專利名稱：一種提高ε-聚-L-賴氨酸產(chǎn)量的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高一株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(5^卬to附少c^s fZ/aWatoc/jramogew^)或白色鏈霉菌(5^e/ toOT少c^ a/6w/船)生產(chǎn)s-聚-L-賴氨酸產(chǎn)量的新方法， 該新方法涉及到在發(fā)酵過程中流加L-賴氨酸。
背景技術(shù)：
s-聚-L-賴氨酸是一種含有25 30個殘基的賴氨酸同聚物，它易溶于水，但不溶于乙酸乙 酯、乙醇、乙醚等有機溶劑；其熱穩(wěn)定性高，12(TC加熱10min仍具有抑菌活性。s-聚-L-賴 氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，其抑菌譜廣，在中性和微酸性條件下，對革蘭氏陽性菌、 革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌都有抑制作用，其對耐熱性芽孢桿菌和一些病毒也有抑制作用。 在一定條件下，也可使某些噬菌體明顯失活。s-聚-L-賴氨酸安全性高，在人體內(nèi)分解為賴氨 酸，而賴氨酸是人體必需的八種氨基酸之一，也是世界各國允許在食品中強化的氨基酸。FDA 于2004年1月批準日本Chisso公司的e-聚-L-賴氨酸為GRAS產(chǎn)品。因此，s-聚-L-賴氨酸是 一種理想的生物防腐劑。
到目前為止，已知巖田敏治等人在中國申請的專利(專利名稱為大量生產(chǎn)S-聚-L-賴氨 酸的菌株和生產(chǎn)方法，專利號97182253.0)是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株B21021 (FERM BP-5926)， 然后從培養(yǎng)基中分離和純化s-聚-L-賴氨酸。該菌株是通過對小白鏈霉菌lysinopolymerus亞種 U011A-1菌株(FERMBP-U09)進行誘變處理而獲得的，其對濃度為10mg/mL或更高的 AEC具有抗性。
徐虹等人申請的專利(專利名稱為利用北里孢菌PL6-3制備的方法，專利號為 200510037774.2)是以北里孢菌(iOto^tospora sp.)即CCTCC No.M205012培養(yǎng)在含有碳源、 氮源等的培養(yǎng)基上，然后通過離子交換樹脂法從發(fā)酵液中分離得到s-聚賴氨酸及其鹽。
賈士儒等申請的專利(專利名稱為回流工藝生產(chǎn)S-聚-L-賴氨酸的方法，專利號為 200610013800.2)是以從土壤中篩選所獲得的白色鏈霉菌(S/re/ /ow;^esflf/Zw/w5) [AEC、甘氨 酸和磺胺胍都具有抗性]為生產(chǎn)菌種，在發(fā)酵過程中流加提取過程的后期穿透液，然后通過離
子交換樹脂法提取得到S-聚-L-賴氨酸。
賈士儒等申請的專利(專利名稱為 一種誘變菌株白色鏈霉菌TUST2及利用該誘變菌株 生產(chǎn)s-聚賴氨酸及其鹽的方法，專利號為200710057098.4)是以在中國海南省土壤中分離 得到的TUST1為基礎(chǔ)上利用紫外誘變、紫外和化學誘變相結(jié)合，以及N離子注入等誘變方 法選育出的s-聚賴氨酸的高產(chǎn)菌株，該菌株對10mg/mL或更高濃度AEC有抗性，優(yōu)化后產(chǎn) 酸達10 30g/L。發(fā)酵液經(jīng)離心、過濾和離子交換樹脂等處理后得到分子量分布為4000 6500Da 的s-聚賴氨酸。
吳光耀申請的專利(專利名稱為 一種天然抗菌防腐劑聚賴氨酸及其制備方法，專利號為200710067250.7)是以白色鏈霉菌經(jīng)過2~4次擴大培養(yǎng)，接種于麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)液中， 然后從發(fā)酵混合物中分離得到聚賴氨酸。
L-賴氨酸是S-聚-L-賴氨酸的直接前體，但是現(xiàn)有的s-聚-L-賴氨酸的發(fā)酵工藝中，沒有關(guān)于 流加L-賴氨酸的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種與常規(guī)S-聚-L-賴氨酸生產(chǎn)方法相比，目的產(chǎn)物獲得量更高 的發(fā)酵生產(chǎn)方法。本發(fā)明所述的新方法是在發(fā)酵過程中流加L-賴氨酸，該方法較原有工藝顯 著提高了 S-聚-L-賴氨酸的生成量，降低了成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種釆用流加工藝生產(chǎn)S-聚-L-賴氨酸的新方法，該方法是在發(fā)酵過 程中間歇流加L-賴氨酸，然后從發(fā)酵液中分離得到S-聚-L-賴氨酸。 實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是
利用經(jīng)活化的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌或白色鏈霉菌菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得本發(fā)明的S-聚-L-賴氨酸。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可將斜面菌種首先進行液體種子培養(yǎng)，再以10%接種于發(fā)酵培 養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。
本發(fā)明所指出的s-聚-L-賴氨酸可在以下條件下進行培養(yǎng)。初始pH6.8 7.0、溫度25~35 °C、 好氣條件下振蕩培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)，種子培養(yǎng)15 30h;發(fā)酵時間在40 120h之間時，每2h測
定一次殘?zhí)呛?，當殘?zhí)呛啃∮?0g/L時，流加葡萄糖和(NH4)2S04，同時流加L-賴氨酸，
使發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量維持在13 g/L左右。培養(yǎng)時間約為120 h，只要在本發(fā)明的s-聚-L-賴氨酸產(chǎn)量達到最高時結(jié)束即可。經(jīng)如上所述的培養(yǎng)，主要在培養(yǎng)液中產(chǎn)生本發(fā)明的s-聚-L-賴氨酸。
如上所得的培養(yǎng)液中收集S-聚-L-賴氨酸，可按照常規(guī)方法進行。本發(fā)明獲得所述S-聚-L-
賴氨酸是將發(fā)酵液離心以除去菌體及部分固形物，具體操作是利用D152大孔弱酸性陽離子 交換樹脂對上清液進行交換吸附后洗脫，洗脫液經(jīng)D392大孔弱堿性陰離子交換樹脂脫色后， 再經(jīng)過濾、真空濃縮、干燥，得到S-聚-L-賴氨酸鹽酸鹽。
通過本發(fā)明如上的闡述，得到后面實施例的進一步驗證，得知本發(fā)明所改進的流加方案 的有效性。
通過實施本發(fā)明具體的技術(shù)指標，可以實現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容。
具體實施例方式
首先需要說明的是
1. 所用白色鏈霉菌(5^e;7to附少CM"/to/M)已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，保藏編號為CGMCCNo.1986，保藏日期分別為2007年3月23日。
2. 所用淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(5W/^函yc^ ^wtotoc/rowogeM^)已由中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.3145，保藏日期為2009年6月29日。
4以下是實施例，將對本發(fā)明作進一步說明，但是本發(fā)明并不僅限于以下實施例。 實施例1敘述的是現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝；
實施例2，實施例3及實施例4為與實施例1相對比的創(chuàng)新工藝。 實施例1:
在裝有2.7 L培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，接種300 mL淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌或白色鏈霉菌的種 子培養(yǎng)液，30 T:培養(yǎng)，待DO降至30 %時自動控制為30 %，好氣培養(yǎng)120 h，空氣流速為4.0~6.0 L/min。當pH降至6.0左右時，流加氨水(25~30%)維持pH為6.0，當發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛?降至10g/L時，通過流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04 (80g/L)使殘?zhí)菨舛冗_到13 g/L。 同時，不再控制pH，讓其自然降至4.0并維持在4.0左右。
培養(yǎng)120h，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液中最高積累s-聚-L-賴氨酸為10.7g/L。離心去除菌體及部 分固形物，利用D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂對上清液進行交換吸附后洗脫，洗脫液經(jīng) D392大孔弱堿性陰離子交換樹脂脫色后，再經(jīng)過濾，真空濃縮，旋風干燥器干燥，得到s-
聚-L-賴氨酸鹽酸鹽。
實施例2:
在裝有2.7 L培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，接種300 mL淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌或白色鏈霉菌的種 子培養(yǎng)液，30 'C培養(yǎng)，待DO降至30 %時自動控制為30 %，好氧培養(yǎng)120 h，空氣流速為4.0~6.0 L/min。當pH降至6.0左右時，流加氨水(25-30 %)維持pH為6.0，當發(fā)酵液中的殘?zhí)菨?度降至10g/L時，通過流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04 (80g/L)使殘?zhí)菨舛冗_到13 g/L， 并向發(fā)酵液中流加L-賴氨酸(10g/L)。同時，不再控制pH，讓其自然降至4.0并維持在4.0 左右。
培養(yǎng)120h，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液中最高積累s-聚-L-賴氨酸19.0g/L。離心去除菌體及部分 固形物，利用D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂對上清液進行交換吸附后洗脫，洗脫液經(jīng)D392 大孔弱堿性陰離子交換樹脂脫色后，再經(jīng)過濾，真空濃縮，旋風干燥器干燥，得到e-聚-L-賴 氨酸鹽酸鹽。
實施例3:
在裝有16.2L培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，接種1.8L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌或白色鏈霉菌的二級 搖瓶種子培養(yǎng)液，30'C培養(yǎng)，待00降至30%時自動控制為30%，好氣培養(yǎng)120h，空氣流 速為4.0~6.0 L/min。當pH降至6.0左右時，流加氨水(25~30%)維持pH為6.0，當發(fā)酵液 中的殘?zhí)菨舛冉抵?0g/L時，通過流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04 (80g/L)使殘?zhí)菨舛?達到13g/L，并向發(fā)酵液中流加L-賴氨酸(10g/L)。同時，不再控制pH，讓其自然降至4.0 并維持在4.0左右。
培養(yǎng)120h，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液中最高積累s-聚-L-賴氨酸為14.6 g/L。離心去除菌體及部 分固形物，利用D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂對上清液進行交換吸附后洗脫，洗脫液經(jīng) D392大孔弱堿性陰離子交換樹脂脫色后，再經(jīng)過濾，真空濃縮，旋風干燥器干燥，得到e-聚-L-賴氨酸鹽酸鹽。 實施例4:
在裝有16.2L培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，接種1.8L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌或白色鏈霉菌的二級 搖瓶種子培養(yǎng)液，30'C培養(yǎng)，待DO降至30。/。時自動控制為30。/。，好氣培養(yǎng)120h，空氣流 速為4.0~6.0 L/min。當pH降至6.0左右時，流加氨水(25~30%)維持pH為6.0，當發(fā)酵液 中的殘?zhí)菨舛冉抵?0g/L時，通過流加葡萄糖(400g/L)和(NH4)2S04 (80g/L)使殘?zhí)菨舛?達到13g/L，并向發(fā)酵液中流加L-賴氨酸(15g/L)。同時，不再控制pH，讓其自然降至4.0 并維持在4.0左右。
培養(yǎng)120h，結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液中最高積累s-聚-L-賴氨酸為17.6g/L。離心去除菌體及部 分固形物，利用D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂對上清液進行交換吸附后洗脫，洗脫液經(jīng) D392大孔弱堿性陰離子交換樹脂脫色后，再經(jīng)過濾，真空濃縮，旋風干燥器干燥，得到s-聚-L-賴氨酸鹽酸鹽。
權(quán)利要求
1.一種提高ε-聚-L-賴氨酸產(chǎn)量的新方法，其特征在于以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)或白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)為生產(chǎn)菌株，在發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的過程中，產(chǎn)物開始積累以后，向培養(yǎng)基中流加L-賴氨酸，達到提高產(chǎn)量的目的。這種生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的具體方法是步驟1采用從土壤中篩選所獲得的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)或白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)進行ε-聚-L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，培養(yǎng)條件為初始pH 6.8～7.0、溫度25～35℃、有氧條件下振蕩培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)，種子培養(yǎng)15～30h，發(fā)酵時間為96～120h；培養(yǎng)過程中，流加碳源和氮源的同時流加L-賴氨酸。步驟2發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心以除去菌體及部分固形物，利用陽離子交換樹脂對上清液進行交換吸附后洗脫，洗脫液經(jīng)陰離子交換樹脂脫色后，再經(jīng)過濾、真空濃縮、干燥，得到ε-聚-L-賴氨酸鹽酸鹽。
2. 如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)菌株，其特征在于白色鏈霉菌(5V^ptow;;cesa/^/iw)和淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S&eptomycMWa^加od2ramogewM)已由中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，保藏編號分別為CGMCCNo.l986和CGMCCNo.3145，保藏日期分別為2007年3月23日和2009年6月29日。
3. 如權(quán)利要求1所述的工藝生產(chǎn)s-聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于當發(fā)酵時間在40~120h之間時，每2h測定一次殘?zhí)呛?，當殘?zhí)呛啃∮?0g/L時，流加葡萄糖和(NH4hS04，同時流加L-賴氨酸，直至葡萄糖含量達到13 g/L左右。
4. 如權(quán)利要求l所述的工藝生產(chǎn)s-聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于分離提取所用的陽離子交換樹脂為D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂；所述的陰離子交換樹脂為D392大孔弱堿性陰離子交換樹脂。
5. 如權(quán)利要求1所述的工藝生產(chǎn)s-聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于流加L-賴氨酸較不流加時，s-聚-L-賴氨酸的產(chǎn)率較原有工藝提高了25 50e/。，顯著降低了成本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高ε-聚-L-賴氨酸產(chǎn)量的新方法，是采用從土壤中篩選所獲得的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)或白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)[對S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(以下簡稱AEC)、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性]，在原生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上，通過流加L-賴氨酸、葡萄糖和(NH₄)₂SO₄的混合液進行ε-聚-L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)物量比不流加L-賴氨酸的過程提高25～50％。本發(fā)明改變了原有生產(chǎn)工藝方法，顯著提高了ε-聚-L-賴氨酸的產(chǎn)率，降低了成本，可用于工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵。
文檔編號C12P13/02GK101671703SQ20091006951
公開日2010年3月17日 申請日期2009年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月1日
發(fā)明者斌 周, 琳 李, 甜 王, 王國良, 范寶慶, 莫治文, 譚之磊, 賈士儒 申請人:天津科技大學