專利名稱：：肝細(xì)胞癌細(xì)胞特異性的肽及其應(yīng)用的制作方法肝細(xì)胞癌細(xì)胞特異性的肽及其應(yīng)用優(yōu)先權(quán)聲明本申請(qǐng)要求2007年11月20日提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/996，488的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)述及將其完整收錄。
背景技術(shù)：
：在全世界范圍，肝細(xì)胞癌(HCC)是第十位最致命的癌癥相關(guān)殺手。即便是隨著外科手術(shù)、放射和化學(xué)療法的進(jìn)步和聯(lián)合，HCC的預(yù)后依然不佳(1)。盡管進(jìn)行了攻擊性的常規(guī)治療，在美國(guó)肝癌患者的5年存活率依然只有8.9%，這使得此惡性腫瘤成為位于胰腺導(dǎo)管腺癌(5年時(shí)存活4.4%)之后的第二位最致命的癌癥(2)。2005年，全世界有超過(guò)667，000例新增肝癌病例，其中80%在亞洲和撒哈拉沙漠以南非洲(3)。隨著分子腫瘤學(xué)領(lǐng)域的極大進(jìn)步，新的治療策略正在不斷被研發(fā)以試圖治愈此疾病。開(kāi)發(fā)腫瘤細(xì)胞和非惡性腫瘤對(duì)應(yīng)物的區(qū)分得到改進(jìn)的針對(duì)癌癥的靶向治療法是當(dāng)前抗癌研究的主要目標(biāo)之一。大多數(shù)化療劑并不優(yōu)先積聚于腫瘤部位。實(shí)際上，到達(dá)腫瘤的劑量可能少到僅有積聚于正常器官劑量的5%-10%(4)。毒性副作用經(jīng)常限制了抗癌藥物的劑量擴(kuò)大，導(dǎo)致不完全的腫瘤響應(yīng)、早期的疾病復(fù)發(fā)及最終形成耐藥性。開(kāi)發(fā)了多種方法來(lái)改善抗癌藥物的選擇性毒性，諸如將抗癌藥物封裝于遞送系統(tǒng)中(5)及通過(guò)與過(guò)表達(dá)的或獨(dú)特表達(dá)于癌細(xì)胞上的抗原或受體結(jié)合的單克隆抗體(6，7)或肽配體(8，9)使抗癌藥物瞄準(zhǔn)目標(biāo)。已經(jīng)調(diào)查了藥物遞送系統(tǒng)(DDS)，諸如基于脂類或聚合物的抗癌納米醫(yī)學(xué)(10)。DDS通常指直徑200nm或更小的納米顆粒和微米顆粒，包括脂質(zhì)體和其它基于脂質(zhì)的載體，諸如微團(tuán)、脂質(zhì)乳劑和脂質(zhì)-藥物復(fù)合物；還包括聚合物-藥物偶聯(lián)物及各種配體靶向產(chǎn)品諸如免疫偶聯(lián)物(11)。腫瘤脈管系統(tǒng)的超通透性是決定基于聚合物的癌癥治療法成功靶向腫瘤的關(guān)鍵因素之一(12)。在靜脈內(nèi)施藥后，血管發(fā)生中的腫瘤脈管系統(tǒng)的“易漏”，據(jù)估計(jì)平均孔徑為100-600nm(13)，允許腫瘤組織中的偶聯(lián)物選擇性外滲。此外，腫瘤組織常常缺乏有效的淋巴排除，這隨后促進(jìn)聚合物滯留。這些因素聯(lián)合起來(lái)導(dǎo)致偶聯(lián)物在腫瘤組織中積聚-一種被動(dòng)靶向現(xiàn)象，被Maeda命名為“增強(qiáng)的通透性和滯留(EPR)效應(yīng)”(14)。經(jīng)由脂質(zhì)體進(jìn)行的由Era介導(dǎo)的被動(dòng)腫瘤靶向可導(dǎo)致在實(shí)體瘤中的藥物濃度相對(duì)于游離藥物獲得的濃度而言升高數(shù)倍(15)。DDS的特殊力量在于它們改變其相關(guān)治療法的藥動(dòng)學(xué)和生物分配的潛力(5)。將聚乙二醇(PEG)或其它惰性聚合物與各種治療性分子偶聯(lián)可能減少腎臟和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)對(duì)藥物的清除(16)。對(duì)于較大的微粒載體諸如脂質(zhì)體和聚合物-藥物偶聯(lián)物而言，載體的大小(通常為直徑50-200nm)使其主要局限于血液隔室，對(duì)正常器官的有害作用較小?，F(xiàn)在批準(zhǔn)用于胃腸外施用的DDS大多包括脂質(zhì)體或基于脂質(zhì)的配制劑及與PEG連接的治療性分子，例如PEG化的脂質(zhì)體多柔比星，其用于治療高度血管發(fā)生性腫瘤諸如AIDS相關(guān)卡波西氏肉瘤，總響應(yīng)率為43%和59%(17，18)。然而，微粒DDS引起藥物在肝臟、脾臟和骨髓的單個(gè)核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞中積聚增加，而且存在對(duì)這些組織毒性增加的可能性(19)。此外，隨著循環(huán)時(shí)間的延長(zhǎng)和微粒DDS的限制，血液學(xué)毒性諸如嗜中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥和白細(xì)胞減少癥也變得明顯了(20)。正努力通過(guò)將其與靶向腫瘤細(xì)胞和腫瘤脈管系統(tǒng)表面抗原或受體的配體聯(lián)合來(lái)增強(qiáng)DDS的位點(diǎn)特異性作用，這一過(guò)程稱為主動(dòng)的或配體介導(dǎo)的靶向作用(8，21)。此外，正在調(diào)查將化療藥物經(jīng)由親和靶向作用遞送至腫瘤組織(22，23)。盡管單克隆抗體已顯示出作為腫瘤靶向劑的臨床潛力，但抗體由于其大小而造成的腫瘤滲透差及由于非特異性抗體攝取而引起的肝臟/骨髓毒性是抗體療法的兩項(xiàng)主要限制。肽靶向劑可能使與抗體癌癥療法相關(guān)的問(wèn)題減輕(24)。將組合文庫(kù)展示于微生物上是鑒定腫瘤特異性靶向配體的一種可能策略。噬菌體展示技術(shù)已應(yīng)用于鑒定B細(xì)胞表位(25-27)、發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞(8，28，29)和腫瘤脈管系統(tǒng)特異性肽(30-33)。將DDS與腫瘤特異性肽聯(lián)合可能導(dǎo)致多達(dá)數(shù)千種抗癌藥物分子僅僅經(jīng)由少許靶向配體分子就被遞送至腫瘤細(xì)胞處?？拱┧幬锓肿釉谀[瘤部位的持續(xù)釋放可能也具有治療優(yōu)勢(shì)(8，34)。發(fā)明概述本公開(kāi)包括單獨(dú)的或組合的以下內(nèi)容等本公開(kāi)提供了一種多核苷酸或其變體，其中所說(shuō)的多核苷酸編碼特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的肽，并且所說(shuō)的多核苷酸包含選自SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDN0:21、SEQIDNO23,SEQIDNO25禾口SEQIDNO:29的序列。本公開(kāi)提供了一種多肽或其變體，其中所說(shuō)的多肽特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞，并且所說(shuō)的多肽包含選自SEQIDNO:2，SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO28和SEQIDNO30的序列。在某一實(shí)施方案中，所述多肽包含SP94(SEQIDNO2)或其變體。在另一實(shí)施方案中，所述多肽包含SP94(SEQIDNO:2)。在又一實(shí)施方案中，所述多肽包含相連的氨基酸PILP。本公開(kāi)提供了包含相融合的第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中所述的第一多肽包含特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽。在某一實(shí)施方案中，所述的第二多肽包含一個(gè)或多個(gè)特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽(例如所述多肽是同二聚體、異二聚體或其它多聚體)。在另一實(shí)施方案中，所述的第二多肽包含谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)結(jié)構(gòu)域。在又一實(shí)施方案中，所述的第二多肽包含GFP。在另一實(shí)施方案中，所述的第二多肽包含免疫學(xué)標(biāo)簽。在又一實(shí)施方案中，所述的第二多肽包含抗體結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，所述的抗體結(jié)構(gòu)域是抗體的Fc區(qū)。本公開(kāi)提供了多肽或其變體，其中所說(shuō)的多肽特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞，并且其中所述多肽或其變體與一種或更多種藥物偶聯(lián)。在某一實(shí)施方案中，所述藥物選自多柔比星(doxorubicin)、長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、帕利他塞(paclitaxel)、勒托替康(lurotecan)、寡核苷酸、毒素、抗VEGF適體及放射性分子。本公開(kāi)提供了與特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞之多肽或其變體結(jié)合的抗體。本公開(kāi)提供了包含特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞之多肽或其變體的脂質(zhì)體。在某一實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含SP94(SEQEDNO2)或其變體。在另一實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含SP94(SEQIDNO:2)。在又一實(shí)施方案中，本公開(kāi)中的脂質(zhì)體進(jìn)一步包含至少一種選自多柔比星、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、帕利他塞、勒托替康、寡核苷酸、毒素、抗VEGF適體及放射性分子的藥物。在另一實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含多柔比星。本公開(kāi)提供了用于治療哺乳動(dòng)物中的疾病的方法，包括對(duì)需要治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽或其變體，其中所述多肽或其變體與一種或多種選自多柔比星、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、帕利他塞、勒托替康、寡核苷酸、毒素、抗VEGF適體及放射性分子的藥物偶聯(lián)。在某一實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。本公開(kāi)提供了用于治療哺乳動(dòng)物中的疾病的方法，包括對(duì)需要治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的包含一種或多種藥物和特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽或其變體的脂質(zhì)體。在某一實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含的多肽包含SEQIDNO:2或其變體。在另一實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含的多肽包含SEQIDNO:2。在又一實(shí)施方案中，所述的脂質(zhì)體包含一種或多種藥物，包括多柔比星、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、帕利他塞、勒托替康、寡核苷酸、毒素、抗VEGF適體及放射性分子。在某一實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包含多柔比星。在另一實(shí)施方案中，所述的脂質(zhì)體包含SEQIDNO:2或其變體及多柔比星。在另一實(shí)施方案中，所述的脂質(zhì)體包含SEQIDNO:2和多柔比星。在另一實(shí)施方案中，所述疾病是癌癥。在又一實(shí)施方案中，所述癌癥是肝癌。在另一實(shí)施方案中，所述肝癌是肝細(xì)胞癌。在另一實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人類。本公開(kāi)提供了用于在標(biāo)本中檢測(cè)肝癌的方法，包括a)在允許下述多肽與肝癌細(xì)胞結(jié)合的條件下使標(biāo)本接觸特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽或其變體；并b)用結(jié)合所述多肽的抗體檢測(cè)該多肽的結(jié)合。在某一實(shí)施方案中，所述多肽或其變體構(gòu)成融合多肽，該融合蛋白包含特異于肝細(xì)胞癌之多肽和包含表位的另一序列?？衫媒Y(jié)合所述表位的抗體來(lái)檢測(cè)所述融合多肽對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的結(jié)合。本公開(kāi)提供了鑒定與特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞之多肽或其變體結(jié)合的細(xì)胞分子的方法，包括a)在允許包含所述多肽或其變體和所述分子的復(fù)合物形成的條件下使細(xì)胞提取物接觸所述多肽或其變體；并b)分析所述復(fù)合物以鑒定所述細(xì)胞分子。在某一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞分子駐留在肝細(xì)胞癌細(xì)胞表面上并結(jié)合所述多肽或其變體。本公開(kāi)提供了本公開(kāi)之多核苷酸的變體，其中所述的變體多核苷酸與選自以下的多核苷酸的互補(bǔ)物雜交SEQIDNO1,SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQΕ)NO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDN0:21、SEQIDNO:23、SEQIDN0:25和SEQIDNO:29。在某一實(shí)施方案中，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。本公開(kāi)提供了本公開(kāi)之多肽的變體，其中所述的變體多肽由與選自以下的多核苷酸的互補(bǔ)物雜交的多核苷酸編碼:SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO7,SEQIDN0:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDNO15、SEQIDNO17,SEQIDN0:19,SEQIDN0:21、SEQIDNO23,SEQIDNO25禾口SEQIDNO:29。在某一實(shí)施方案中，所述多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)受試者中的癌癥的方法，包括對(duì)受試者施用本公開(kāi)的多肽，其中所說(shuō)的多肽包含標(biāo)記物，并檢測(cè)所述多肽對(duì)受試者中癌癥的結(jié)合。在某一實(shí)施方案中，所述的標(biāo)記物包含放射性分子。在另一實(shí)施方案中，所述癌癥是肝癌。在另一實(shí)施方案6中，所述肝癌是肝細(xì)胞癌。在另一實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。在又一實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人類。附圖和附表簡(jiǎn)述本專利或申請(qǐng)文件包含至少一幅制成彩色的圖。帶彩圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開(kāi)文本的副本在提出請(qǐng)求并支付必要費(fèi)用后由專利局提供。圖1。利用體外噬菌體展示分離HCC細(xì)胞特異性噬菌體。圖2A-D。PC94對(duì)HCC細(xì)胞系和人HCC活組織檢查標(biāo)本的結(jié)合活性。圖3A-C。在體內(nèi)PC94的腫瘤歸巢活性的證實(shí)。圖4A-D。在HCC異種移植物模型中靶向肽SP94的偶聯(lián)提高了治療效力并降低了脂質(zhì)體多柔比星的血液學(xué)毒性。圖5A-D。SP94-Lipo-DoX處理的HCC異種移植物的組織病理學(xué)檢查。圖6A-E。用SP94-Lipo_Dox處理攜帶較大HCC異種移植物的SCID小鼠。圖7。經(jīng)由FACS對(duì)選定的噬菌體克隆的結(jié)合活性的劑量依賴性分析。圖8。PC88和94在體內(nèi)的腫瘤歸巢活性的證實(shí)。表1提供了來(lái)自選自Mahlavu細(xì)胞的噬菌體的噬菌體展示多肽序列。表2提供了編碼本公開(kāi)之多肽的多核苷酸序列。發(fā)明詳述在世界范圍，HCC是第五位最常見(jiàn)的癌癥并且排名第四位癌癥死亡原因(1)。唯一有療效的治療方法是外科切除術(shù)或肝臟移植，而且只有少數(shù)患者符合這些規(guī)程的條件(36)。大多數(shù)處于晚期的HCC不再能進(jìn)行有療效的治療。針對(duì)晚期HCC的全身性化學(xué)療法，或是作為單藥療法或是組合的，在過(guò)去30年里都已經(jīng)廣泛研究并且被普遍認(rèn)為是無(wú)效的(36)。提高全身性治療的效力并挑選那些會(huì)從中受益的患者仍然是一項(xiàng)主要的挑戰(zhàn)。我們報(bào)道了經(jīng)由噬菌體展示篩選鑒定的新型靶向肽、特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽、及利用所述肽開(kāi)發(fā)針對(duì)HCC的靶向藥物遞送。首先，我們使用噬菌體展示肽庫(kù)來(lái)鑒別新的肽，它們?cè)隗w外和體內(nèi)都能特異性地結(jié)合HCC細(xì)胞。SP94就是這樣一種肽。此外，編碼SP94的噬菌體PC94識(shí)別來(lái)自HCC患者的外科手術(shù)標(biāo)本中的腫瘤組織表面但不識(shí)別正常的對(duì)應(yīng)物。將靶向肽SP94與含有多柔比星的脂質(zhì)體偶聯(lián)提高了在HCC異種移植物模型中的治療效力。SP94肽由此能改善晚期HCC的系統(tǒng)性治療。I.定義如下文所列，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)具有它們的常規(guī)含意，并且還可根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的上下文做進(jìn)一步的理解。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本文中可互換使用來(lái)意指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式。多核苷酸可包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它們的類似物或衍生物。本文所示的核苷酸序列按5'至3'的方向列出。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，意指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合形式。術(shù)語(yǔ)“變體”包括本公開(kāi)中多核苷酸或多肽序列中的插入、添加、刪除或替代，其中所說(shuō)的變體是對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞特異性的。短語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上相同”、“實(shí)質(zhì)上相似”意味著所述的相關(guān)氨基酸或核苷酸序列相較于所公開(kāi)的序列而言相同或者具有非實(shí)質(zhì)性的差異(通過(guò)保守的氨基酸替代)。對(duì)于多肽而言，在最初的多肽和與該最初形式實(shí)質(zhì)上相同的變體多肽之間至少10、20、30、50、100或更多個(gè)氨基酸將被加以比較。對(duì)于核酸而言，在最初的核酸和與該最初形式實(shí)質(zhì)上相同的變體核酸之間至少30、40、50、100、150、300或更多個(gè)核苷酸將被加以比較。因此，某一變體可在某一區(qū)域或幾個(gè)區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上相同，但在其它區(qū)域有所不同，而仍然符合“實(shí)質(zhì)上相同”的定義。兩條序列之間的百分比同一性是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的比對(duì)算法確定的，諸如例如Altschul等，J.Mol.Biol.，215=403-410(1990)中所述的基本局部比對(duì)工具(BasicLocalAlignmentTool(BLAST))，Needleman等，J.Mol.Biol.，48:444_453(1970)的算法，或Meyers等，Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988)的算法。術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”意指包含圍繞內(nèi)部水性空間的外部脂質(zhì)雙層或多層膜的組合物。該術(shù)語(yǔ)包括多薄層狀脂質(zhì)體，它通常直徑在大約1個(gè)至大約10個(gè)微米的范圍內(nèi)，并且包含與水相層交替的兩個(gè)至數(shù)百個(gè)同心脂質(zhì)雙層。該術(shù)語(yǔ)包括由單一脂質(zhì)層構(gòu)成的單薄層囊泡，并且通常直徑在大約20至大約400納米(run)、大約50至大約300nm、大約300至大約400nm、或者大約100至大約200nm的范圍內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)還包括直徑大約65nm至大約75nm的脂質(zhì)體。術(shù)語(yǔ)“抗體”指免疫球蛋白或其片段，而且涵蓋包含抗原結(jié)合片段或抗原結(jié)合域的任何多肽。該術(shù)語(yǔ)包括但不限于多克隆的、單克隆的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、人(源)的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜合的、突變的、嫁接的和體外產(chǎn)生的抗體。除非在前面加上了“完整的”一詞，否則術(shù)語(yǔ)“抗體”包括抗體片段諸如Fab、F(ab')2、Fv、SCFv、Fd、dAb和保持抗原結(jié)合功能的其它抗體片段。通常，這樣的片段會(huì)包含抗原結(jié)合域。術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合域”和“抗原結(jié)合片段”指包含負(fù)責(zé)抗體和抗原之間特異性結(jié)合的氨基酸的抗體分子部分。被抗體特異識(shí)別并結(jié)合的抗原部分被稱為“表位”，它可以是或者可以不是多肽中毗鄰序列的氨基酸殘基，并且它可包含糖和/或具有其它化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子?？乖Y(jié)合域可包含抗體輕鏈可變區(qū)和抗體重鏈可變區(qū)(Vh)；然而，它不是必須兩者都包含的。例如，F(xiàn)d片段具有兩個(gè)并且經(jīng)常保留完整抗原結(jié)合域的某些抗原結(jié)合功能?？贵w的抗原結(jié)合片段的例子包括(I)Fab片段，即具有\(zhòng)、Vh、(^和ChI結(jié)構(gòu)域的單價(jià)片段；(2)F(ab')2片段，即具有由鉸鏈區(qū)處二硫橋相聯(lián)接之兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(3)具有兩個(gè)Vh和ChI結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(4)具有抗體單臂之\和Vh結(jié)構(gòu)域的Fv片段；(5)dAb片段(Wardetal.，(1989)Nature341:544_546)，它具有Vh結(jié)構(gòu)域；及(6)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域八和Vh是由分開(kāi)的基因編碼的，但利用重組方法可將它們接合起來(lái)，通過(guò)合成的接頭使它們能夠成為單一的蛋白鏈，其中\(zhòng)和Vh區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參閱例如Birdetal.(1988)Science242:423_426；和Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879_5883)。這些抗體片段可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且所說(shuō)片段可被篩選以與完整抗體相同的方式發(fā)揮效用。術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”在多核苷酸的上下文中指在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。提高DNA/DNA和DNA/RNA這兩種雜交反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性的條件是本領(lǐng)域普遍已知并已發(fā)表的。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件的例子包括在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中于大約65-70°C雜交，或者在4XSSC加50%甲酰胺中于大約42-50°C雜交，隨后在IXSSC中于大約65-70°C清洗一次或多次。當(dāng)所述的肽與肝細(xì)胞癌細(xì)胞結(jié)合或相互作用但不與其它細(xì)胞顯著結(jié)合或相互作用時(shí)，該肽是對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞“特異性的”。術(shù)語(yǔ)“配體”指結(jié)合另一分子的分子，包括受體。“宿主細(xì)胞”是可以成為或已經(jīng)成為任何重組載體或分離的多核苷酸的接受者的個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單一宿主細(xì)胞的后代，并且所述后代可以由于天然的、意外的或蓄意的突變和/或改變而不必與最初的親本細(xì)胞完全相同(在形態(tài)學(xué)上或在全部DNA互補(bǔ)物中)。宿主細(xì)胞包括經(jīng)本公開(kāi)之重組載體或多核苷酸體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。包含本公開(kāi)之重組載體的宿主細(xì)胞可被稱為“重組宿主細(xì)胞”。“標(biāo)本”是自患者衍生的任何生物學(xué)標(biāo)本。此術(shù)語(yǔ)包括但不限于生物學(xué)流體諸如血液、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、淚液、唾液、淋巴、透析液、灌洗液、精液和其它液體樣品，以及生物學(xué)來(lái)源的細(xì)胞和組織。該術(shù)語(yǔ)還包括細(xì)胞或自其衍生的細(xì)胞及其后代，包括培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上清液和細(xì)胞溶胞物。它進(jìn)一步包括器官或組織培養(yǎng)衍生的液體、組織活檢樣品、腫瘤活檢樣品、大便樣品、和自生理學(xué)組織提取的液體、以及自實(shí)體組織離解的細(xì)胞、組織切片和細(xì)胞溶胞物。此定義涵蓋在獲取之后以任何方式被操作的樣品，諸如用試劑處理、增溶、或針對(duì)特定組分(諸如多核苷酸或多肽)富集。還包括在此術(shù)語(yǔ)中的是患者樣品的衍生物和級(jí)分。患者樣品可用于診斷、預(yù)后或其它監(jiān)測(cè)測(cè)定法。該術(shù)語(yǔ)還應(yīng)用于來(lái)自非人哺乳動(dòng)物的生物學(xué)標(biāo)本。所述標(biāo)本可來(lái)自人患者或非人哺乳動(dòng)物。如本文中所使用的，“治療”涵蓋針對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物中的疾病的治療法的任何施用或應(yīng)用，而且包括抑制疾病、阻止其發(fā)展、或減緩病情，例如通過(guò)引起消退，或者恢復(fù)或修復(fù)丟失的、缺少的或有缺陷的功能，或者刺激無(wú)效的過(guò)程。該術(shù)語(yǔ)包括獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果，涵蓋對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的病理學(xué)狀況或病癥的任何處理。所述的效果從完全或部分預(yù)防病癥或其癥狀的角度而言可以是預(yù)防性的，和/或從部分或完全治愈病癥和/或由其造成之有害影響的角度而言可以是治療性的。因此，本公開(kāi)既提供了治療法也提供了預(yù)防法。它包括(1)預(yù)防病癥在可能易患該病癥但尚未有癥狀的受試者中發(fā)生或復(fù)發(fā)，(2)抑制病癥，諸如阻止它的發(fā)展，(3)停止或終止病癥或至少其相關(guān)癥狀，以便宿主不再受所述病癥或其癥狀之苦，諸如引起所述病癥或其癥狀的消退，例如，通過(guò)恢復(fù)或修復(fù)丟失的、缺少的或有缺陷的功能，或者刺激無(wú)效的過(guò)程，或(4)解除、減輕或改善病癥或其相關(guān)癥狀，其中改善在廣義上用于指至少某個(gè)參數(shù)量值(諸如炎癥、疼痛和/或腫瘤大小)的減小。“藥學(xué)上可接受載體”指非毒性的固體、半固體或液體填充物、稀釋劑、封裝材料、配方助劑或任一常規(guī)類型的賦形劑。藥學(xué)上可接受載體在所采用的劑量和濃度上是對(duì)接受者無(wú)毒的，并且是與配方中的其它成分相容的?！敖M合物”在此指通常包含載體諸如本領(lǐng)域常規(guī)的且適合出于治療、診斷或預(yù)防目的施用于受試者的制藥學(xué)可接受載體或賦形劑的混合物。它可以包括細(xì)胞培養(yǎng)物，其中多肽或多核苷酸存在于所述細(xì)胞或培養(yǎng)液中。例如，適于口服施用的組合物可形成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊劑、持續(xù)釋放配制劑、漱口水或粉劑。9“疾病”指需要醫(yī)療干預(yù)或想要醫(yī)療干預(yù)的任何狀況、感染、病癥或綜合征。這樣的醫(yī)療干預(yù)可包括治療、診斷和/或預(yù)防?！鞍┌Y”是任何異常的細(xì)胞或組織生長(zhǎng)，例如腫瘤，無(wú)論是惡性的、惡性前的或非惡性的。其特征在于細(xì)胞不受控制的增殖，它們可以侵入或可以不侵入周?chē)M織并因此可以轉(zhuǎn)移或可以不轉(zhuǎn)移至新的身體部位。癌癥(cancer)涵蓋癌(carcinoma)，它們是上皮細(xì)胞的癌癥，癌包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、黑素瘤和肝瘤(h印atoma)。癌癥還涵蓋肉瘤，它們是間充質(zhì)起源的腫瘤，肉瘤包括骨源性肉瘤、白血病和淋巴瘤。癌癥可涉及一種或多種新生物細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)癌癥包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌和口腔癌。II.本公開(kāi)的特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽本公開(kāi)提供了多核苷酸或其變體，其中所說(shuō)的多核苷酸編碼特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽，并且所說(shuō)的多核苷酸包含選自以下的序列SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11、SEQIDNO:13、SEQIDN0:15、SEQIDNO17,SEQIDNO19,SEQIDN0:21、SEQIDNO23,SEQIDNO:25禾口SEQIDNO:29。本公開(kāi)提供了多肽或其變體，其中所說(shuō)的多肽是特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞，并且所說(shuō)的多肽包含選自以下的序列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、EQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO22,SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28禾口SEQIDNO:30。在某一實(shí)施方案中，所述多肽包含SP94(SEQIDNO2)或其變體。在另一實(shí)施方案中，所述多肽包含SP94(SEQIDNO:2)。A.變體變體包括所述肽的生物學(xué)活性變體，其中包括在結(jié)構(gòu)上實(shí)質(zhì)相似或?qū)嵸|(zhì)相同的變體。肽序列的變體可包括相較于主體肽而言的插入、添加、刪除或替代。多肽序列的變體包括生物學(xué)活性多態(tài)變體。本公開(kāi)之核苷酸和多肽的變體包括例如，那些在序列上與所公開(kāi)的核酸分子和多肽至少約50%，、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的。本公開(kāi)之核苷酸和多肽的變體包括例如，那些在序列上與所公開(kāi)的核酸分子和多肽至少約50%，、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相似的。本公開(kāi)之多肽的變體包括相較于表1中所提供的序列而言具有1、2、3、4、5、6個(gè)或更多處插入、添加、刪除或替代的變體。在某一實(shí)施方案中，所述變體相較于表1中所提供的序列而言包含1、2、3、4、5、6個(gè)或更多處插入、添加、刪除或替代，其中所述的插入、添加、刪除或替代不改變表1中針對(duì)該序列粗體指示的氨基酸。在另一實(shí)施方案中，所述變體包含來(lái)自單一序列并在表1中以粗體指示的氨基酸。本公開(kāi)之多核苷酸的變體包括相較于表2中所提供的序列而言具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18處插入、添加、刪除或替代的變體。在某一實(shí)施方案中，所述變體相較于表2中所提供的序列而言包含插入、添加、刪除或替代，其中所述的插入、添加、刪除或替代不改變編碼表1中針對(duì)該序列粗體指示之氨基酸的核苷酸。在另一實(shí)施方案中，所述變體包含編碼來(lái)自單一序列并在表1中以粗體指示之氨基酸的核苷酸。肽變體可包括編碼和非編碼氨基酸、化學(xué)或生化修飾、衍生或設(shè)計(jì)(designer)氨基酸、氨基酸類似物、肽膜似物(ρ印tidomimetic)和酯肽(d印sip印tide)，及具有修飾的、環(huán)狀的、雙環(huán)的、縮環(huán)的(d印sicyclic)或縮雙環(huán)的(d印sibicyclic)肽主干的多肽。變體包括單鏈蛋白質(zhì)以及多聚體。本公開(kāi)之肽的變體可包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。變體可包含D型氨基酸、D型和L型氨基酸的組合、及各種“設(shè)計(jì)”或“合成”氨基酸(例如，β-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸和Na-甲基氨基酸等等)來(lái)傳達(dá)特殊特性。此外，變體可以是環(huán)狀的。為了引人特殊構(gòu)象基序，變體可以包括非經(jīng)典氨基酸。任何已知的非經(jīng)典氨基酸都可使用?？蓪被犷愃莆锖碗哪M物摻入肽中以誘導(dǎo)或促成特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括但不限于LL-Acp(LL-3-氨基-2-propenidone-6-羧酸)、β-轉(zhuǎn)角誘導(dǎo)二肽類似物、β-片層誘導(dǎo)類似物、轉(zhuǎn)角誘導(dǎo)類似物、α-螺旋誘導(dǎo)類似物、Y-轉(zhuǎn)角誘導(dǎo)類似物、Gly-Ala轉(zhuǎn)角類似物、酰胺鍵等排物或tretrazol、等等?？蓪⒚摪被蛎擊然鶜埢鶕饺胨鲎凅w的末端，以便沒(méi)有末端氨基或羧基基團(tuán)，從而降低對(duì)蛋白酶的易感性或約束構(gòu)象。C-末端官能團(tuán)包括酰胺、酰胺低級(jí)烴/烷基、酰胺二(低級(jí)烴/烷基)、低級(jí)烴/烷氧基、羥基和羧基及其低級(jí)酯衍生物，及其藥學(xué)可接受鹽。此外，如果需要，還可將非經(jīng)典氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物作為替代或添加而引入多肽序列中。非經(jīng)典氨基酸包括但不限于常見(jiàn)氨基酸的D-異構(gòu)體、2，4-二氨基丁酸、a-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-AhX、6-氨基己酸、Aib、2_氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、b-丙氨酸、氟-氨基酸、設(shè)計(jì)氨基酸諸如b-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸和通常的氨基酸類似物。此外，所述氨基酸可以是D型(右旋的)或L型(左旋的)。變體包括與本公開(kāi)之肽實(shí)質(zhì)上相似的多核苷酸序列。這樣的變體可由與本公開(kāi)之多核苷酸的互補(bǔ)物雜交的核酸編碼。B.融合蛋白和偶聯(lián)物本公開(kāi)提供了包含相融合的第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中所述的第一多肽包含特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽。所述的第二肽選自但不限于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、異源氨基酸序列諸如生物發(fā)光蛋白質(zhì)，例如螢光素或水母發(fā)光蛋白(綠色熒光蛋白)，具有異源或同源前導(dǎo)序列。所述融合蛋白可包含N-末端甲硫氨酸殘基、PEG化蛋白質(zhì)和帶免疫學(xué)標(biāo)簽的或帶HIS標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。這樣的融合蛋白還包括與表位的融合。這樣的融合蛋白可包含本公開(kāi)之肽的多聚體，例如同二聚體或同多聚體及異二聚體和異多聚體?？蓪⒈竟_(kāi)之肽與標(biāo)記物偶聯(lián)，諸如但不限于FITC；生物素；和放射性同位素，包括但不限于64CU、67CU、9°Y、99mTC、mIn、124I、125I、131I、137CS、186Re、211At、212Bi、213Bi、223Ra、241Am和244Cm;具有可檢測(cè)產(chǎn)物的酶(例如螢光素酶、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶，等等)；熒光劑和熒光標(biāo)記物；發(fā)射熒光的金屬，例如152Eu或其它鑭系元素；電化學(xué)發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物，例如魯米諾、異魯米諾或吖啶鹽；特異性結(jié)合分子，例如磁性顆粒、微球體、納米球體、等等。本公開(kāi)之肽可與治療劑偶聯(lián)，諸如長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)、順鉬(cisplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、中白利他塞(paclitaxel)、依托泊昔(etoposide)、能滅瘤(Novantrone)(米托蒽醌(mitoxantrone))、放線菌素D、喜樹(shù)堿(camptohecin)(或其水溶性衍生物)、氨甲喋呤(methotrexate)、絲裂霉素(mitomycin)(例如絲裂霉素C)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、及抗腫瘤抗生素諸如多柔比星(doxorubicin)和道諾霉素(daunomycin)，或其它例如文獻(xiàn)(DeVitaetal.，2001)中所述的治療劑。肽還可與細(xì)胞毒性藥物、寡核苷酸、毒素和放射性分子或諸如文獻(xiàn)(Ngetal，2006)中所述的抗VEGF適體等化合物偶聯(lián)。III.特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多肽的制備方法本公開(kāi)的肽可用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生?；诩?xì)胞的方法和無(wú)細(xì)胞的方法都適于產(chǎn)生本公開(kāi)的肽?；诩?xì)胞的方法通常包括在體外將核酸引入宿主細(xì)胞并在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，然后自培養(yǎng)液中或者通過(guò)例如破裂宿主細(xì)胞的方式自宿主細(xì)胞中或者自這兩者中收獲所述的肽。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括原核或真核細(xì)胞，包括例如細(xì)菌、酵母、真菌、植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本公開(kāi)還提供了用本領(lǐng)域眾所周知的無(wú)細(xì)胞體外轉(zhuǎn)錄/翻譯方法產(chǎn)生肽的方法。通常，異源肽，無(wú)論被修飾或未被修飾，都可如上所述自己表達(dá)或者作為融合蛋白表達(dá)，而且可以不僅包括分泌信號(hào)，還包括分泌的前導(dǎo)序列。本公開(kāi)之分泌前導(dǎo)序列可指引某些蛋白質(zhì)到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。ER將膜結(jié)合的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)分開(kāi)。一旦定位至ER，蛋白質(zhì)可進(jìn)一步被指引至高爾基體以分配至囊泡，包括分泌小泡、質(zhì)膜、溶酶體及其它細(xì)胞ο此外，可將肽模塊和/或純化標(biāo)簽加至所述肽。這樣的區(qū)域可在所述多肽的最終制備之前去除。為了分泌或排泄、提高溶解度、及方便純化及其它原因而添加肽模塊至多肽是本領(lǐng)域所熟悉和常規(guī)的技術(shù)。適當(dāng)?shù)募兓瘶?biāo)簽包括例如V5、多組氨酸、親合素和生物素。肽與諸如生物素等化合物的偶聯(lián)可利用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來(lái)完成(Hermanson編(1996)BioconjugateTechniques；AcademicPress)。也可利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將肽與放射性同位素、毒素、酶、熒光標(biāo)記物、膠體金、核酸、長(zhǎng)春瑞濱和多柔比星偶聯(lián)(Hermanson編(1996)BioconjugateTechniques；AcademicPress；Stefanoetal.(2006))。毒素包括免疫毒素。KreitmanandPastan，Immunotoxinsinthetreatmentofhematologicmalignancies.CurrDrugTargets.71301-11(2006)0適合用于本公開(kāi)的融合配偶包括例如胎球蛋白、人血清清蛋白、Fc和/或它們的一種或多種片段。此外還提供了諸如聚乙二醇偶聯(lián)物等偶聯(lián)的蛋白質(zhì)。本公開(kāi)的肽還可利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)化學(xué)合成(例如參閱Hunkapilleretal.,Nature,310105111(1984)；Grant編(1992)SyntheticPeptides,AUsersGuide,W.H.FreemanandCo.；美國(guó)專利No.6，974，884))。例如，與某多肽的片段對(duì)應(yīng)的多肽可通過(guò)使用肽合成儀或者通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的固相方法進(jìn)行合成。本公開(kāi)的多肽可用標(biāo)準(zhǔn)方法回收和純化自化學(xué)合成和重組細(xì)胞培養(yǎng)物，所述的標(biāo)準(zhǔn)方法包括但不限于硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選的是采用高效液相層析(“HPLC“)進(jìn)行純化。當(dāng)多肽在分離和/或純化期間變性時(shí)可采用眾所周知用于蛋白質(zhì)再折疊的技術(shù)以便重建活性構(gòu)象。本公開(kāi)的肽或肽模擬物可被修飾或共價(jià)偶聯(lián)一個(gè)或多個(gè)多種親水性聚合物以提高所述肽的溶解度和循環(huán)半衰期。適合用于與肽偶聯(lián)的非蛋白質(zhì)親水性聚合物包括但不限于聚烴/烷基醚例如聚乙二醇和聚丙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧化烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素和纖維素衍生物、右旋糖苷(dextran)和右旋糖苷衍生物。通常，這樣的親水性聚合物的平均分子量的范圍為大約500至大約100，000道爾頓、大約2，000至大約40，000道爾頓、或者大約5，000至大約20，000道爾頓。可用以下文獻(xiàn)所提出的任何方法將肽衍生或偶聯(lián)這樣的聚合物:Zallipsky,S.(1995)BioconjugateChem.，6150-165；Monfardini,C.，etal.(1995)BioconjugateChem.6:62_69；美國(guó)專利No.4，640，835；4，496，689；4，301，144；4，670，417；4，791，192；4，179，337或W095/34326。IV.抗體的產(chǎn)生本公開(kāi)的分離的蛋白質(zhì)可通過(guò)本領(lǐng)域普遍已知的抗體產(chǎn)生方法用于產(chǎn)生抗體，或者單克隆的或者多克隆的。因此，本公開(kāi)還包括針對(duì)特異于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的肽的抗體?？贵w包括阻斷活性的抗體和不阻斷活性的抗體?？赏ㄟ^(guò)例如傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)(KohlerandMilstein,Nature256495-499(1975))、重組DNA方法(例如美國(guó)專利No.4，816，567)或使用抗體文庫(kù)的通過(guò)噬菌體展示技術(shù)(Clacksonetal.，Nature352624-628(1991)；Marksetal.，J.Mol.Biol.222:581-597(1991))來(lái)制備抗體。有關(guān)各種抗體制備技術(shù)參閱Antibodies:ALaboratoryManual,編Harlowetal.,ColdSpringHarborLaboratory(1988)。本公開(kāi)的抗體可用于治療下文所述的疾病?？贵w還可用于所述的檢測(cè)測(cè)定法和方法中。V.脂質(zhì)體的制備用于制備脂質(zhì)體的多種方法是本領(lǐng)域所已知的，其中幾種可參閱LichtenbergandBarenholz，于MethodsofBiochemicalAnalysis，33卷，337—462(1988)?？扇缜八鐾ㄟ^(guò)薄膜水合和重復(fù)擠壓的標(biāo)準(zhǔn)方法的聯(lián)合制備小的單層囊泡(SUV，尺寸<lOOnm)(Tsengetal.，1999)。特別涉及通過(guò)脂質(zhì)體封裝DNA的制備方法以及直接應(yīng)用于脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染的方法可參閱HugandSleightetal(1991)。制備脂質(zhì)體的方法還披露于美國(guó)專利No.6，355，267和美國(guó)專利No.6，663，885中。可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過(guò)反相蒸發(fā)方法產(chǎn)生脂質(zhì)體。通過(guò)限定孔徑的濾器擠出脂質(zhì)體以產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體。月旨質(zhì)體還可購(gòu)自諸如TaiwanLiposomeCompany(Taipei,Taiwan)等來(lái)源。別的商品化脂質(zhì)體包括TLC-D99、Lipo-Dox,Doxil,DaunoXome,AmBisome,ABELCET、transfectace(DDAB/D0PE)、D0TAP/D0PE禾口Lipofectin0本公開(kāi)的脂質(zhì)體最常見(jiàn)的是制備自磷脂，但分子形狀和尺寸類似且同時(shí)具有疏水和親水模塊的其它分子也可使用。就本公開(kāi)的目的而言，所有這樣的適合形成脂質(zhì)體的分子在此都被稱為脂質(zhì)。一種或更多種天然存在和/或合成的脂質(zhì)化合物可用于所述脂質(zhì)體的制備。脂質(zhì)體可以是陰離子的、陽(yáng)離子的或者中性的，這取決于親水基團(tuán)的選擇。例如，當(dāng)使用具有磷酸根或硫酸根基團(tuán)的化合物時(shí)，所產(chǎn)生的脂質(zhì)體將會(huì)是陰離子型的。當(dāng)使用含氨基的脂質(zhì)時(shí)，脂質(zhì)體將帶正電荷，并將是陽(yáng)離子脂質(zhì)體。適于形成本公開(kāi)中可用之初始脂質(zhì)體的代表性磷脂或脂質(zhì)化合物包括但不限于磷脂相關(guān)材料諸如磷脂酰膽堿(卵磷脂)、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇_胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、磷酸雙十六酯、磷脂酰膽堿和二棕櫚酰-磷脂酰甘油(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol)。別的不含磷的脂質(zhì)包括但不限于硬脂酰胺、十二烷胺(dodecylamine)、十六烷胺(hexadecyl-amine)、乙?；貦八狨?acetylpalmitate)、蓖麻油酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸異丙酯、兼性丙烯酸類聚合物、脂肪酸、脂肪酸酰胺、膽固醇、膽固醇酯、二酰甘油、琥珀酸二酰甘油酉旨(diacylglycerolsuccinate)、等等。用于本公開(kāi)的脂質(zhì)體制備物包括陽(yáng)離子的(帶正電荷的)、陰離子的(帶負(fù)電荷的)和中性的制備物。將化合物遠(yuǎn)程裝載入脂質(zhì)體采用跨膜梯度的形成(CehandLasic,1995)。此方法包括將要裝載入脂質(zhì)體的化合物和硼酸化合物與懸浮的脂質(zhì)體一起溫育，由此完成所述化合物在脂質(zhì)體內(nèi)的聚集(Zalipskyetal.，1998；CehB.andLasicD.D.，1995；Zalipskyetal1998；美國(guó)專利No.6，051，251)。可用磷酸鹽測(cè)定法來(lái)測(cè)定脂質(zhì)體濃度。一種磷酸鹽測(cè)定法是以鉬酸鹽和孔雀石綠色染料之間的相互作用為基礎(chǔ)的。主要原理包括無(wú)機(jī)磷酸鹽與鉬酸鹽反應(yīng)形成無(wú)色的未還原的磷鉬酸鹽復(fù)合物，該復(fù)合物在酸性條件下被還原時(shí)轉(zhuǎn)變成藍(lán)色復(fù)合物。在與孔雀石綠復(fù)合時(shí)磷鉬酸鹽顏色增強(qiáng)20或30倍。終產(chǎn)物即還原的綠色可溶性復(fù)合物通過(guò)其在620nm的吸光度來(lái)測(cè)量，并且是對(duì)溶液中無(wú)機(jī)磷酸鹽的直接測(cè)量。VI.藥物組合物的制備本公開(kāi)的脂質(zhì)體、肽和抗體可包含一種或多種廣泛種類的已用于治療癌癥和抑制血管發(fā)生的藥物，它們包括但不限于長(zhǎng)春瑞濱、順鉬、吉西他濱、帕利他塞、依托泊苷、能滅瘤(米托蒽醌)、放線菌素D、喜樹(shù)堿(或其水溶性衍生物)、氨甲喋呤、絲裂霉素(例如絲裂霉素C)、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、環(huán)磷酰胺、及抗腫瘤抗生素諸如多柔比星和道諾霉素，或其它例如文獻(xiàn)(DeVitaetal.,2001)中所述的藥物。脂質(zhì)體、肽和抗體還可包含細(xì)胞毒性藥物、寡核苷酸、毒素和放射性分子。脂質(zhì)體、肽和抗體還可包含化合物諸如文獻(xiàn)(Ngetal,2006)中所述的抗VEGF適體。在某些實(shí)施方案中，所述的脂質(zhì)體、肽或抗體在具有藥學(xué)可接受載體、賦形劑和稀釋劑的配制劑中提供，其中的廣泛種類是本領(lǐng)域所已知的。這些藥學(xué)載體、賦形劑和稀釋劑包括USP藥學(xué)賦形劑列表上所列出的那些。USP和NF賦形劑列于產(chǎn)品目錄第2404-2406頁(yè)，USP24NF19，UnitedStatesPharmacopeialConventionInc.，Rockville，Md.(ISBN1-889788-03-1)。公眾容易獲取藥學(xué)可接受賦形劑諸如媒介、佐劑、載體或稀釋劑。此外，藥學(xué)可接受輔助物質(zhì)諸如PH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑等等是公眾容易獲取的。適當(dāng)?shù)妮d體包括但不限于水、右旋糖、甘油、鹽水、乙醇及其組合。所述載體可包含別的試劑諸如濕潤(rùn)或乳化劑、PH緩沖劑、或增強(qiáng)配制劑效力的佐劑。表面載體包括液態(tài)石油、棕櫚酸異丙酯、聚乙二醇、乙醇(95%)、聚氧乙烯單月桂酸酯(5%)水溶液、或月桂基硫酸鈉(5%)水溶液?？稍诒匾獣r(shí)添加其它材料諸如抗氧化劑、保濕劑、粘性穩(wěn)定劑和類似的制劑。還可包括經(jīng)皮滲透增強(qiáng)劑諸如Azone。就藥學(xué)劑量形式而言，本公開(kāi)的組合物可以以其藥學(xué)可接受鹽的形式施用，或者它們也可單獨(dú)使用或與其它藥學(xué)活性化合物適當(dāng)?shù)穆?lián)合及組合使用。受試組合物依照潛在施用模式配制。本公開(kāi)的脂質(zhì)體、肽和抗體可配制成供注射用的制劑，通過(guò)將其溶解、懸浮或乳化于水性或非水性溶劑中，諸如植物油或其它類似的油、合成的脂族酸甘油酯、高級(jí)脂族酸的酯或丙二醇，以及如果需要，加上常規(guī)的添加劑諸如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。正如本領(lǐng)域中常規(guī)的，還可使用用于口服或胃腸外遞送的其它配制劑。VII.治療方法A.施用路徑、劑量和頻率本公開(kāi)包含治療藥物的肽或脂質(zhì)體可通過(guò)以下方式施用于需要治療的受試者通過(guò)全身注射，諸如通過(guò)靜脈內(nèi)注射；或者通過(guò)注射或應(yīng)用至有關(guān)部位，諸如通過(guò)直接注射入腫瘤或當(dāng)某部位在外科手術(shù)中暴露時(shí)直接應(yīng)用于該部位；或者通過(guò)表面應(yīng)用，諸如例如若病癥在皮膚上時(shí)。需要治療的受試者包括罹患疾病諸如癌癥包括HCC或肝癌的受試者。本公開(kāi)的肽可用于將抗體靶向于癌癥以進(jìn)行治療。在某一實(shí)施方案中，本公開(kāi)的肽被施用于需要治療的受試者，隨后施用與該肽特異性結(jié)合的抗體。靶向抗體可介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性，或者可修飾靶分子的潛在功能。這樣的抗體可以以抗體偶聯(lián)物的形式使用以便直接遞送對(duì)靶組織有治療效果的藥劑。這樣的藥劑包括放射性核素、毒素、化療劑、抗VEGF適體和抗血管發(fā)生化合物?？捎酶鞣N各樣的方式完成施用，包括口服、口腔、鼻、直腸、胃腸外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、心內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、氣管內(nèi)、鞘內(nèi)施用，或別的通過(guò)植入或吸入。因此，受試組合物可配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，諸如片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑和氣霧劑。以下方法和賦形劑只作為例示而決非限制。適當(dāng)?shù)馁x形劑媒介是例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等等，及其組合。此外，如果需要，所述媒介可包含少量的輔助物質(zhì)諸如濕潤(rùn)或乳化劑或PH緩沖劑。制備所述劑量形式的實(shí)際方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的或顯而易見(jiàn)的。無(wú)論如何，要施用的組合物或配制劑會(huì)包含足以在所治療的受試者中實(shí)現(xiàn)期望狀態(tài)的量的藥劑。通常，本公開(kāi)的組合物施用于患者的劑量范圍為大約1μg/kg至大約20mg/kg、大約1μg/kg至大約10mg/kg、大約1μg/kg至大約lmg/kg、大約10μg/kg至大約lmg/kg、大約10μg/kg至大約100μg/kg、大約100μg至大約lmg/kg、或大約500μg/kg至大約lmg/kg之間?？贵w以推注劑量(bolusdose)形式施用以使抗體施用于患者后在患者身體中可循環(huán)的時(shí)間間隔最大化。還可在最初的推注劑量后使用持續(xù)的輸注。劑量給藥可以是一劑，或者間隔一定時(shí)間諸如每天一次、每周一次或每月一次。劑量進(jìn)程表可基于例如所述多肽對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的親和力、所述多肽的半衰期和患者狀況的嚴(yán)重性進(jìn)行調(diào)整。B.聯(lián)合療法本公開(kāi)的肽或脂質(zhì)體可作為單一療法使用?；蛘撸竟_(kāi)的肽或脂質(zhì)體可與標(biāo)準(zhǔn)化療或放療方案聯(lián)合使用來(lái)治療癌癥。在癌癥療法中采用的藥物可能對(duì)癌細(xì)胞具有毒害細(xì)胞或抑制細(xì)胞的作用，或者可能減少惡性細(xì)胞的增殖。本公開(kāi)的脂質(zhì)體、肽或抗體可與放射療法結(jié)合。本公開(kāi)的脂質(zhì)體、肽或抗體可附加與DeVitaetal.，編(2001)中所述的治療方法一起使用。對(duì)于其中本公開(kāi)的脂質(zhì)體、肽或抗體與第二抗癌劑針對(duì)癌細(xì)胞發(fā)揮協(xié)同效果的那些組合，第二藥劑的劑量可以相較于該第二藥劑單獨(dú)施用時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)劑量而言有所降低。提高癌細(xì)胞敏感性的方法包括將本公開(kāi)的脂質(zhì)體、肽或抗體與一定量的有效增強(qiáng)癌細(xì)胞敏感性的化療抗癌藥物共施用。共施用可以是同時(shí)或者非同時(shí)施用。在治療方案的過(guò)程期間可將本公開(kāi)的脂質(zhì)體、肽或抗體連同其它治療劑一起施用。在某一實(shí)施方案中，本公開(kāi)的脂質(zhì)體、肽或抗體與其它治療劑的施用是序貫的。可由內(nèi)科醫(yī)師根據(jù)諸如患者疾病的性質(zhì)和患者狀況等因素選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間進(jìn)程。VIII.診斷方法疾病特異性生物標(biāo)志物的檢測(cè)提供了一種有效的篩選策略。早期檢測(cè)不僅提供早期診斷，而且在癌癥的情況下，還能提供篩選多態(tài)性和檢測(cè)手術(shù)后殘余腫瘤細(xì)胞及隱藏的轉(zhuǎn)移的能力，后者是腫瘤復(fù)發(fā)的早期指標(biāo)。疾病特異性生物標(biāo)志物的早期檢測(cè)可由此在診斷前、治療中及消退中改善患者的存活。本公開(kāi)的肽可用作針對(duì)疾病包括癌癥的診斷或預(yù)后。所述肽可通過(guò)許多方式被用作診斷劑，包括但不限于ELISA、Western印跡、熒光、免疫熒光、免疫組化或放射自顯影。本公開(kāi)的抗體也可與本公開(kāi)的肽聯(lián)合用于檢測(cè)肝癌。在某些實(shí)施方案中，所述的測(cè)定法是結(jié)合測(cè)定法，它檢測(cè)抗體與結(jié)合至肝臟細(xì)胞癌癥細(xì)胞諸如肝細(xì)胞癌細(xì)胞的本公開(kāi)之肽的結(jié)合。受試多肽或抗體可被固定化，同時(shí)受試多肽和/或抗體可以被可檢測(cè)地標(biāo)記。例如，所述抗體可被直接標(biāo)記或可用經(jīng)過(guò)標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。也就是說(shuō)，適合于抗體的可檢測(cè)標(biāo)記物包括直接標(biāo)記物，其標(biāo)記目的蛋白質(zhì)的抗體，以及間接標(biāo)記，其標(biāo)記識(shí)別目的蛋白質(zhì)之抗體的抗體。在另一實(shí)施方案中，所述肽包含標(biāo)記物，且所述肽與組織的結(jié)合是通過(guò)測(cè)定該標(biāo)記物的存在來(lái)檢測(cè)的。IX.篩選方法本公開(kāi)提供了用于鑒定與本公開(kāi)的肽結(jié)合的生物學(xué)分子的方法。這樣的分子可以是細(xì)胞表面分子，其充當(dāng)結(jié)合該分子的治療或診斷劑的靶物。例如，特異于所述分子的肽或結(jié)合所述分子的抗體可用于治療或診斷其細(xì)胞產(chǎn)生所述分子的患者。在某一方法中，本公開(kāi)的肽可用作雙雜交測(cè)定法或三雜交測(cè)定法中的“誘餌蛋白質(zhì)”(參閱例如美國(guó)專利No.5，283，317;Zervosetal.(1993)；Maduraetal.(1993)；Barteletal.(1993)；Iwabuchietal.(1993)；及Suteretal.(2006))以鑒定與本公開(kāi)之肽結(jié)合或相互作用的其它蛋白質(zhì)。在另一方法中，將本公開(kāi)的與細(xì)胞提取物一起溫育以鑒定與本公開(kāi)的肽結(jié)合的生物學(xué)分子。在某一方法中，本公開(kāi)的肽被固定化于固體支持物上，諸如HPLC柱，而且在便于本公開(kāi)的與靶分子結(jié)合的條件下使細(xì)胞提取物暴露于固定化的肽。洗脫被結(jié)合的分子并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如質(zhì)譜術(shù)進(jìn)行鑒定。實(shí)施例本說(shuō)明書(shū)大部分依照本說(shuō)明書(shū)內(nèi)引用的參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)進(jìn)行透徹的理解。本說(shuō)明書(shū)內(nèi)的以下實(shí)施方案提供了本公開(kāi)之實(shí)施方案的例示，而不應(yīng)解釋為限制本公開(kāi)的范圍。技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到許多其它實(shí)施方案也為本公開(kāi)所涵蓋。I.實(shí)施例1噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)和生物淘選A.細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)使用了59T、Changliver、HA22T、H印3B、H印G2、J5、NTUBL、Mahlavu和SKifepl(都是人肝細(xì)胞癌系)及NNM(人原代正常鼻粘膜上皮)(8)。HCC細(xì)胞由HsiaoΜ.博士(GenomicResearchCenter,AcademiaSinica，Taiwan)惠贈(zèng)。全部的人HCC細(xì)胞系和NNM維持于Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)和10%胎牛血清(FBS)中，37°C，空氣中5%或10%CO2的潮濕氣氛。別的有用的細(xì)胞系包括人肺鱗狀細(xì)胞癌系A(chǔ)549、高度轉(zhuǎn)移性人肺腺癌系CL1-5、人肺腺癌系H23、人肺大細(xì)胞癌系H460、人肺癌系PC13、人鼻咽癌系NPC-TWOl、人口腔鱗狀細(xì)胞癌系SAS、人胰腺癌PaCa、結(jié)腸(HCT116)、乳房(BT483)、前列腺(PC3)、NNM、人正常鼻粘膜上皮和成纖維細(xì)胞。A549、H23、H460、PC13、PaCa、HCT116、PC3、Mahlavu和SAS可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。CL1-5和NPC-TWOl細(xì)胞系分別由(Chuetal.，1997)和(Linetal.，1990)建立。B.結(jié)合HCC細(xì)胞的噬菌體的分離用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)來(lái)選擇HCC、Mahlavu細(xì)胞特異性噬菌體。我們的實(shí)驗(yàn)中采用了噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)(RPL)Ph.D.-12試劑盒(NewEnglandBiolabs,Ipswich,ΜΑ,USA)。生物淘選規(guī)程依照先前的研究(35)并做一些修改進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，使Mahlavu細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80%匯合，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)漂洗，用含5mMEDTA的PBS收獲，并用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基收集。細(xì)胞懸浮液于4°C冷卻，然后添加1.5xIO11噬斑形成單位(pfu)的噬菌體展示肽庫(kù)。反應(yīng)混合物在4°C溫育1小時(shí)，轉(zhuǎn)移至不易混合的有機(jī)溶劑(酞酸二丁酯環(huán)己烷91)(Sigma-Aldrich,SaintLouis,MO,USA)的頂部，并離心。將噬菌體所結(jié)合的細(xì)胞沉淀物用LB培養(yǎng)基重懸浮，擴(kuò)增噬菌體并用大腸桿菌ER2738培養(yǎng)物(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)滴定。用Mahlavu細(xì)胞對(duì)回收的噬菌體進(jìn)行另外多輪的生物淘選。在LB/IPTG/X-Gal平板上對(duì)第5輪噬菌體洗提物進(jìn)行滴定以便進(jìn)行噬菌體克隆鑒定。經(jīng)過(guò)5輪親和力選擇(生物淘選)之后，第5輪的回收率比第1輪中觀察到的提高了3.5倍(圖1)。C.通過(guò)ELISA鑒定噬菌體克隆隨機(jī)分離96個(gè)噬菌體克隆并用于通過(guò)ELISA測(cè)定法與HCC細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞(NNM)反應(yīng)。大約IxlO4個(gè)Mahlavu和NNM細(xì)胞分開(kāi)接種于96孔ELISA平板并使其生長(zhǎng)過(guò)夜。所述平板用無(wú)血清DMEM清洗并用含1%BSA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基在4°C進(jìn)行封閉。然后加入IO9Pfu的各噬菌體克隆并在4°CC溫育1小時(shí)。用PBS清洗平板，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的抗M13抗體(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ,USA)并在4°C溫育1小時(shí)。平板用PBS清洗，隨后與過(guò)氧化物酶底物鄰苯二胺二鹽酸(0PD；Sigma-Aldrich,SaintLouis,M0,USA)一起溫育。用3NHCl終止反應(yīng)，并用微量板讀數(shù)器測(cè)定490nm的光也/又。II.實(shí)施例2流式細(xì)胞術(shù)和活檢分析A.特異性結(jié)合HCC細(xì)胞的噬菌體克隆的鑒定為了分析特異性結(jié)合HCC細(xì)胞的噬菌體克隆，進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析。將HCC細(xì)胞培養(yǎng)至70-80%匯合并用含5mMEDTA的PBS收獲。將HCC細(xì)胞重懸浮于FACS緩沖液(含F(xiàn)BS的PBS)中并分別與PC94或不編碼蛋白質(zhì)的對(duì)照噬菌體一起在4°C溫育1小時(shí)。經(jīng)FACS緩沖液清洗后，將HCC細(xì)胞與單克隆抗M13抗體一起在4°C溫育1小時(shí)，隨后與偶聯(lián)R-藻紅蛋白的抗小鼠抗體(SouthernBiotech,Birmingham,AL,USA)一起溫育30分鐘。在FACS-Calibur上用CellQuest軟件(BDBioscience,SanJose,CA,USA)進(jìn)行分析。結(jié)果揭示了噬菌體克隆94(PC94)具有對(duì)HCC細(xì)胞最好的反應(yīng)性，而其余的噬菌體克隆顯示出對(duì)HCC細(xì)胞中等的結(jié)合活性(圖2A)。(A通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定每個(gè)選定噬菌體對(duì)HCC細(xì)胞的表面結(jié)合活性；B用偶聯(lián)R-藻紅蛋白的抗小鼠IgG對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色；C細(xì)胞與對(duì)照噬菌體一起溫育)。通過(guò)將不同劑量的噬菌體與HCC細(xì)胞溫育并用FACS分析進(jìn)一步證實(shí)PC94的結(jié)合活性。結(jié)果顯示了PC94與HCC的結(jié)合以劑量依賴性方式發(fā)生(圖2B)。此外，用對(duì)照輔助噬菌體沒(méi)有發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性，當(dāng)PC94與NNM—起溫育時(shí)也沒(méi)有反應(yīng)性(圖2B)。這些結(jié)果揭示了HCC、Mahlavu細(xì)胞表達(dá)能被PC94上展示的肽識(shí)別的未知分子。為了調(diào)查其它的HCC細(xì)胞是否能被PC94識(shí)別，將9種HCC細(xì)胞系與PC94—起溫育并用FACS分析。結(jié)果顯示了9種HCC細(xì)胞系中有6種(Mahlavu、59T、H印3B、!fepG2、NTUBL和SKifepl)與PC94有強(qiáng)反應(yīng)(47-81.2%)而其它的HCC細(xì)胞系(Changliver和J5)有中等的反應(yīng)性(25.7-31.9%)，而HA22T細(xì)胞系只有弱反應(yīng)性(19.)(圖2C)。分析了PC94對(duì)每種HCC細(xì)胞系的表面結(jié)合活性(黃色用偶聯(lián)R-藻紅蛋白的抗小鼠IgG進(jìn)行染色；橙色細(xì)胞與對(duì)照噬菌體一起溫育)。結(jié)果顯示了所有這些細(xì)胞系都表達(dá)能被PC94展示的肽識(shí)別的靶分子(圖2C)。用來(lái)自HCC患者的外科手術(shù)標(biāo)本通過(guò)免疫組化進(jìn)一步測(cè)試了PC94對(duì)HCC細(xì)胞的結(jié)合特異性。結(jié)果顯示了PC94能識(shí)別HCC手術(shù)標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞(圖2D，a和b)但不識(shí)別它們的正常對(duì)應(yīng)物(圖2D，d)。對(duì)照噬菌體沒(méi)有揭示在HCC外科手術(shù)標(biāo)本的腫瘤組織中的免疫反應(yīng)性(圖2D，c)。將來(lái)自HCC患者的活檢標(biāo)本與PC94或?qū)φ帐删w一起溫育后用HRP偶聯(lián)的抗M13噬菌體抗體進(jìn)行檢測(cè)。在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了PC94免疫反應(yīng)性(D，a和b)但在它們的正常對(duì)應(yīng)物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)(D，d)。對(duì)照噬菌體不能結(jié)合這些活檢標(biāo)本(B，c)(標(biāo)尺，50μm)。為了在肝癌組織上定位所述的肽結(jié)合能力，用常規(guī)的免疫組化規(guī)程將人肝細(xì)胞癌的石蠟切片與噬菌體展示并生物素標(biāo)記的肽一起溫育。外科手術(shù)標(biāo)本經(jīng)國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)附屬醫(yī)院(NTUH)的設(shè)施內(nèi)倫理委員會(huì)(InstitutionalReviewBoard)批準(zhǔn)(IRBM6I7O2O2I)后獲自NTUH的組織庫(kù)。B.DNA測(cè)序和計(jì)算機(jī)分析通過(guò)ELISA和流式細(xì)胞術(shù)(圖2A)選定具有較高HCC細(xì)胞反應(yīng)性的15個(gè)噬菌體克隆(PC1、2、9、12、15、26、42、47、62、72、84、85、86、88和94)進(jìn)行測(cè)序。依照制造商的說(shuō)明書(shū)提取噬菌體DNA。通過(guò)雙脫氧核苷酸鏈終止法使用自動(dòng)化DNA測(cè)序儀(ABIPRISM377；Perkin-Elmer,ffaltham,MA,USA)測(cè)定純化的噬菌體的DNA序列。用-96gIII測(cè)序引物5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3‘(SEQIDNO:31)進(jìn)行測(cè)序。用GeneticComputerGroup(GCG)程序?qū)κ删w展示的肽序列進(jìn)行翻譯和比對(duì)。噬菌體展示的肽序列經(jīng)由GCG軟件進(jìn)行比對(duì)，揭示出獨(dú)特的共有基序序列(表1)。相應(yīng)的DNA序列見(jiàn)表2?；贕CG序列比對(duì)(表1)，選擇了均展示基序Pro-Ile/Leu-Leu-Pro(P-I/L-L_P)的PC94和PC88。III.實(shí)施例3用于體內(nèi)靶向測(cè)定法的動(dòng)物模型和肽競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法我們從幾個(gè)方面評(píng)估了PC94所編碼之多肽SP94作為針對(duì)HCC的靶向藥物遞送的藥物遞送導(dǎo)向器的潛力。首先，我們調(diào)查了SP94在體內(nèi)是否能靶向HCC細(xì)胞。我們檢查了PC94的腫瘤歸巢能力及HCC異種移植物模型中SP94對(duì)它的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。體內(nèi)歸巢實(shí)驗(yàn)顯示了PC94具有針對(duì)腫瘤組織的歸巢能力，結(jié)合活性比對(duì)照噬菌體高8倍(圖3A)。此外，在肽競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)中，SP94抑制了PC94對(duì)腫瘤塊的結(jié)合，而相同濃度的對(duì)照肽沒(méi)有這樣的抑制效果(圖3B)。A.用于PC94靶向的動(dòng)物模型為了證實(shí)PC94在體內(nèi)的靶向能力，給攜帶Mahlavu衍生HCC異種移植物(500mm3)的小鼠通過(guò)尾靜脈注射PC94或?qū)φ帐删w。噬菌體循環(huán)，然后灌注。結(jié)合至腫瘤組織和正常內(nèi)臟器官的噬菌體顆粒被回收。結(jié)果證實(shí)了回收自腫瘤組織的PC94噬菌體顆粒(標(biāo)準(zhǔn)化為每克組織)顯著多于回收自正常器官的，諸如腦(220倍)、心(32倍)和肺(23倍)。然而，對(duì)照噬菌體沒(méi)有揭示出歸巢現(xiàn)象，在腫瘤組織和正常器官中都沒(méi)有(圖3A)。將5xIO6個(gè)Mahlavu細(xì)胞從背兩側(cè)皮下(s.c.)注射入SCID小鼠(4-6周齡)。攜帶Mahlavu衍生異種移植物(500mm3)的小鼠靜脈內(nèi)(i.v.)注射2xl09pfu的PC94或?qū)φ帐删w。在灌注后，取出器官(腦、心和肺)和腫瘤組織，用冷的PBS清洗并稱重。用大腸桿菌ER2738培養(yǎng)物挽救結(jié)合至腫瘤組織和器官的噬菌體。在LB/IPTG/X-Gal平板上滴定洗脫的噬菌體顆粒。在肽競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)中，將2xl09pfu的PC94噬菌體與100μgSP94肽或?qū)φ针墓沧⑸洹Ｍㄟ^(guò)免疫組化染色來(lái)檢查在攜帶腫瘤的小鼠中靶向噬菌體的組織分布。將組織切片與小鼠抗M13抗體一起溫育，隨后與生物素化的馬抗小鼠抗抗體(ABC試劑盒；VectorLaboratories,Burlingame,CA,USA)一起溫育并用PBS清洗，然后浸入ABC試劑中。將切片浸入DAB溶液加0.01%過(guò)氧化氫中，用PBS清洗并用含50%甘油的PBS封固。B.肽競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法肽競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定法(圖3)證實(shí)了PC94對(duì)HCC細(xì)胞的結(jié)合活性是依賴于PC94展示的肽而非噬菌體顆粒的其余部分。這些結(jié)果強(qiáng)烈指示這些HCC細(xì)胞的質(zhì)膜表達(dá)未知靶分子，諸如蛋白質(zhì)，它能被合成肽SP94和PC94展示的肽識(shí)別，但不能被噬菌體的其它部分識(shí)別。1.肽合成和標(biāo)記靴向SP94(SFSIIHTPILPL)(SEQIDNO2)和對(duì)照(FPffFPLPSPYGN)(SEQIDNO32)肽由科學(xué)院生物化學(xué)研究所肽合成核心研究室合成并通過(guò)反相高效液相層析純化至大于95%的純度。通過(guò)將生物素分子偶聯(lián)至肽氨基末端來(lái)合成生物素標(biāo)記的肽(生物素-SP94和生物素-對(duì)照肽)。質(zhì)譜術(shù)確認(rèn)了預(yù)測(cè)的質(zhì)量。給攜帶HCC異種移植物的小鼠共注射PC94和相關(guān)合成肽SP94。結(jié)果顯示SP94顯著抑制自腫瘤組織中回收噬菌體顆粒。100μgSP94抑制88%的PC94結(jié)合腫瘤組織，但相同濃度的對(duì)照肽(con-P)沒(méi)有這樣的抑制效果(圖3B)。為了確認(rèn)PC94的組織分布，用抗噬菌體抗體對(duì)自歸巢和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)衍生的腫瘤和正常器官的組織切片進(jìn)行免疫染色。發(fā)現(xiàn)只有腫瘤細(xì)胞揭示了免疫反應(yīng)性(圖3C，d和e)，但正常器官諸如腦(圖3C，a)、心(圖3C，b)和肺(圖3C，c)沒(méi)有。然而，當(dāng)PC94與相關(guān)19合成肽SP94共注射時(shí)，在腫瘤組織中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)性(圖3C，j)。腫瘤細(xì)胞或正常器官均沒(méi)有用對(duì)照噬菌體發(fā)現(xiàn)具有免疫反應(yīng)性(C，f至i)(標(biāo)尺，50μm)。為了檢查SP94是否能提高靶向藥物的治療指數(shù)，我們調(diào)查了SP94對(duì)腫瘤組織而非正常器官的結(jié)合特異性。在歸巢能力測(cè)定法和肽競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)二者中，PC94被發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合腫瘤組織但不結(jié)合正常內(nèi)臟器官諸如腦、心和肺(圖3A和B)。免疫組化染色證明了PC94顆粒只定位于腫瘤組織中，而不定位于腦、心和肺組織中(圖3C)。最后，我們檢查了SP94肽是否能識(shí)別HCC患者腫瘤組織所產(chǎn)生的靶分子。PC94(圖2D)和生物素標(biāo)記的SP94二者都識(shí)別在HCC患者外科手術(shù)標(biāo)本上表達(dá)的靶蛋白質(zhì)，陽(yáng)性率為61.3%(19/31)。綜上所述，我們得出結(jié)論，SP94特異性識(shí)別由HCC細(xì)胞而非正常組織產(chǎn)生的未知靶分子。此分子因此可用于針對(duì)HCC的靶向藥物遞送，而且SP94提供了用于鑒定此分子的試劑。IV.實(shí)施例4:體內(nèi)腫瘤靶向治療法研究使用SP94和PEG化脂質(zhì)體多柔比星的組合，一種被稱為主動(dòng)的或配體介導(dǎo)的靶向的方法，此靶向DDS的位點(diǎn)特異性作用進(jìn)一步增強(qiáng)了抗腫瘤效果(圖4和6)并伴隨著腫瘤凋亡增加(圖5A、5B和6E)及腫瘤血管發(fā)生減少(圖5C和6D)。在PEG化脂質(zhì)體多柔比星(Lipo-Dox)配制劑的臨床試驗(yàn)中已觀察到改善的藥動(dòng)學(xué)特性和降低的系統(tǒng)毒性(40)。在此，我們的結(jié)果揭示了此靶向藥物遞送系統(tǒng)SP94-Lipo-DoX的位點(diǎn)特異性作用通過(guò)避免總白血球計(jì)數(shù)(WBC)的減少能進(jìn)一步降低血液學(xué)毒性(圖4C和6C)。用非靶向PEG化脂質(zhì)體多柔比星(Con-P-Lipo-Dox和Lipo-Dox)所觀察到的總WBC計(jì)數(shù)的減少可歸于其循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)、血管限制及單個(gè)核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞對(duì)它的非特異性吸收機(jī)會(huì)增加。這樣的白血球減少癥已被報(bào)道于針對(duì)晚期HCC患者的PEG化脂質(zhì)體多柔比星II期臨床試驗(yàn)中(41，42)。PEG化脂質(zhì)體多柔比星II期臨床試驗(yàn)的某些先前的研究已報(bào)道了所述藥物展現(xiàn)出在晚期HCC中幾乎沒(méi)有活性，響應(yīng)率最多0-14%(41-43)。因此此處所述的SP94-Lipo-Dox的增強(qiáng)的治療效力指示此靶向藥物遞送系統(tǒng)在治療晚期HCC患者中的重要臨床潛力。此外，與SP94相互作用的靶分子的鑒定會(huì)能夠確認(rèn)它在HCC腫瘤組織上的特異性表達(dá)并驗(yàn)證其作為HCC治療靶標(biāo)的用途。所述的靶向藥物遞送系統(tǒng)包含抗癌藥物、靶向配體，還可進(jìn)一步包含載體。鑒于多柔比星已被報(bào)道在HCC中提供了最一致的總響應(yīng)率(18%)(36)而且脂質(zhì)體多柔比星也已顯示出對(duì)頑固性乳腺癌和卵巢癌具有顯著的活性(37，38)，此藥物被選作抗癌劑且聚乙二醇包被的脂質(zhì)體(PEG化脂質(zhì)體)被選作載體。將PEG化脂質(zhì)體多柔比星與SP94偶聯(lián)(SP94-Lipo-Dox)以評(píng)估針對(duì)HCC的靶向藥物遞送的效力。在人HCC異種移植物模型中，相較于對(duì)照肽偶聯(lián)的Lipo-Dox(Con-P-Lipo-Dox)和Lipo-Dox處理組而言SP94-Lipo_Dox顯示出治療效力的提高(圖4和6)。不受任何特殊機(jī)制所限制，Con-P-Lipo-Dox和Lipo-Dox處理組的腫瘤生長(zhǎng)的部分抑制可用以下因素來(lái)解釋。首先，血管發(fā)生性腫瘤脈管系統(tǒng)的易漏可容許藥物偶聯(lián)物在腫瘤組織中選擇性溢出。此外，藥物偶聯(lián)物由于缺乏有效的淋巴排除可保留在腫瘤組織中。這些因素可導(dǎo)致藥物偶聯(lián)物在腫瘤組織中的被動(dòng)靶向和積聚(14)。此外動(dòng)物研究也已顯示出長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)的PEG化脂質(zhì)體多柔比星導(dǎo)致了被動(dòng)優(yōu)選定位于腫瘤中，并造成相對(duì)于游離藥物情況下獲得的而言藥物濃度在腫瘤中有數(shù)倍的升高(15，39)。A.肽-脂質(zhì)體多柔比星的制備和施用肽-脂質(zhì)體多柔比星的制備規(guī)程已有記載(8)。簡(jiǎn)言之，以11.5的摩爾比將肽偶聯(lián)至NHS-PEG-DSPE[N-羥基琥珀酰亞胺羧基-PEG(分子量3400)衍生的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(NOFCorporation,Tokyo,Japan)]。用肽氨基末端的游離胺基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)以產(chǎn)生肽基-PEG-DSPE并通過(guò)用三硝基苯磺酸鹽試劑(Sigma-Aldrich，SaintLouis,MO,USA)對(duì)殘余氨基定量加以確認(rèn)。在高于脂雙層轉(zhuǎn)變溫度的溫度共溫育后將肽基-PEG-DSPE轉(zhuǎn)移至預(yù)形成的PEG化脂質(zhì)體多柔比星。將5xl06個(gè)Mahlavu細(xì)胞從背兩側(cè)皮下(s.c.)注射入SCID小鼠(4-6周齡)。然后將攜帶腫瘤的小鼠(IOOmm3)隨機(jī)分成四組(每組6只小鼠)供不同的處理A:SP94-Lipo-Dox(SP94-LD)；B=Con-P-Lipo-Dox(CP-LD)；C=Lipo-Dox(LD)和D=PBS0處理通過(guò)尾靜脈注射施行，每周兩次lmg/kg，連續(xù)四周，總劑量為8mg/kg。在另一實(shí)驗(yàn)中，如所述將攜帶較大Mahlavu衍生異種移植物(550mm3)的小鼠分成四組。處理通過(guò)尾靜脈注射施行，每周一次5mg/kg，連續(xù)兩周，總劑量為10mg/kg。用電子秤和卡規(guī)測(cè)量體重和腫瘤大小。用公式計(jì)算腫瘤體積長(zhǎng)度x(寬度)2x0.52。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取出每只小鼠的腫瘤組織和內(nèi)臟器官，然后用3%甲醛固定并用OCT包埋供進(jìn)一步的組織病理學(xué)檢查。動(dòng)物的照料依照臺(tái)灣科學(xué)院的指導(dǎo)進(jìn)行。在處理結(jié)束時(shí)(第28天)，Con-P-Lipo-Dox和Lipo-Dox組的腫瘤大小比SP94-Lipo-Dox組的大1.5倍。對(duì)照PBS組的腫瘤大小比SP94-Lipo_Dox組的大3.3倍。(P<0.01)(圖4A)。此外，接受SP94-Lipo-DoX的攜帶腫瘤小鼠組被發(fā)現(xiàn)具有較低的腫瘤重量，相較于Con-P-Lipo-Dox和Lipo-Dox處理組中的腫瘤重量而言有大約40%的抑制(P<0.01)(圖4B)。圖中的誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，而P值是通過(guò)Student氏t檢驗(yàn)計(jì)算的。1.總WBC計(jì)數(shù)自下顎靜脈取血并與15%EDTA溶液溫和混合以防止凝結(jié)。然后加入含2%乙酸和龍膽紫(Sigma-Aldrich,SaintLouis,MO,USA)的RBC裂解緩沖液并在室溫溫育。用血球計(jì)計(jì)算總WBC。為了評(píng)估全身遞送化療藥物的副作用，測(cè)定了總WBC計(jì)數(shù)。結(jié)果揭示了SP94-Lipo-Dox處理組(1.9x107mm3)的總WBC計(jì)數(shù)高于Con-P-Lipo-Dox(1.6x107mm3)和Lipo-Dox(1.6x107mm3)處理組的，但低于PBS組(2.6x107mm3)的(圖4C)。在每個(gè)處理組中體重?zé)o顯著改變(圖4D)。圖中的誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，而P值是通過(guò)Student氏t檢驗(yàn)計(jì)算的。V.實(shí)施例5肽-脂質(zhì)體多柔比星療法中的組織病理學(xué)檢查、腫瘤血管和凋亡細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)A.TUNEL染色將冷凍的腫瘤組織切片與末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺刻末端標(biāo)記(TUNEL)反應(yīng)混合物(RocheDiagnostic,Grenzacherstrasse,Basel,CHE)一起在37O溫育1小時(shí)。將載玻片用Hoechst33258(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)復(fù)染色并用封固介質(zhì)(VectorLaboratories,Burlingame,CA,USA)封固。然后在熒光顯微鏡下觀察載玻片。B.CD31染色將冷凍的腫瘤組織切片用甲醇-丙酮(11)固定，用PBS清洗并浸入封閉緩沖液(含1%BSA的PBS)中隨后與大鼠抗小鼠CD31(BDPharmingen,SanDiego,CA,USA)一起溫育。切片用PBSTai(含0.1%Tween-20的PBS)清洗，然后與家兔抗大鼠抗體(Stressgen,AnnArbor,MI,USA)一起溫育并浸入羅丹明標(biāo)記的山羊抗家兔抗體(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA,USA)中。將載玻片用Hoechst33258復(fù)染色，用封固介質(zhì)封固并在熒光顯微鏡下觀察。在用H&E染色后檢查每個(gè)處理組中腫瘤組織的組織病理學(xué)。SP94-Lipo-DoX處理的異種移植物的整個(gè)切片中存在顯著的散布的壞死/凋亡區(qū)域，而在Lip0-D0X和Con-P-Lipo-Dox處理的異種移植物中發(fā)現(xiàn)了中度的壞死/凋亡區(qū)域。PBS處理組顯示了正常的HCC細(xì)胞(圖5A)。SP94-Lipo-Dox(SP94-LD)處理的異種移植物的整個(gè)切片顯示出顯著的散布的壞死/凋亡區(qū)域，而Con-P-Lipo-Dox(CP-LD)和Lipo-Dox(LD)異種移植物揭示出中等的壞死/凋亡區(qū)域，而PBS組顯示出正常的HCC細(xì)胞(標(biāo)尺上方組圖500μm和下方組圖50μm)。用TUNEL標(biāo)記所述切片以顯現(xiàn)凋亡的腫瘤細(xì)胞(綠色)。與Con-P-Lipo-Dox和Lipo-Dox組相比，TUNEL陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞在SP94-Lipo_Dox處理組中分布更均勻。在PBS處理組中未發(fā)現(xiàn)凋亡的腫瘤細(xì)胞(標(biāo)尺，100μm)。(圖5B)。用TUNEL來(lái)鑒定凋亡的腫瘤細(xì)胞并用抗⑶31抗體來(lái)檢測(cè)腫瘤血管。腫瘤的代表性顯微視野顯示在SP94-Lipo-DoX處理組中比在Con-P-Lipo-Dox和Lipo-Dox處理組中有更多的凋亡腫瘤細(xì)胞(圖5B)和較低的血管密度(圖5C)。將切片用抗⑶31抗體染色以顯現(xiàn)腫瘤血管(紅色)并用H33258復(fù)染色(藍(lán)色)(標(biāo)尺，100μm)。(圖5C)。在低放大倍數(shù)確定CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞的面積(η=6)，在低放大倍數(shù)確定CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞的面積(η=6)。與于PBS組的相比，CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞面積在Lipo-Dox和Con-P-Lipo-Dox處理組中顯著減少(η=6，Ρ<0.05)。與Con-P-Lipo-Dox和Lipo-Dox組相比，CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞面積在SP94-Lipo_Dox處理組中有更多的減少(η=6，Ρ<0.001)(圖5D)。在PBS處理組中發(fā)現(xiàn)了高腫瘤血管密度及無(wú)凋亡細(xì)胞(圖5Β和C)。圖中的誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，而P值是通過(guò)Student氏t檢驗(yàn)計(jì)算的。VI.實(shí)施例6用于治療大HCC異種移植物腫瘤的肽_脂質(zhì)體多柔比星療法為了驗(yàn)證大的異種移植物是否也能對(duì)SP94-Lipo-DoX處理有響應(yīng)，將攜帶大HCC異種移植物(550mm3)的小鼠分成四組進(jìn)行不同的處理:A:SP94-Lipo-Dox(SP94-LD)；BCon-P-Lipo-Dox(CP-LD)；C=Lipo-Dox(LD)禾ΠD:PBS。在處理結(jié)束時(shí)(第14天)，Con-P-Lipo-Dox和Lipo-Dox組的腫瘤大小逐漸增加到比SP94-Lipo_Dox組的大1.3和1.2倍(分別為P=O.089，P<0.05)。對(duì)照PBS組的腫瘤大小比SP94-Lipo_Dox組的大1.9倍(P<0.05)(圖6A)。此外，接受SP94-Lipo-Dox的攜帶腫瘤的小鼠組被發(fā)現(xiàn)具有比Con-P-Lipo-Dox,Lipo-Dox和PBS組低的腫瘤重量。Con-P-Lipo-Dox、Lipo-Dox和PBS組的腫瘤重量分別增加到比SP94-Lipo-Dox組的大1.3,1.2和2.1倍(P<0.05)(圖6B)。此外還在第10天分析總WBC計(jì)數(shù)并且顯示出SP94-Lipo-DoX處理組(11.8xl03/mm3)的總WBC計(jì)數(shù)高于Con-P-Lipo-Dox(8.8xl03/mm3)和Lipo-Dox(8.2xl03/mm3)處理組的，但低于PBS組(13.9x10Vmm3)的(圖6C)。通過(guò)H&E染色來(lái)檢查每個(gè)處理組中腫瘤組織的組織病理學(xué)。SP94-Lipo-DoX處理的異種移植物的整個(gè)切片中存在顯著的壞死/凋亡區(qū)域，而在Lipo-Dox和Con-P-Lipo-Dox處理的異種移植物中發(fā)現(xiàn)中度的壞死/凋亡區(qū)域，而PBS組顯示了正常的HCC細(xì)胞(圖6E)。在低放大倍數(shù)確定來(lái)自每個(gè)處理組的腫瘤組織中⑶31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞的面積(η=6)。⑶31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞面積在Lipo-Dox和Con-P-Lipo-Dox處理組中相較于PBS組而言有輕微減少。然而，CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞面積在SP94-Lipo-Dox處理組中相較于Con-P-Lipo-Dox和Lipo-Dox組而言有顯著的減少(η=6，P<0.001)(圖6D)。(標(biāo)尺上部組圖500μm和下部組圖50μm)。圖中的誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，而P值是通過(guò)Student氏t檢驗(yàn)計(jì)算的。此處討論的出版物僅因其公開(kāi)于本申請(qǐng)?zhí)峤蝗罩岸峁?。本文的任何?nèi)容都不能解釋為承認(rèn)本公開(kāi)沒(méi)有資格因發(fā)明在先而早于所述出版物。此處任何出版物的引用并非承認(rèn)所述參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。此外，提供的出版日期可能不同于實(shí)際的出版日期，這可能需要獨(dú)立確認(rèn)。X.實(shí)施例7:PC88和PC94在結(jié)合方面的比較進(jìn)行FACS分析以比較PC88和PC94的結(jié)合活性。將Mahlavu細(xì)胞分別與lxlO9、5x109、7.5X109和IXIOiqTU—起溫育，并使用實(shí)施例2中所述規(guī)程通過(guò)FACS分析各個(gè)噬菌體克隆的表面結(jié)合活性。PC94的Mahlavu細(xì)胞結(jié)合活性好于PC88的(圖7)。Con-噬菌體表示對(duì)照噬菌體。XI.實(shí)施例8:PC88和PC94的體內(nèi)腫瘤歸巢比較在SCID小鼠中比較了PC88和PC94的腫瘤歸巢能力。給攜帶HCC異種移植物的SCID小鼠i.v.注射PC88、PC94和對(duì)照輔助噬菌體，并如實(shí)施例3所述在灌注后回收噬菌體。在LB/IPTG/X-Gal平板上測(cè)定自腫瘤、對(duì)照器官諸如腦、心和肺回收的噬菌體的滴度。PC94的腫瘤規(guī)程能力好于PC88的(圖8)。VII.出版物1.Thomas,Μ.B.,andZhu,Α.Χ.(2005)Hepatocellularcarcinoma；theneedforprogress.JClinOncol23，2892-2899.2.Farazi,P.A.,andDePinho,R.A.(2OO6)Heρa(bǔ)tοce11u1arcarcinomapathogenesis:fromgenestoenvironment.NatRevCancer6,674-687.3.Jemal,A.,Murray,Τ.,Ward,Ε.,Samuels,A.,Tiwari,R.C.,Ghafoor,A.,Feuer,E.J.,andThun,M.J.(2005)Cancerstatistics,2005.CACancerJClin55,10-30.4.Bosslet,K.,Straub,R.,Blumrich,Μ.,Czech,J.,Gerken,Μ.,Sperker,B.,Kroemer,H.K.,Gesson,J.P.,Koch,Μ.,andMonneret,C.(1998)Elucidationofthemechanismenablingtumorselectiveprodrugmonotherapy.CancerRes58,1195-1201.5.Allen,Τ.Μ.,andCullis,P.R.(2004)Drugdeliverysystemsenteringthemainstream.Science303,1818-1822.6.Allen,Τ.Μ.,Mumbengegwi,D.R.,andCharrois,G.J.(200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SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDNO14,SEQIDNO16,SEQIDNO:18、SEQIDNO20,SEQIDNO22,SEQIDNO24,SEQIDNO26,SEQIDNO:28禾口SEQIDNO30的序列。3.權(quán)利要求2的多肽，其中的多肽包含SEQIDNO2或其變體。4.權(quán)利要求3的多肽，其中的多肽包含SEQIDNO:2。5.包含第一多肽與第二多肽融合的融合蛋白，其中的第一多肽包含權(quán)利要求2的多肽。6.權(quán)利要求2的多肽，其中的多肽與一種或更多種藥物偶聯(lián)。7.權(quán)利要求6的多肽，其中的一種或更多種藥物選自多柔比星、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、帕利他塞、勒托替康、寡核苷酸、毒素、抗-VEGF適體以及放射性分子。8.與權(quán)利要求2之多肽結(jié)合的抗體。9.包含權(quán)利要求2之至少一種多肽的脂質(zhì)體。10.權(quán)利要求9的脂質(zhì)體，其中的多肽包含SEQIDNO:2或其變體。11.權(quán)利要求10的脂質(zhì)體，其中的多肽包含SEQIDNO:2。12.權(quán)利要求11的脂質(zhì)體，其中的脂質(zhì)體進(jìn)一步包含選自多柔比星、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、帕利他塞、勒托替康、寡核苷酸、毒素、抗-VEGF適體以及放射性分子的至少一種藥物。13.權(quán)利要求12的脂質(zhì)體，其中的藥物是多柔比星。14.治療哺乳動(dòng)物中的疾病的方法，包括對(duì)需要治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求6之多肽。15.權(quán)利要求14的方法，其中的哺乳動(dòng)物是人。16.治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，包括對(duì)需要治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體含有一種或更多種藥物和包含權(quán)利要求2之一種或更多種多肽的多肽。17.權(quán)利要求16的方法，其中的脂質(zhì)體含有包含SEQIDNO:2或其變體的多肽。18.權(quán)利要求17的方法，其中的脂質(zhì)體含有包含SEQIDNO:2的多肽。19.權(quán)利要求16的方法，其中所說(shuō)的一種或更多種化學(xué)治療藥物選自多柔比星、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春新堿、帕利他塞、勒托替康、寡核苷酸、毒素、抗-VEGF適體以及放射性分子。20.權(quán)利要求19的方法，其中的化學(xué)治療藥物是多柔比星。21.權(quán)利要求16的方法，其中的疾病是癌癥。22.權(quán)利要求21的方法，其中的癌癥是肝癌。23.權(quán)利要求22的方法，其中的肝癌是肝細(xì)胞癌。24.權(quán)利要求16的方法，其中的哺乳動(dòng)物是人。25.用于檢測(cè)標(biāo)本中肝癌的方法，包括a)在允許權(quán)利要求2之多肽結(jié)合肝癌細(xì)胞的條件下使標(biāo)本接觸所述多肽；并b)用權(quán)利要求8之抗體檢測(cè)所述多肽的結(jié)合。226.用于檢測(cè)標(biāo)本中肝癌的方法，包括a)在允許權(quán)利要求5之融合蛋白結(jié)合肝癌細(xì)胞的條件下使標(biāo)本接觸所述融合蛋白；并b)用特異針對(duì)所述融合多肽某表位的抗體檢測(cè)該融合蛋白。27.鑒定與權(quán)利要求2之多肽結(jié)合的分子的方法，包括a)在允許包含權(quán)利要求2之多肽及分子的復(fù)合物形成的條件下使細(xì)胞提取物與所述多肽接觸；并b)對(duì)復(fù)合物進(jìn)行分析以鑒定所述分子。28.在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與權(quán)利要求1之多核苷酸的互補(bǔ)物雜交的多核苷酸。29.由權(quán)利要求28之多核苷酸編碼的多肽。30.用于在受試者中檢測(cè)癌癥的方法，包括對(duì)受試者施用權(quán)利要求2之多肽并檢測(cè)所述多肽與受試者身體中癌癥的結(jié)合，其中所說(shuō)的多肽包含標(biāo)記物。31.權(quán)利要求30的方法，其中的標(biāo)記物包含放射性分子。32.權(quán)利要求30的方法，其中的受試者是人。全文摘要肝細(xì)胞癌(HCC)是全世界癌癥致死的第四位原因。隨著對(duì)分子腫瘤學(xué)認(rèn)識(shí)的增加，新的治療策略一直在不斷的被研發(fā)以治愈此疾病。在此，本發(fā)明利用噬菌體展示來(lái)鑒定新的肽，包括(SP94)，它特異性的結(jié)合HCC細(xì)胞。在體外，噬菌體克隆PC94結(jié)合HCC細(xì)胞系。在體內(nèi)，PC94特異性的歸巢至攜帶人HCC異種移植物的SCID小鼠的腫瘤組織而不歸巢至其正常的內(nèi)臟器官。這種歸巢能力可被合成肽SP94競(jìng)爭(zhēng)性的抑制。PC94定位于腫瘤組織但在SP94競(jìng)爭(zhēng)的腫瘤組織或正常器官中則檢測(cè)不到。此外，PC94識(shí)別來(lái)自HCC患者的外科標(biāo)本中的腫瘤組織但不識(shí)別其中的非腫瘤組織，陽(yáng)性率為61.3％(19/31)。隨著SP94和脂質(zhì)體多柔比星的偶聯(lián)，靶向藥物遞送系統(tǒng)通過(guò)增強(qiáng)腫瘤凋亡和降低腫瘤血管發(fā)生而提高了針對(duì)HCC異種移植物的治療效力。本發(fā)明的結(jié)果指示SP94能改善晚期HCC患者的系統(tǒng)性治療。文檔編號(hào)A61K9/127GK101918433SQ200880124743公開(kāi)日2010年12月15日申請(qǐng)日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日發(fā)明者吳漢忠,林欽塘,阿爾伯特·洛申請(qǐng)人:中央研究院