本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)pedv的m+n雙基因的真核表達(dá)載體。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉(ped)由豬流行性腹瀉病毒(pedv)引起豬群嘔吐、腹瀉、脫水及死亡為特征的消化道病毒性疾病。該病于1971年首次在英國報(bào)道，我國在1984年證實(shí)該病在的存在。自2010年下半年以來，由于傳統(tǒng)的pedv在基因上發(fā)生了缺失、插入及變異，導(dǎo)致該病對(duì)豬群的致病性增強(qiáng)，造成了大量的豬群發(fā)病死亡，損失慘重。目前世界上大多數(shù)養(yǎng)豬國家都有發(fā)生變異pedv的報(bào)道，尤其以中國、韓國、日本、泰國和美國等國家發(fā)病嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。pedv的基因組長大約在28000bp左右，主要含有4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為s、m、n及e蛋白。目前，已見通過pedv的單個(gè)基因如n、s及m基因段片，通過原核表達(dá)方法表達(dá)出單基因蛋白，但未見通過pedv的m和n基因片段，利用blunt-m2哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體，通過無縫拼接技術(shù)，構(gòu)建出表達(dá)pedv的m+n的雙基因真核表達(dá)載體。因此，一種表達(dá)pedv的m+n雙基因的真核表達(dá)載體的方法的建立，對(duì)今后開展該病或其他病原的診斷技術(shù)及基因工程疫苗的研究，具有重要意義和應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種表達(dá)pedv的m+n雙基因的真核表達(dá)載體的制備方法，以及由該制備方法制備的載體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供轉(zhuǎn)染了真核表達(dá)載體的重組工程細(xì)胞。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供使用了真核表達(dá)載體的融合蛋白的制備方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先提供了一種表達(dá)pedv的m+n雙基因的真核表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)根據(jù)pedv的m、n基因及peasy-blunt-m2表達(dá)載體基因的片段序列，設(shè)計(jì)與合成特異性引物；

(2)以pedv的cdna為模板，通過pcr技術(shù)分別擴(kuò)增出m與n基因片段，并進(jìn)行回收純化，將純化的m基因片段連接到peasy-blunt-m2表達(dá)載體上，構(gòu)建出m+blunt-m2質(zhì)粒；

(3)以m+blunt-m2質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增質(zhì)粒的基因片段，回收純化m+blunt-m2基因片段；

(4)采用peasy-uniseamlesscloningandassemblykit，通過無縫克隆技術(shù)將m+blunt-m2基因與n基因片段進(jìn)行重組連接，將連接產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化至trans1-t1感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氨芐青霉素抗性的lb培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，提取m+blunt-m2+n質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，得到表達(dá)pedv的m+n雙基因的真核表達(dá)載體。

所述pedv優(yōu)選變異豬流行性腹瀉病毒。

其中步驟(1)所述特異性引物序列如下：

a、m

m-f:atgtctaacggttttattcc

m-r:gactaaatgaagcactttct

b、m2+m

m2+m-f:aagggcgatccggaacaa

m-r:gactaaatgaagcactttct

c、n

n-f:agaaagtgcttcatttagtcgcttctgtcagctttcaggatcg

n-r:ttgttccggatcgcccttatttcctgtatcgaagatctcgttg。

其中步驟(2)在構(gòu)建m+blunt-m2質(zhì)粒時(shí)，peasy-blunt-m2表達(dá)載體與m基因片段的摩爾濃度比為1:7，反應(yīng)時(shí)間按連接片段大小進(jìn)行，片段長度在0.1-1kb時(shí)，反應(yīng)時(shí)間在5-10分鐘，片段長度在1-2kb時(shí)反應(yīng)時(shí)間在10-15分鐘，片段長度在2-3kb時(shí)反應(yīng)時(shí)間在15-20分鐘，大于3kb時(shí)反應(yīng)時(shí)間在20-30分鐘。

優(yōu)選地，在步驟(3)得到的回收產(chǎn)物中加入dmt酶，降解模板。

其次，本發(fā)明提供了由所述制備方法制備的表達(dá)pedv的m+n雙基因的真核表達(dá)載體。

另外，本發(fā)明還提供了利用所述的表達(dá)pedv的m+n雙基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的重組工程細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述工程細(xì)胞為293t細(xì)胞。

最后，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)pedv的m+n雙基因融合蛋白的制備方法，所述方法包括：培養(yǎng)所述的重組工程細(xì)胞，并提取融合蛋白。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明是直接將純化pedv的m基因片段連接到blunt-m2哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體中，不需要連接至單克隆載體pmd19-t中，然后m+blunt-m2質(zhì)粒通過同源重組技術(shù)，無縫拼接n基因片段，從而獲得m+n雙基因融合表達(dá)載體，其質(zhì)粒通過pcr技術(shù)進(jìn)行鑒定，測序準(zhǔn)確后再轉(zhuǎn)染在細(xì)胞中獲得成功表達(dá)。因此，該真核表達(dá)載體的制備比較其他真核表達(dá)技術(shù)，具有操作步驟簡單、反應(yīng)時(shí)間短等特點(diǎn)，適合雙基因融合蛋白表達(dá)。

附圖說明

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

圖1為擴(kuò)增m片段電泳圖，箭頭標(biāo)識(shí)的為目的片段678bp。

圖2為m2-m陽性克隆鑒定結(jié)果，箭頭標(biāo)識(shí)的為目的帶834bp(m片段加部分載體序列)。

圖3為m+m2和n片段分別pcr擴(kuò)增結(jié)果，其中1表示n目的帶1326bp，2表示m+m2目的帶6104bp。

圖4為n片段pcr擴(kuò)增結(jié)果,其中1表示n目的帶1326bp。

圖5為m+m2和n片段無縫拼接的菌落pcr鑒定結(jié)果，其中9、10表示m+n目的片段2004bp。

圖6為293t轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后細(xì)胞生長狀態(tài)圖；其中a:無轉(zhuǎn)染的293t，b:轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒(m2)的293t，c:轉(zhuǎn)染構(gòu)建質(zhì)粒(m+m2+n)的293t。

圖7為m+n雙基因融合目的蛋白wb圖，箭頭為表達(dá)的目的蛋白，分子量75kd左右；其中1：轉(zhuǎn)染空載的293t細(xì)胞總蛋白的檢測結(jié)果，2：轉(zhuǎn)染構(gòu)建質(zhì)粒的293t細(xì)胞總蛋白檢測結(jié)果，3：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的293t細(xì)胞總蛋白檢測結(jié)果，m:westernmarker(25-90kda)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)前需要克服以下技術(shù)難題：

(1)引物設(shè)計(jì)，要根據(jù)所表達(dá)基因及blunt-m2載體的基因序列，結(jié)合同源重組原理，設(shè)計(jì)與和合成引物。

(2)目的片段與blunt-m2載體反應(yīng)連接時(shí)，最好把握載體與片段的摩爾濃度比為1:7，反應(yīng)時(shí)間按連接片段大小進(jìn)行把握，比如片段長度在0.1-1kb時(shí)，反應(yīng)時(shí)間在5-10分鐘，1-2kb時(shí)反應(yīng)時(shí)間在10-15分鐘，2-3kb時(shí)反應(yīng)時(shí)間在15-20分鐘，大于3kb時(shí)反應(yīng)時(shí)間在20-30分鐘。

(3)2個(gè)基因進(jìn)行無縫拼接時(shí)，第一個(gè)基因片段與m2載體構(gòu)建后的重組載體，需進(jìn)行pcr后回收純化重組目的片段，變成了線性載體，最好在回收產(chǎn)物中加入dmt酶降解質(zhì)粒模板，再與第2個(gè)目的片段根據(jù)同源臂部分進(jìn)行同源重組。

生物材料來源：peasy-bluntm2表達(dá)載體、peasy-uniseamlesscloningandassemblykit均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

一、根據(jù)genbank中公開的的豬流行性腹瀉病毒(pedv)的m和n基因及blunt-m2+m質(zhì)粒序列，設(shè)計(jì)合成相關(guān)擴(kuò)增引物，序列如下表1。

表1引物序列

二、rt反應(yīng)：以pedv(該病毒株來源于2013年福建某規(guī)模豬場發(fā)生pedv的哺乳小豬的小腸，將小腸用pbs液研磨，吸取上清，采用商品化試劑盒提取rna)的rna為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cdna,其體系如下表2。

表2反轉(zhuǎn)錄體系

反應(yīng)條件：25℃10min；50℃30min；85℃5s。

三、m片段的pcr擴(kuò)增：以cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下表3。

表3m片段的pcr擴(kuò)增體系

反應(yīng)條件如下：

通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物，獲得目的片段，如圖1。

四、m基因片段連接至m2載體

1、連接體系如下：2.0μlm片段，1.0μlblunt-m2載體，使用ddh2o補(bǔ)齊體積至5.0μl,25℃連接10min；

2、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至trans1-t1感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30min；

3、42℃熱激30s，立即置于冰上2min；

4、加入平衡至室溫的lb培養(yǎng)基，250rpm，37℃培養(yǎng)1h；

5、4000rpm離心1min，棄掉部分上清，保留100μl，輕彈重懸后涂于amp+抗性平板上，37℃培養(yǎng)過夜；

6、分別挑單克隆菌株至10μl無菌水中，渦旋混勻后進(jìn)行pcr鑒定，獲得目的片段如圖2。反應(yīng)體系如下表4。

表4pcr反應(yīng)體系

反應(yīng)條件如下：

7、取陽性菌落送測序公司測序，之后進(jìn)行序列比對(duì)，取比對(duì)目的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得線性載體。

五、m+m2片段的pcr擴(kuò)增，

以m+m2質(zhì)粒為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下表5。

表5擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系如下，使用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物，獲得目的條帶如圖3。

六、n片段的pcr擴(kuò)增

以pedv的cdna為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下表6。

表6擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系如下,使用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物,獲得目的片段如圖4。

七、純化片段

分別膠回收純化pcr擴(kuò)增的n片段和pcr擴(kuò)增的m+m2片段，采用純化試劑盒進(jìn)行純化。

八、無縫拼接

1.以peasy-uniseamlesscloningandassemblykit推薦體系進(jìn)行重組反應(yīng)，連接體系如下：2×assemblymix5μl；純化回收n片段2μl；純化回收m2+m片段3μl；于pcr儀中50℃連接15min；

2.連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化trans1-t1感受態(tài)細(xì)胞中；

3.42℃熱激30s，冰上靜置2min，加入400μllb培養(yǎng)基中，37℃200rpm搖菌1h；

4.取搖好的菌液4000rpm離心1min后棄部分上清，取菌株吹懸后涂于含amp+抗性的lb平板上，在37℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜；

5.18h后從培養(yǎng)箱中取出平板，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化后生長的感受態(tài)，提取質(zhì)粒進(jìn)行pcr獲得目的片段如圖5；

6.陽性克隆搖菌后測序，同源性在99％以上，說明拼接重組準(zhǔn)確。

九、大提質(zhì)粒

取測序正確m+m2+n的活菌經(jīng)過活化后轉(zhuǎn)接入lb氨芐抗性培養(yǎng)基，放入搖床37℃、200rpm培養(yǎng)16h后，收集菌液提取質(zhì)粒。

十、轉(zhuǎn)染

(1)細(xì)胞接種

將293t細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)平皿中，培養(yǎng)12-24h，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到70％匯合度；

(2)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的稀釋

經(jīng)去內(nèi)毒素m+m2+n質(zhì)粒和m2空載質(zhì)粒，質(zhì)粒稀釋于50μlopti-mem培養(yǎng)基中，transinel轉(zhuǎn)染試劑加入量為16μl，將轉(zhuǎn)染試劑加入上述含有稀釋質(zhì)粒的opti-mem培養(yǎng)基中，輕柔混勻室溫靜置20min；

(3)轉(zhuǎn)染

分別將只加培養(yǎng)基、含空載質(zhì)粒-transinel轉(zhuǎn)染試劑混合物和含m+m2+n質(zhì)粒-transinel轉(zhuǎn)染試劑混合物加入細(xì)胞，于37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4h后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)至48h后，如圖6所示，細(xì)胞沒有出現(xiàn)萎縮脫落，說明細(xì)胞生長狀態(tài)良好，不會(huì)影響蛋白的表達(dá)，然后提取細(xì)胞總蛋白。

十一、wb驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)情況

細(xì)胞總蛋白提取

收集構(gòu)建質(zhì)粒(m+m2+n)和空載質(zhì)粒(m2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，分別提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度為3.6mg/ml。

使用分離膠濃度為10％的膠進(jìn)行sds-page電泳，上樣品為12ug,200v恒壓電泳45min。

轉(zhuǎn)膜：使用pvdf膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，100v恒壓轉(zhuǎn)膜1h。

封閉：使用5％的脫脂牛奶(0.5％tbst稀釋)，37℃封閉2h。

一抗孵育：使用0.5％tbst稀釋一抗(pedv兔抗高免血清)，稀釋比例為1:4000，4℃過夜孵育。

洗滌：使用tbst洗滌4次，每次10min。

二抗孵育：使用0.5％tbst稀釋二抗(pedv抗兔hrp酶)，稀釋比例1:4000，室溫晃動(dòng)孵育2h。

顯色：使用tbst洗4次，每次10min，采用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行檢測。結(jié)果獲得75kd左右的目的片段如圖7，說明目的蛋白在293t細(xì)胞中得到成功表達(dá),并對(duì)pedv兔抗高免血清具有反應(yīng)，說明表達(dá)蛋白具有免疫原性。

雖然以上描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但是熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，我們所描述的具體的實(shí)施例只是說明性的，而不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍的限定，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在依照本發(fā)明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應(yīng)當(dāng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求所保護(hù)的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>表達(dá)pedv的m+n雙基因的真核表達(dá)載體

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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atgtctaacggttttattcc20

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<213>人工序列

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gactaaatgaagcactttct20

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<213>人工序列

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