或相似的寡核苷酸引物。各種PCR策略也是可用的，由此可以將 位點(diǎn)特異性核苷酸序列修飾引入到模板核酸中（正如人們可能希望做的，例如當(dāng)制造工程 化蛋白例如抗體、突變的抗體或其片段或融合蛋白或其片段時(shí)）。分離的核酸也可以被化 學(xué)合成，作為單一核酸分子（例如使用自動(dòng)化DNA合成，使用亞磷酰胺技術(shù)在3'至5'方向 上）或作為一系列寡核苷酸。例如，可以合成含有所需序列的一對(duì)或更多對(duì)長(zhǎng)的寡核苷酸 (例如>50-100個(gè)核苷酸），其中每對(duì)含有短的互補(bǔ)區(qū)段（例如約15個(gè)核苷酸），使得當(dāng)所 述寡核苷酸對(duì)被退火時(shí)形成雙鏈體。使用DNA聚合酶延伸寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸對(duì)產(chǎn)生 單個(gè)雙鏈核酸分子，然后可以將其連接到載體中。本發(fā)明的分離的核酸也可以通過(guò)例如工 程化的編碼蛋白的DNA的天然存在的部分的突變來(lái)獲得。
[0078] 本文中描述的核酸和多肽（例如sEcad的抗原性片段）可以被稱為"外源的"。術(shù) 語(yǔ)"外源的"是指所述核酸或多肽是重組核酸構(gòu)建物的一部分或由重組核酸構(gòu)建物編碼，或 者不處于其天然環(huán)境中。例如，外源核酸可以是來(lái)自于一個(gè)物種并被導(dǎo)入到另一個(gè)物種中 的序列，即異源核酸。通常，這樣的外源核酸通過(guò)重組核酸構(gòu)建物被導(dǎo)入到另一個(gè)物種中。 外源核酸也可以是對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)是本源的并且已被重新導(dǎo)入到所述生物體的細(xì)胞中的 序列。包括本源序列的外源核酸，通?？梢酝ㄟ^(guò)與所述外源核酸相連的非天然序列、例如 在重組核酸構(gòu)建物中在本源序列側(cè)翼的非本源的調(diào)控序列的存在，與天然存在的序列區(qū)分 開。此外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的外源核酸通常被整合在存在本源序列的位置之外的位置處。
[0079] 在本文中還提供了重組構(gòu)建物，并且可以將其用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞以便表達(dá)多肽例如抗 體、突變的抗體或其片段或sEcad或其片段。重組核酸構(gòu)建物包含編碼例如本文中描述的 抗體、突變的抗體或其片段或sEcad或其片段的核酸，所述核酸可操作連接到適合于表達(dá) 工程化蛋白例如抗體、突變的抗體或其片段或sEcad或其片段的調(diào)控區(qū)。在某些情況下， 重組核酸構(gòu)建物可以包括在反義方向上包含編碼序列、基因或編碼序列或基因的片段的核 酸，以便轉(zhuǎn)錄RNA的反義鏈。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，許多核酸可以編碼具有特定氨基酸序列的多肽。 遺傳密碼的簡(jiǎn)并性在本領(lǐng)域中是公知的。對(duì)于許多氨基酸來(lái)說(shuō)，存在超過(guò)一個(gè)核苷酸三聯(lián) 體起到所述氨基酸的密碼子的作用。例如，對(duì)于抗體、突變的抗體或其片段或融合蛋白或其 片段的給定片段來(lái)說(shuō)，可以使用特定生物體的適合的密碼子偏好表對(duì)編碼序列中的密碼子 進(jìn)行修改，以便獲得在所述生物體中的最適表達(dá)。
[0080] 還提供了含有核酸例如本文中描述的核酸的載體。"載體"是可以在其中插入另一 個(gè)DNA區(qū)段以便引起被插入?yún)^(qū)段的復(fù)制的復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒。表達(dá)載體包括 質(zhì)粒載體、病毒載體和HSV擴(kuò)增子粒子，正如在美國(guó)申請(qǐng)
【發(fā)明者】薩比恩·布洛克松, 斯特法諾斯·吉爾卡尼德斯 申請(qǐng)人:紐約州立大學(xué)研究基金會(huì)