專利名稱：一種分離純化9－硝基喜樹(shù)堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物化學(xué)分離技術(shù)，具體涉及一種吸附-層析色譜法分離純化9-硝基喜樹(shù)堿粗品并制備高純度9-硝基喜樹(shù)堿的方法。
背景技術(shù)：
喜樹(shù)堿(camptothecin)是存在于珙桐科旱蓮屬落葉喬木喜樹(shù)(Camptothecaacuminata)的根，皮，莖和種子中的生物堿。1966年wall等人從喜樹(shù)莖中提取分離出該生物堿，在體外對(duì)小鼠白血病及瓦克癌試驗(yàn)，顯示出較強(qiáng)抗癌活性，進(jìn)而引起了人們的極大關(guān)注。美國(guó)，日本，加拿大和英國(guó)等國(guó)家積極投入喜樹(shù)堿及其類似物的開(kāi)發(fā)，合成了數(shù)百個(gè)衍生物進(jìn)行生化篩選。不少藥物已經(jīng)或即將進(jìn)行臨床研究。喜樹(shù)堿成為繼紫杉醇之后的第二個(gè)由植物提取物衍生的重要抗癌藥物?，F(xiàn)在無(wú)論從實(shí)際應(yīng)用上，還是新藥研制上，喜樹(shù)堿類抗癌藥都是國(guó)際上最熱門(mén)的抗癌藥物之一。
9-硝基喜樹(shù)堿在治療某些類型的癌癥如胰腺癌中已顯示出重大應(yīng)用前景。
9-硝基喜樹(shù)堿是以喜樹(shù)中分離的喜樹(shù)堿為原料經(jīng)硝化反應(yīng)而得。喜樹(shù)堿為五環(huán)稠合體系，稠合的苯環(huán)9位和12位電荷較大，因而在硝化過(guò)程中主要產(chǎn)物是9-硝基喜樹(shù)堿和12-硝基喜樹(shù)堿。由于12-硝基喜樹(shù)堿同9-硝基喜樹(shù)堿結(jié)構(gòu)相近，且在粗品中12-硝基喜樹(shù)堿含量較9-硝基喜樹(shù)堿含量高，因此，分離除去沒(méi)有藥物活性的12-硝基喜樹(shù)堿并制備出高純度的適合藥用的9-硝基喜樹(shù)堿化合物成為十分具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。
日本專利59-51288提供一種用稍微過(guò)量的濃硝酸在濃硫酸中處理喜樹(shù)堿來(lái)制備9-硝基喜樹(shù)堿的方法。但是，使用該方法時(shí)，得到可用于醫(yī)藥用途的9-硝基喜樹(shù)堿收率僅約3％到7％。分離和提純9-硝基喜樹(shù)堿的方法耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用大。
世界專利WO 09907709A中進(jìn)一步嘗試提高9-硝基喜樹(shù)堿的收率并尋找合適的分離方法。通過(guò)選擇一種或幾種無(wú)機(jī)硝酸鹽和酸進(jìn)行硝化反應(yīng)可以使純的9-硝基喜樹(shù)堿的收率穩(wěn)定在20±1％。雖然無(wú)機(jī)鹽硝化法的產(chǎn)率稍高，但其用到的無(wú)機(jī)重金屬硝酸鹽如硝酸鉈等有劇毒，會(huì)加大后續(xù)分離過(guò)程的難度。喜樹(shù)堿硝化后的反應(yīng)液倒入冰水中，然后以二氯甲烷萃取硝化后的混酸液，以水對(duì)二氯甲烷萃取液進(jìn)行反萃取。9-硝基喜樹(shù)堿粗品用氯仿/甲醇溶解后以硅藻土吸附，加到硅膠柱上，以氯仿/甲醇淋洗液洗脫得到9-硝基喜樹(shù)堿單體和混合物。該工藝過(guò)程中的粗品提純過(guò)程中因萃取需消耗大量溶劑，工藝過(guò)程繁瑣且不易放大，工藝中采用的溶劑二氯甲烷和三氯甲烷均為國(guó)家藥典限用溶劑，操作環(huán)境較惡劣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種工藝操作簡(jiǎn)單，溶劑和淋洗液可循環(huán)套用，環(huán)境友好，便于較大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的制備提純9-硝基喜樹(shù)堿精制品的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的方案是1).喜樹(shù)堿經(jīng)濃硫酸/硝酸硝化后，制得喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液。
2).喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂吸附，以低碳醇類，低碳酮類洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑得9-硝基喜樹(shù)堿粗品。
3).將9-硝基喜樹(shù)堿粗品以硅膠層析法色譜分離純化，以正己烷，乙酸乙酯為淋洗劑，依次以a)正己烷；b)正己烷∶乙酸乙酯＝2∶(1～2)混合液；c)正己烷∶乙酸乙酯＝2∶(2～3)混合液；d)乙酸乙酯(100％)進(jìn)行梯度淋洗，分段收集淋洗液。
4).分段收集的淋洗液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑，濃縮物經(jīng)減壓真空干燥，得純度99.5％以上9-硝基喜樹(shù)堿。
本發(fā)明所述的分離純化9-硝基喜樹(shù)堿的方法工藝簡(jiǎn)單，溶劑淋洗劑可回收套用，成本低，純化過(guò)程無(wú)污染，符合環(huán)保要求。


圖1為工藝流程圖；圖2為9-硝基喜樹(shù)堿粗品的高壓液相色譜圖；
圖3為9-硝基喜樹(shù)堿純品的核磁共振氫譜圖；圖4為9-硝基喜樹(shù)堿純品的高壓液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中的喜樹(shù)堿原料為市售90％-99％的產(chǎn)品。硫酸、硝酸、正己烷、乙酸乙酯、丙酮均為分析純，水為去離子水。高壓液相色譜分析用乙腈、水均為色譜純，色譜儀為HP/Agilent 1100型，色譜柱為HP/Agilent4.6×100mmC18柱，3.5μm。大孔吸附樹(shù)脂為市售上海華震科技有限公司產(chǎn)品，如骨架結(jié)構(gòu)為苯乙烯-二乙烯苯的產(chǎn)品HZ802、HZ803、HZ816、1300、1400，或骨架結(jié)構(gòu)為丙烯酸酯-二乙烯苯的產(chǎn)品HZ841等。層析用硅膠為青島海洋化工有限公司產(chǎn)品。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海貝凱科技有限公司產(chǎn)品，XT-4雙目顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀為北京泰克儀器有限公司產(chǎn)品，美國(guó)VARRIAN 300MHZ核磁共振儀。
通過(guò)對(duì)下述實(shí)施例可以幫助對(duì)本發(fā)明的理解，而不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例12000ml的燒瓶中加入濃硫酸1500ml，置于冰-鹽浴中冷卻至內(nèi)溫-5℃。攪拌下分批加入喜樹(shù)堿的粉末5克(0.0143mole)，反應(yīng)液為橙紅色。待溶解完全后，攪拌下緩緩滴入濃硝酸4.5ml(65％～68％)，半小時(shí)加完，反應(yīng)液變?yōu)楹谏?。加畢?5℃下攪拌-小時(shí)，然后慢慢升溫至室溫，攪拌72小時(shí)后停止反應(yīng)。將反應(yīng)液倒入2000克冰水中，得喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液備用。
將處理好的大孔吸附樹(shù)脂HZ-802約300克(按照離子交換樹(shù)脂和吸附樹(shù)脂的常規(guī)處理方法處理)裝入直徑為5cm，長(zhǎng)度為60cm的玻璃柱中，下端為聚四氟乙烯活塞。活塞上端的沙芯為2號(hào)沙芯。將上述產(chǎn)物得混酸液室溫下通入玻璃柱中，約3小時(shí)通完，水洗，以乙醇洗脫得9-硝基喜樹(shù)堿粗品洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干溶劑得9-硝基喜樹(shù)堿粗品5.1克，經(jīng)高壓液相色譜檢驗(yàn)純度為30％(見(jiàn)圖2)。
將9-硝基喜樹(shù)堿粗品吸附于硅藻土20克上，取500克100-200目的層析硅膠裝填入直徑為5cm，長(zhǎng)度60cm的玻璃柱中，依次用a)500ml的正己烷；b)1000ml正己烷∶乙酸乙酯為2∶1的混合液；c)500ml正己烷乙酸乙酯為1∶1的混合液；d)500ml的乙酸乙酯淋洗，得a，b，c，d四種淋洗液，分別通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干溶劑，其中b部分淋洗液可得黃色粉末約1.1克，其熔點(diǎn)為275.5-277℃，從核磁共振氫譜圖譜(見(jiàn)圖3)可見(jiàn)，同世界專利WO 09907709A的數(shù)據(jù)一致，1HNMR(CDCl3，300Hz)，1.05(3H，t)，1.92(2H，m)，5.40(2H，s)，5.55(2H，dd)，7.70(1H，s)，7.95(1H，t)，8.48(1H，d)，8.53(1H，d)，9.36(1H，s)。高壓液相色譜檢驗(yàn)9-硝基喜樹(shù)堿純度為99.6％的(見(jiàn)圖4)c部分為含有少量的9-硝基喜樹(shù)堿的混合物可用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干溶劑后重新過(guò)柱分離，a，d組分均不含9-硝基喜樹(shù)堿，可用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑。
實(shí)施例2按與實(shí)施例1相同的方法制得喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液，采用大孔吸附樹(shù)脂為HZ-816，洗脫液為丙酮。硅膠層析分離硅膠采用200-400目層析硅膠，淋洗液配比改為a)500ml的正己烷；b)1000ml正己烷∶乙酸乙酯為4∶3的混合液；c)500ml正己烷∶乙酸乙酯為2∶3的混合液；d)500ml的乙酸乙酯淋洗，其他按與實(shí)施例1相同的設(shè)備和工藝步驟操作，b部分淋洗液經(jīng)減壓蒸餾可得黃色粉末1.2克，其熔點(diǎn)為275.5-277℃，高壓液相色譜檢驗(yàn)純度為99.7％。
實(shí)施例3按與實(shí)施例1相同的方法制得喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液，采用大孔吸附樹(shù)脂為HZ-841，洗脫液為甲醇。硅膠層析分離的淋洗液配比改為a)500ml的正己烷；b)1000ml正己烷∶乙酸乙酯為6∶5的混合液；c)500ml正己烷∶乙酸乙酯為2∶3的混合液；d)500ml的乙酸乙酯淋洗，其他按與實(shí)施例1相同的設(shè)備和工藝步驟操作，b部分淋洗液經(jīng)減壓蒸餾可得黃色粉末1.3克，其熔點(diǎn)為275.5-277℃，高壓液相色譜檢驗(yàn)純度為99.6％。
實(shí)施例4按與實(shí)施例1相同的方法制得喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液，采用大孔吸附樹(shù)脂為HZ-803，洗脫液為丙醇。其他按與實(shí)施例1相同的設(shè)備和工藝步驟操作，b部分淋洗液經(jīng)減壓蒸餾可得黃色粉末1.1克，其熔點(diǎn)為275.5-277℃，高壓液相色譜檢驗(yàn)純度為99.7％。
實(shí)施例5按與實(shí)施例1相同的方法制得喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液，采用大孔吸附樹(shù)脂為1300，洗脫液為丁酮。其他按與實(shí)施例1相同的設(shè)備和工藝步驟操作，b部分淋洗液經(jīng)減壓蒸餾可得黃色粉末1.2克，其熔點(diǎn)為275.5-277℃，高壓液相色譜檢驗(yàn)純度為99.6％。
實(shí)施例6按與實(shí)施例1相同的方法制得喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液，采用大孔吸附樹(shù)脂為1400，洗脫液為丙酮。其他按與實(shí)施例1相同的設(shè)備和工藝步驟操作，b部分淋洗液經(jīng)減壓蒸餾可得黃色粉末1.0克，其熔點(diǎn)為275.5-277℃，高壓液相色譜檢驗(yàn)純度為99.5％。
權(quán)利要求
1.一種分離純化9-硝基喜樹(shù)堿的方法，包括喜樹(shù)堿經(jīng)濃硫酸/硝酸硝化后，制得喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液，然后進(jìn)行吸附-層析分離，其特征在于1).喜樹(shù)堿硝化產(chǎn)物的混酸液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂吸附，以低碳醇類，低碳酮類洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干溶劑得到9-硝基喜樹(shù)堿粗品；2).將9-硝基喜樹(shù)堿粗品以硅膠層析法色譜分離純化，以正己烷，乙酸乙酯為淋洗劑，依次以a)正己烷；b)正己烷∶乙酸乙酯＝2∶(1～2)混合液；c)正己烷∶乙酸乙酯＝2∶(2～3)混合液；d)乙酸乙酯(100％)進(jìn)行梯度淋洗，分段收集淋洗液；3).所述的淋洗液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑，濃縮物經(jīng)減壓真空干燥，得純度99.5％以上9-硝基喜樹(shù)堿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化9-硝基喜樹(shù)堿的方法，其特征在于所述的大孔吸附樹(shù)脂的骨架結(jié)構(gòu)為苯乙烯-二乙烯苯或丙烯酸酯-二乙烯苯共聚物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化9-硝基喜樹(shù)堿的方法，其特征在于所述低碳醇類為甲醇、乙醇、丙醇，低碳酮類為丙酮、丁酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化9-硝基喜樹(shù)堿的方法，其特征在于所述硅膠層析法中色譜柱中填充的層析硅膠，規(guī)格為100～400目，硅膠柱上端以硅藻土吸附9-硝基喜樹(shù)堿粗品。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離純化9-硝基喜樹(shù)堿的方法，其特征在于所述苯乙烯-二乙烯苯骨架結(jié)構(gòu)的大孔吸附樹(shù)脂是HZ802、HZ-803、HZ-816、1300、1400中的一種，丙烯酸酯-二乙烯苯骨架結(jié)構(gòu)的大孔吸附樹(shù)脂是HZ-841。
全文摘要
本發(fā)明是一種分離純化9－硝基喜樹(shù)堿的方法。喜樹(shù)堿經(jīng)濃硫酸/硝酸硝化后，含粗產(chǎn)物的酸液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂吸附，解吸得9－硝基喜樹(shù)堿粗品。含量在10－40％的9－硝基喜樹(shù)堿上樣的層析硅膠填充的色譜柱層析分離，以低毒的正己烷，乙酸乙酯及其混合液為淋洗劑，梯度洗脫分離純化得9－硝基喜樹(shù)堿精制品。淋洗后的淋洗液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，再經(jīng)減壓真空干燥后可獲得99.5％－99.9％的9－硝基喜樹(shù)堿。該方法工藝簡(jiǎn)單，溶劑淋洗劑可回收套用，成本低，純化過(guò)程無(wú)污染，符合環(huán)保要求。
文檔編號(hào)C07D221/00GK1760195SQ20051002349
公開(kāi)日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2005年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月21日
發(fā)明者徐環(huán)昕, 寧方紅, 陳駿, 趙延斌, 莊思永, 劉坐鎮(zhèn) 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué), 上海華震科技有限公司