一個(gè)具F-box結(jié)構(gòu)域的基因TaFBK1及其表達(dá)載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開(kāi)了一個(gè)具F-b〇X結(jié)構(gòu)域的基因TaFBKI及其表達(dá)載 體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥（TriticumaestivumL.)是世界上種植面積最大的糧食作物，也是我國(guó) 重要的糧食作物，小麥的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)關(guān)系著我國(guó)的糧食安全。小麥條銹病是由小麥條銹菌 (Pucciniastriiformisf.sp.tritic)侵染引起的氣傳性真菌病害，其發(fā)生部位主要是葉 片，其次為葉鞘和莖，穗部穎殼和芒上亦可發(fā)生。小麥條銹病分布非常廣泛，世界上主要的 產(chǎn)麥國(guó)家如美國(guó)、中國(guó)、印度、俄羅斯、加拿大、巴基斯坦、澳大利亞以及西歐一些國(guó)家，小麥 條銹病都是重要的病害，可以說(shuō)有小麥栽培的地方均有小麥條銹病的發(fā)生。
[0003] 在我國(guó)，小麥條銹病主要發(fā)生在西北、華北和西南各省、自治區(qū)。該病害常造成小 麥嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至顆粒無(wú)收。建國(guó)以來(lái)，我國(guó)曾發(fā)生16次中等規(guī)模、10次較大規(guī)模的小麥條 銹病流行，尤其是1950、1964、1990和2002年的大流行，分別導(dǎo)致小麥損失產(chǎn)量達(dá)60、32、 26. 5和13億公斤，2005年更是波及全國(guó)14個(gè)省區(qū)，發(fā)生面積達(dá)5700多萬(wàn)畝。由于小麥條 銹病嚴(yán)重威脅著小麥高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)且具有流行頻率高、爆發(fā)性強(qiáng)、傳播速度快、發(fā)生范圍廣、 預(yù)防難度大等特點(diǎn)，因此加強(qiáng)小麥條銹病抗病新基因的挖掘利用以及抗病遺傳基礎(chǔ)的理論 研究，選育抗條銹病品種，從而有效防治小麥條銹病大面積流行刻不容緩。
[0004] 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所利用四倍體圓錐小麥與二倍體簇毛麥雜交，再與普 通小麥回交多代后，選育出了普通小麥-簇毛麥易位系92R137,自1994年進(jìn)入國(guó)內(nèi)育種 利用以來(lái)，在四川、云南、陜西等條銹病常發(fā)區(qū)進(jìn)行了多年種植，對(duì)條銹病表現(xiàn)出了穩(wěn)定的 高度抗性，尤其是對(duì)小麥條銹菌優(yōu)勢(shì)小種條中29、30、32表現(xiàn)高抗-免疫。遺傳分析表明， 92R137中的抗性由單基因控制，并呈顯性遺傳，該基因來(lái)自圓錐小麥，被國(guó)際小麥基因命名 委員會(huì)命名為Yr26。
[0005]Yr26是一個(gè)具有重要應(yīng)用價(jià)值的抗條銹病基因資源，成功克隆該基因或其抗病 途徑中的某些關(guān)鍵基因，則可以為利用轉(zhuǎn)基因手段培育出抗條銹病轉(zhuǎn)基因小麥新品種奠定 堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本發(fā)明利用小麥基因芯片技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組水平上了解小麥與條銹菌互作的基因 表達(dá)特征，從中篩選了一個(gè)含Yr26材料中特異上調(diào)表達(dá)的基因TaFBKI，將該基因轉(zhuǎn)入感條 銹病小麥品種揚(yáng)麥158中使基因超量表達(dá)，可顯著提高小麥的條銹病抗性。本發(fā)明提供的 TaFBKI基因超量表達(dá)載體為開(kāi)展抗條銹病小麥基因工程育種提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種具F-box結(jié)構(gòu)域的基因 TaFBKI的表達(dá)載體和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008]具F-box結(jié)構(gòu)域的基因TaFBKI來(lái)自普通小麥（Triticum asetivumL.) 92R137,其 核苷酸序列為SEQIDNO. 1。
[0009] 該具F-box結(jié)構(gòu)域的基因的蛋白質(zhì)為T(mén)aFBKl，其氨基酸序列為SEQIDNO. 2。
[0010] 含有所述的具F-box結(jié)構(gòu)域的基因TaFBKl的重組表達(dá)載體。
[0011] 所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選以PBI220為出發(fā)載體，將TaFBKl基因插入pBI220的 Smal和Kpnl酶切位點(diǎn)間所得。
[0012] 所述的含具F-box結(jié)構(gòu)域的基因TaFBKl的表達(dá)載體在構(gòu)建抗條銹病小麥品種中 的應(yīng)用。
[0013] 有益效果
[0014] 本發(fā)明從小麥中克隆得到了一個(gè)具F-b〇X結(jié)構(gòu)域的基因TaFBKl及其所編碼的蛋 白質(zhì)TaFBKl，該基因在含有抗條銹病基因Yr26的小麥92R137中受條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)，而在 不含有抗條銹病基因Yr26的小麥揚(yáng)麥158中不受條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)。將其插入表達(dá)載體 PBI220,得到的該基因的過(guò)量表達(dá)載體導(dǎo)入感病小麥品種中，可以提高感條銹病小麥品種 對(duì)條銹病的抗性。TaFBKl用于基因工程育種，將其導(dǎo)入易感條銹病小麥品種中，能夠提高小 麥的條銹病抗性。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1利用Q-PCR分析TaFBKl在抗條銹病92R137和感條銹病揚(yáng)麥158中的表達(dá)橫 坐標(biāo)0、6、12、24、48、72表示條銹菌誘導(dǎo)0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的 小麥葉片樣品。
[0016] 圖2TaFBKl超量表達(dá)載體的構(gòu)建
[0017]A:植物表達(dá)載體pBI220;B:pBI220:TaFBKl表達(dá)載體
[0018] 圖3PBi220:TaFBKl部分轉(zhuǎn)基因植株T0代PCR分子鑒定
[0019] 1-12:轉(zhuǎn)基因植株（2, 5,9,12為陽(yáng)性植株，其余為陰性植株），13:水對(duì)照，14:質(zhì) 粒對(duì)照，15:揚(yáng)麥158對(duì)照，M:DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量
[0020] 圖4TaFBKl轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158的I；代陽(yáng)性植株的條銹病抗性鑒定
[0021]A:T1_28株系中分離的部分抗性單株的抗性鑒定
[0022] 1 :抗病對(duì)照 92R137,2 :1\-28-1，3 :1\-28-2,4 :1\-28-3,5 :感病對(duì)照揚(yáng)麥 158
[0023]B:T1_30株系中分離的部分抗性單株抗性鑒定
[0024] 1:抗病對(duì)照 92R137,2 :Tl-30-l，3 :Tl-30-2,4 :Tl-30-3,5:感病對(duì)照揚(yáng)麥 158
【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1 92R137中受條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)的具F-box結(jié)構(gòu)域基因TaFBKl的克隆
[0026] 92R137是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)用四倍體圓錐小麥（Triticumturgitum)與二倍體簇毛 麥（Haynaldiavillosa)雜交后的雙二倍體再與六倍體普通小麥多次回交后創(chuàng)造出的易位 系(Chen,P.D. ,Qi,L.L. ,Zhou,B. ,S.Z.Zhang,D.J.Liu. 1995Developmentandmolecular cytogeneticanalysisofwheat-Haynaldiavillosa6VS/6ALtranslocationlines specifyingresistancetopowderymildew.TAG, (91): 1125-1128. )。92R137 的IB染色 體上含有抗小麥條銹病基因Yr26,該基因?qū)?qiáng)毒性小種條中29、31、32等優(yōu)勢(shì)小種的抗性 達(dá)至丨J高抗-免疫水平（ChunmeiWang,YipingZhang,DejunHan,ZhenshengKang,Guiping Li，AizhongCao,PeiduChen.SSRandSTSmarkersforwheatstriperustresistance geneYr26.Euphytica，2008, 159:359-366.)。
[0027] 為了克隆Yr26抗病途徑中的抗病相關(guān)基因，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中，采用基因芯 片雜交法篩選抗條銹病小麥92R137與感條銹病小麥揚(yáng)麥158中的差異表達(dá)基因。具體流 程如下：將抗條銹病小麥92R137的種子和感條銹病小麥揚(yáng)麥158的種子播于培養(yǎng)皿中發(fā) 芽，露白后移栽到盆缽，一葉期把從感條銹病小麥材料上搜集的條銹菌孢子接種到苗上進(jìn) 行誘導(dǎo)，并于接種后12和36小時(shí)取樣，分別提取RNA(用Invitrogen公司的Trizol試劑 提取），形成兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組R12 (92R137誘導(dǎo)12小時(shí)的樣品）、R36 (92R137誘導(dǎo)36小時(shí)的樣 品）和兩個(gè)對(duì)照組S12 (揚(yáng)麥158誘導(dǎo)12小時(shí)的樣品）、S36 (揚(yáng)麥158誘導(dǎo)36小時(shí)的樣 品）。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和兩個(gè)對(duì)照組的RNA樣品分別用Superscript?II反轉(zhuǎn)錄成cDNA(試劑 盒購(gòu)自Gibco/BRL,Gaithersburg,MD,USA)，并進(jìn)一步在體外轉(zhuǎn)錄成cRNA。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和2 個(gè)對(duì)照組的cRNA樣品分別與四張小麥表達(dá)譜芯片GeneChip(Affymetrix小麥基因表達(dá)譜 芯片，partnumber900515)雜交，芯片雜交實(shí)驗(yàn)在"上海國(guó)家生物芯片工程中心"完成，實(shí) 驗(yàn)步驟參照Affymetrix公司說(shuō)明書(shū)"ExpressedAnalysisTechnicalManual"（http:// www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx)。以芯片上 實(shí)驗(yàn)組雜交信號(hào)與對(duì)照組雜交信號(hào)的比值大于2為標(biāo)準(zhǔn)，篩選抗條銹病材料92R137中的上 調(diào)表達(dá)基因。其中一個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)門(mén)a. 14847.l.Al_at，該基因是一個(gè)具有F-box結(jié)構(gòu) 域的基因，并且在實(shí)驗(yàn)組R12與對(duì)照組S12的相比以及在實(shí)驗(yàn)組R36與對(duì)照組S36相比，該 基因都存在差異表達(dá)，所以初步判斷該