專利名稱：基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的白血病小鼠模型及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ras突變體及AMLl-ETO融合基因共轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞移植建立白血病小鼠模型及其制備方法。
背景技術(shù)：
急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML),是一種骨髓造血前體細(xì)胞異常增殖的血液惡性腫瘤，是白血病的一種。其特點(diǎn)是骨髓中不成熟白血球劇增，使得骨髓無法制造健康的血細(xì)胞。AML是成年人最常見的急性白血病，其發(fā)病率隨著人的年齡而增加。AML可以是原發(fā)性的，也可能是因?yàn)榉派渚€暴露、致癌化學(xué)藥物暴露造成。目前治療方法主要以化療法殺死惡性增殖的癌細(xì)胞為主，為了更好的為治療提供新的策略，建立和人AML 盡量接近的動(dòng)物模型并以此研究確切的發(fā)病機(jī)制尤為迫切。小鼠在遺傳學(xué)與造血系統(tǒng)等方面和人類十分相似，因此建立小鼠白血病模型以研究人類白血病的細(xì)胞分子生物學(xué)特性、生化免疫特征、病理生理改變、發(fā)病機(jī)制以及藥物治療和預(yù)后具有重要意義。較為常用的C57BL小鼠對(duì)白血病因子較敏感，而對(duì)化學(xué)致癌物誘導(dǎo)作用敏感性低，但全身經(jīng)放射線照射后，淋巴瘤發(fā)生率可達(dá)90% 100%。因此C57BL小鼠在評(píng)價(jià)特定基因或者基因突變?cè)诎籽“l(fā)生中的作用尤其適合。通過全身輻照后，結(jié)合骨髓移植的方法修改供體骨髓中的基因，使外源的基因得以表達(dá)并在后續(xù)觀察其在白血病發(fā)病過程中的功能是新近出現(xiàn)的一種快速而便捷的探索新的基因和突變?cè)贏ML發(fā)病中的方法，已經(jīng)有報(bào)道成功的利用這個(gè)策略研究了例如N-ras，c-KIT等基因的突變對(duì)于AML的影響。國內(nèi)外的研究報(bào)道表明，N-raSei2D突變比例高與白血病發(fā)病有較強(qiáng)的相關(guān)性，通過骨髓重建的小鼠模型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)N-ra#1211突變確實(shí)可以顯著的促進(jìn)AML疾病發(fā)生及嚴(yán)重程度。K-ras基因是Ras家族的另一個(gè)重要成員，它與N_ras基因具有極高的同源性，并且有報(bào)道發(fā)現(xiàn)AML病人中也存在K-raSei2D突變，這個(gè)突變發(fā)生的比例接近前者，但在AML發(fā)生中K-rasG12D突變對(duì)于疾病的發(fā)生具有怎樣的影響目前尚無報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的白血病小鼠模型，本發(fā)明的另一目的是提供該白血病小鼠模型的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，提供一種通過對(duì)于K-ras基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，經(jīng)過病毒包裝后導(dǎo)入小鼠骨髓細(xì)胞中，而后與轉(zhuǎn)染AMLl-ETO融合基因的骨髓細(xì)胞應(yīng)用尾靜脈注射的方法共同移植建立白血病小鼠模型的方法注入C57BL小鼠體內(nèi)，建立一種白血病小鼠模型。本發(fā)明提供了一種白血病小鼠模型的制備方法，包括以下步驟一、K-ras突變體及AMLl-ETO融合基因慢病毒載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)K-ras突變引物如下
引物名稱引物序到所含位點(diǎn)
K_Ras /J 正向 S^-CTGGCTAGCATGACTGAATATAAACwriTriGTAGTTGGANhe j GCTf；.4 JGGCGTAGGCAAGAGTGCCTT-3' (SEQ ID NO: I)
K-Rssm2aIxΙ } S'-ACAGCGGCCGCTTACATAATTACACACTTTGTCTTTGAC Not l
人TTCTTTT-3， (SEQ ID NO: 2)通過PCR擴(kuò)增目的基因，回收、酶切、連接至慢病毒載體P⑶H-CMV-MCS-EFI-copGFP，進(jìn)一步完成克隆篩選，測(cè)序正確后重新培養(yǎng)含有陽性目的克隆的菌液，提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆?；以Addgene公司購買的AML1-ET0融合基因的質(zhì)粒為模板，引物設(shè)計(jì)如下
引物名稱引物序列所含泣點(diǎn)
AML1/ET0 [Hft 5\GATTCTAGAWGCCTGATCGTACTGAGAAGCA-y (SEQ ID NO: 3)xbaI
AML1/ET0 反_ 5'-CTAGCGGCCGCCTAGCGAGGGGTTGTCTCTAT6G-3JNod
(SEQ ID NO: 4)PCR 產(chǎn)生 AMLl-ETO (AML1/ET0)基因(基因序列參見文獻(xiàn)Chou FS, WunderlichM,Griesinger A,MulIoy JC : N-Ras(G12D)induces features of stepwisetransformation in preleukemic human umbilical cord blood cultures expressingthe AML1-ET0 fusion gene. Blood 2011，117 (7) : 2237-2240.)，將擴(kuò)增的目的基因亞克隆至 pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP 病毒載體。二、K-ras突變體及AML1-ET0融合基因慢病毒載體的包裝接種細(xì)胞16-20小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞接近飽和時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將293T細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，病毒稀釋用培養(yǎng)液為polybrene和2%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基。第一天，細(xì)胞胰酶消化計(jì)數(shù)后，按照每孔8000細(xì)胞接種96孔板，37°C培養(yǎng)過夜，感染時(shí)細(xì)胞長至30 50%的融合密度；第二天，當(dāng)天轉(zhuǎn)染時(shí)，將病毒液用含有8ug/ml polybrene和2%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，然后小心吸去96孔板中的培養(yǎng)基，輕輕混勻各管慢病毒稀釋液，各取IOOul加入每孔細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度兩個(gè)重復(fù)，放入37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；第三天，去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入IOOul的完全培養(yǎng)基；第五、六天，在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細(xì)胞數(shù)量，病毒滴度為表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。三、骨髓細(xì)胞分離及病毒感染情況監(jiān)測(cè)斷頸處死小鼠，游離出小鼠的兩條下肢，剝離肌肉，剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔。用無菌注射器輕輕插入骨髓腔，對(duì)準(zhǔn)一個(gè)無菌15ml離心管，將細(xì)胞沖出，然后離心，去上清O離心沉淀下來的細(xì)胞用PBS沖洗，計(jì)數(shù)細(xì)胞，并計(jì)算所需細(xì)胞體積數(shù)鋪板培養(yǎng)并接種于6孔板中。每孔加入K-ras突變體與AML1-ET0融合基因慢病毒的病毒懸液I 2ml，感染8h后離心收集細(xì)胞去上清，一部分種于96孔板中加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，其它部分用于小鼠骨髓移植用。96孔板中的細(xì)胞在培養(yǎng)24 48h后用熒光顯微鏡觀察并拍照。
四、感染細(xì)胞植入小鼠建立白血病動(dòng)物模型取8周的C57小鼠，先服用一周含有抗生素的水后進(jìn)行SGy輻照量的處理，輻照后部分小鼠尾靜脈注射O. 5 I X IO6小鼠骨髓細(xì)胞/只。本發(fā)明還提供了上述方法建立的一種白血病小鼠模型。本發(fā)明制備得到的一種白血病小鼠模型的性能鑒定I、骨髓細(xì)胞分型鑒定利用c-KIT，Gr-I，Mic-I的抗體對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析其各組陽性細(xì)胞的比例，從而確定AML的惡性程度，結(jié)果顯示存在大量GFP7c-Kit+/MaC-l7Gr-1_細(xì)胞，表明模型小鼠具有AML細(xì)胞分化比例的顯著表征。 2、分子水平鑒定對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行了 QPCR鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型小鼠的骨髓細(xì)胞中仍然具有前述的外轉(zhuǎn)K-ras基因，這說明K-ras基因具有較高的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。3、蛋白水平的鑒定進(jìn)一步的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，以上各種蛋白在模型小鼠骨髓中一直處于高表達(dá)狀態(tài)。4、外周血細(xì)胞分型鑒定進(jìn)一步對(duì)外周血中的惡性腫瘤細(xì)胞的情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在外周血的圖片中，經(jīng)過Wright-Giemsa染色后,發(fā)現(xiàn)存在許多早幼粒白血病細(xì)胞,這一特點(diǎn)與臨床白血病的發(fā)生具有較強(qiáng)的相似性。本發(fā)明首次先采用尾靜脈注射導(dǎo)入人工定點(diǎn)突變K-ras突變體骨髓細(xì)胞的方式建立白血病小鼠模型的方法，且制備的白血病小鼠模型成功率高，病理特征與臨床白血病的發(fā)病狀況相似性高，本發(fā)明建立的白血病小鼠模型可以為白血病發(fā)病機(jī)理的研究，特別是白血病髓外浸潤機(jī)制研究；新藥的快速研發(fā)，特別是白血病藥物的篩選；基因和分子靶向治療提供新的動(dòng)物模型。


圖I :突變Ras基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及序列驗(yàn)證(構(gòu)建的突變載體經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證突變位點(diǎn)的正確性)圖2 :突變K-ras基因逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠骨髓細(xì)胞熒光成像圖3 :骨髓重建小鼠疾病發(fā)病情況檢測(cè)(對(duì)發(fā)病過程中的部分小鼠(AMLl-ETO+K-ras)脾臟，淋巴結(jié)，外周血中GFP陽性細(xì)胞比率檢測(cè))圖4 :模型小鼠白血病相關(guān)細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)指標(biāo)分析其中A、利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同組的骨髓移植小鼠骨髓中外源基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析、利用western blot技術(shù)檢測(cè)不同組的骨髓移植小鼠骨髓中外源基因蛋白表達(dá)水平分析；C、流式細(xì)胞術(shù)分析部分小鼠(AMLl-ETO+K-ras)骨髓細(xì)胞表面Mac_l，c-KIT,Gr-l等蛋白表達(dá)情況；D、血細(xì)胞及骨髓細(xì)胞涂片Wright-Giemsa染色檢測(cè)早幼粒白血病細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的實(shí)施并不僅限于此。實(shí)施例I :基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的白血病小鼠模型及其制備方法，包括以下技術(shù)步驟lK-ras突變體及AMLl-ETO融合基因慢病毒載體的構(gòu)建I. lK-ras突變體融合基因慢病毒載體的構(gòu)建通過檢索Genbank獲得K_ras基因的編碼序列(NM_004985)，同時(shí)結(jié)合查閱文獻(xiàn)，確定其突變位點(diǎn)信息，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物如下
權(quán)利要求
1.一種基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的白血病小鼠模型的制備方法，包括以下步驟:A、K-ras突變體及AMLl-ETO融合基因慢病毒載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)K-ras突變引物如下 K-Rasc1211正向引物序列如SEQ ID NO: I所示， K-RasG12D反向引物序列如SEQ ID N0:2所示， 通過PCR擴(kuò)增目的基因，回收、酶切、連接至慢病毒載體P⑶H-CMV-MCS-EFI-copGFP，進(jìn)一步完成克隆篩選，測(cè)序正確后重新培養(yǎng)含有陽性目的克隆的菌液，提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆茫? 以Addgene公司購買的AMLl-ETO融合基因的質(zhì)粒為模板,引物設(shè)計(jì)如下 AMLl-ETO正向引物序列如SEQ ID N0:3所示， AMLl-ETO反向引物序列如SEQ ID N0:4所示， PCR產(chǎn)生AMLl-ETO基因，將擴(kuò)增的目的基因亞克隆至pCDH-CMV-MCS-EFl_copGFP病毒載體； B、K-ras突變體及AMLl-ETO融合基因慢病毒載體的包裝 接種細(xì)胞16-20小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞接近飽和時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將293T細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，病毒稀釋用培養(yǎng)液為polybrene和2%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基。第一天，細(xì)胞胰酶消化計(jì)數(shù)后，按照每孔8000細(xì)胞接種96孔板，37°C培養(yǎng)過夜，感染時(shí)細(xì)胞長至30 50%的融合密度；第二天，當(dāng)天轉(zhuǎn)染時(shí)，將病毒液用含有8ug/ml polybrene和2%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，然后小心吸去96孔板中的培養(yǎng)基，輕輕混勻各管慢病毒稀釋液，各取IOOul加入每孔細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度兩個(gè)重復(fù)，放入37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；第三天，去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入IOOul的完全培養(yǎng)基；第五、六天，在突光顯微鏡下觀察各孔中突光細(xì)胞數(shù)量，病毒滴度為表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)； C、骨髓細(xì)胞分離及病毒感染情況監(jiān)測(cè) 斷頸處死小鼠，游離出小鼠的兩條下肢，剝離肌肉，剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔，用無菌注射器輕輕插入骨髓腔，對(duì)準(zhǔn)一個(gè)無菌15ml離心管，將細(xì)胞沖出，然后離心，去上清； 離心沉淀下來的細(xì)胞用PBS沖洗，計(jì)數(shù)細(xì)胞，并計(jì)算所需細(xì)胞體積數(shù)鋪板培養(yǎng)并接種于6孔板中，每孔加入K-ras突變體與AMLl-ETO融合基因慢病毒的病毒懸液I 2ml，感染8h后離心收集細(xì)胞去上清，一部分種于96孔板中加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，其它部分用于小鼠骨髓移植用，96孔板中的細(xì)胞在培養(yǎng)24 48h后用熒光顯微鏡觀察并拍照； D、感染細(xì)胞植入小鼠建立白血病動(dòng)物模型 取8周的C57小鼠，先服用一周含有抗生素的水后進(jìn)行SGy輻照量的處理，輻照后部分小鼠尾靜脈注射O. 5 I X IO6小鼠骨髓細(xì)胞/只。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的白血病小鼠模型的制備方法制備得到的一種白血病小鼠模型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白血病小鼠模型，其特征在于，該白血病小鼠模型具有以下性能 A、骨髓細(xì)胞分型鑒定 利用c-KIT，Gr-1, Mic-I的抗體對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析其各組陽性細(xì)胞的比例，從而確定AML的惡性程度，結(jié)果顯示存在大量GFP7c-Kit+/MaC-l7Gr-1_細(xì)胞，表明模型小鼠具有AML細(xì)胞分化比例的顯著表征； B、分子水平鑒定 對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行了 QPCR鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型小鼠的骨髓細(xì)胞中仍然具有前述的外轉(zhuǎn)K-ras基因，這說明K-ras基因具有較高的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物； C、蛋白水平的鑒定 進(jìn)一步的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，以上各種蛋白在模型小鼠骨髓中一直處于高表達(dá)狀態(tài)； D、外周血細(xì)胞分型鑒定 對(duì)外周血中的惡性腫瘤細(xì)胞的情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在外周血的圖片中，經(jīng)過Wright-Giemsa染色后，發(fā)現(xiàn)存在許多早幼粒白血病細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)移植建立白血病小鼠模型及其制備方法。本發(fā)明提供了一種白血病小鼠模型的制備方法，包括以下步驟一、進(jìn)行K-ras突變體與AML1-ETO融合基因慢病毒載體構(gòu)建與包裝；二、骨髓細(xì)胞分離及病毒感染情況監(jiān)測(cè)；三、感染細(xì)胞植入小鼠建立白血病動(dòng)物模型；四、模型鑒定。本發(fā)明率先采用了尾靜脈注射導(dǎo)入人工定點(diǎn)突變K-ras突變體與AML1-ETO融合基因共轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞的方式建立白血病小鼠模型的方法，本發(fā)明提供的白血病小鼠模型，成功率高，病理特征與臨床白血病的發(fā)病狀況相似性高，可以為白血病髓外浸潤機(jī)制研究，白血病藥物篩選，基因和分子靶向治療提供新的動(dòng)物模型。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102864172SQ20121039113
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者崔淑芳, 湯球, 趙善民, 劉志學(xué), 余琛琳, 孫偉, 蔡麗萍, 徐晨, 袁衛(wèi) 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)