專利名稱：15α羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其是一種15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制 備方法。
背景技術(shù)：
孕二烯酮是迄今為止孕激素活性最強(qiáng)的甾體激素類藥物，是新一代避孕藥的主 要成分之一，具有重要的醫(yī)用價(jià)值。因其孕激素活性高、無(wú)副作用、吸收快、無(wú)殘 留、避孕效果可靠及良好的抑腫瘤作用，成為目前最為理想的口服避孕藥的首選成 分。
15a-羥基左旋乙基甾烯雙酮是合成孕二烯酮的關(guān)鍵中間體，工業(yè)上主要采用化 學(xué)方法合成15a-羥基左旋乙基甾烯雙酮，該類方法步驟繁瑣，成本較高，不適于藥 物的推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用雷斯青霉催化甾體化合 物左旋乙基甾烯雙酮生成15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，該方法具 有目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高、純化過(guò)程簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是-
一種15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，步驟是
(1) 菌懸液的制備將雷斯青霉尸ew'c朋ww raf欲!'cfo7(ATCC 104卯)菌種接種于斜 面培養(yǎng)基，5天后，用無(wú)菌生理鹽水制備出菌懸液；
(2) —級(jí)種子培養(yǎng)將菌懸液接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種量10、l(^個(gè)/mL，培養(yǎng) 溫度為25-3(TC，轉(zhuǎn)速80-120r/s，培養(yǎng)時(shí)間24-96h，得到種子培養(yǎng)液；
(3) 二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)液以2-5%的接種量接入發(fā)酵罐繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵控 制條件為溫度25-30°C，轉(zhuǎn)速160-240r/min，通氣量為2L/min，菌體培養(yǎng)時(shí)間為 36-72h，得到發(fā)酵液；
(4) 底物誘導(dǎo)在己培養(yǎng)好的發(fā)酵液內(nèi)加入(U-0.3g/L的左旋乙基甾烯雙酮誘導(dǎo) 16-48h小時(shí)；
(5) 左旋乙基甾烯雙酮轉(zhuǎn)化加入底物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，采用將左旋乙基甾烯雙 酮底物用促溶劑溶解后加入發(fā)酵液的轉(zhuǎn)化方式，轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)速180-240r/min，轉(zhuǎn) 化溫度為25-3(TC，轉(zhuǎn)化時(shí)間90-150h;
3(6)萃取制備成品料液經(jīng)過(guò)濾，所得濾餅經(jīng)萃取處理，即得15a羥基化左旋乙 基甾烯雙酮。
而且，所述促溶劑包括甲醇、乙醇、丙二醇、甘油、1， 3-丁二醇、聚乙二醇、 苯甲醇二甲亞砜、二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基乙酰胺、乳酸乙酯、油酸乙酯，促 溶劑濃度1-6%。
而且，所述步驟(5)中濾餅的萃取方法是將濾餅烘干后，以與原發(fā)酵液l: 10-1: 20的體積比采用萃取劑萃取。
而且，所述萃取劑是乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、正己垸。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為
1、 本發(fā)明方法是在雷斯青霉的發(fā)酵液中，利用雷斯青霉菌體^"/ 7//"附 m/Wn'ch7(ATCC 104卯)中所含的羥化酶，催化左旋乙基甾烯雙酮的15ct位發(fā)生羥基化 反應(yīng)，生成15a-羥基左旋乙基甾烯雙酮，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件及轉(zhuǎn)化工藝，有效提高 轉(zhuǎn)化率。
2、 本發(fā)明采用的微生物轉(zhuǎn)化方法具有很高的立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選 擇性，提高了底物轉(zhuǎn)化率，在396。投料量情況下，其轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)90%以上，簡(jiǎn) 化了目標(biāo)產(chǎn)物制備與純化的過(guò)程，避免大量有機(jī)溶劑的使用，既符合環(huán)保要求，又 降低生產(chǎn)成本。
3、 本發(fā)明15a羥基左旋乙基甾烯雙酮制備過(guò)程中無(wú)需加入昂貴的金屬催化劑， 降低了生產(chǎn)成本；本方法各步驟反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化裝置簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例1:
一種15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，本實(shí)施例采用促溶劑1% 二甲基甲酰胺的15a羥化反應(yīng)，步驟是
(1) 菌懸液的制備將雷斯青霉尸em'c/〃/w/w ra/欲/cA77(ATCC 104卯)菌種接種于斜 面培養(yǎng)基，5天后，用無(wú)菌生理鹽水制備出菌懸液；
(2) —級(jí)種子培養(yǎng)將菌懸液接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種量106/mL,培養(yǎng)溫度為 28°C，轉(zhuǎn)速120r/m，培養(yǎng)時(shí)間24h，得到適合接種的種子培養(yǎng)液；
(3) 二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將生長(zhǎng)良好的種子培養(yǎng)液以2-5%的接種量接入5L發(fā)酵罐繼 續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵控制條件為溫度28°C，轉(zhuǎn)速200r/m，通氣量為2L/min，菌體培養(yǎng)時(shí) 間為48h，得到發(fā)酵液；
(4) 左旋乙基甾烯雙酮轉(zhuǎn)化36h小時(shí)內(nèi)，在已培養(yǎng)好的發(fā)酵液內(nèi)加入0.2g/L的 左旋乙基甾烯雙酮誘導(dǎo)；(5) 加入底物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方式是采用將左旋乙基甾烯雙酮底物用促溶 劑(1%的二甲基甲酰胺)溶解后加入發(fā)酵液的方式，轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)速180r/min，轉(zhuǎn) 化溫度為28t，轉(zhuǎn)化時(shí)間100h;
(6) 萃取制備成品料液經(jīng)過(guò)濾，所得濾餅經(jīng)萃取處理，萃取方法是將濾餅烘干 后，以與原發(fā)酵液l: 10-1: 20的體積比采用萃取劑萃取，萃取劑選用乙酸乙酯、 甲醇、乙醇、丙酮或正己烷，即得15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮。
分析測(cè)定轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率為80%。
實(shí)施例2:
一種15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，本實(shí)施例釆用促溶劑2% 甲醇助溶的15a羥化反應(yīng)，步驟是
(1) 菌懸液的制備將雷斯青霉Pew'c7'〃/ww ra/欣/db'/(ATCC 104卯)菌種接種于斜 面培養(yǎng)基，5天后，用無(wú)菌生理鹽水制備出菌懸液；
(2) —級(jí)種子培養(yǎng)將菌懸液接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種量108/mL，培養(yǎng)溫度為 28°C，轉(zhuǎn)速100r/m，培養(yǎng)時(shí)間36h，得到適合接種的種子培養(yǎng)液；
(3) 二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將生長(zhǎng)良好的種子培養(yǎng)液以2-5%的接種量接入5L發(fā)酵罐繼 續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵控制條件為溫度28°C，轉(zhuǎn)速220r/m，通氣量為2L/min，菌體培養(yǎng)時(shí) 間為72h，得到發(fā)酵液；
(4) 左旋乙基甾烯雙酮轉(zhuǎn)化24h小時(shí)內(nèi)，在已培養(yǎng)好的發(fā)酵液內(nèi)加入0.2§1的 左旋乙基甾烯雙酮誘導(dǎo)；
(5) 加入底物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方式是采用將左旋乙基甾烯雙酮底物用促溶 劑(2%甲醇)溶解后加入發(fā)酵液的方式，轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)速200r/min，轉(zhuǎn)化溫度為28°C, 轉(zhuǎn)化時(shí)間120h;
(6) 萃取制備成品料液經(jīng)過(guò)濾，濾餅經(jīng)萃取處理后，即得15a羥基化左旋乙基 甾烯雙酮分析測(cè)定轉(zhuǎn)化率，萃取方法同實(shí)施例l。
分析測(cè)定轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率為85%。 實(shí)施例3:
一種15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，本實(shí)施例采用促溶劑3% 丙二醇助溶的15ot羥化反應(yīng)，步驟是
(1) 菌懸液的制備將雷斯青霉尸e"/c朋ww ra/欣/cW(ATCC 104卯)菌種接種于斜 面培養(yǎng)基，5天后，用無(wú)菌生理鹽水制備出菌懸液；
(2) —級(jí)種子培養(yǎng)將菌懸液接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種量109/mL，培養(yǎng)溫度為 28°C，轉(zhuǎn)速110r/m，培養(yǎng)時(shí)間48h，得到適合接種的種子培養(yǎng)液；(3) 二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將生長(zhǎng)良好的種子培養(yǎng)液以2-5%的接種量接入5L發(fā)酵罐繼 續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵控制條件為溫度28°C，轉(zhuǎn)速160r/m，通氣量為2L/min，菌體培養(yǎng)時(shí) 間為36h，得到發(fā)酵液；(4) 左旋乙基甾烯雙酮轉(zhuǎn)化48h小時(shí)內(nèi)，在已培養(yǎng)好的發(fā)酵液內(nèi)加入0.2g/L的 左旋乙基甾烯雙酮誘導(dǎo)；(5) 加入底物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方式是采用將左旋乙基甾烯雙酮底物用促溶 劑(3%丙二醇)溶解后加入發(fā)酵液的方式，轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)速240r/min，轉(zhuǎn)化溫度為 28 °C,轉(zhuǎn)化時(shí)間150h;(6) 萃取制備成品料液經(jīng)過(guò)濾，濾餅經(jīng)萃取處理后，即得15a羥基化左旋乙基 甾烯雙酮分析測(cè)定轉(zhuǎn)化率，萃取方法同實(shí)施例l。分析測(cè)定轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率為91%。
權(quán)利要求
1、一種15α羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，其特征在于制備方法的步驟是(1)菌懸液的制備將雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌種接種于斜面培養(yǎng)基，5天后，用無(wú)菌生理鹽水制備出菌懸液；(2)一級(jí)種子培養(yǎng)將菌懸液接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種量106-109個(gè)/mL，培養(yǎng)溫度為25-30℃，轉(zhuǎn)速80-120r/s，培養(yǎng)時(shí)間24-96h，得到種子培養(yǎng)液；(3)二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)液以2-5％的接種量接入發(fā)酵罐繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵控制條件為溫度25-30℃，轉(zhuǎn)速160-240r/min，通氣量為2L/min，菌體培養(yǎng)時(shí)間為36-72h，得到發(fā)酵液；(4)底物誘導(dǎo)在已培養(yǎng)好的發(fā)酵液內(nèi)加入0.1-0.3g/L的左旋乙基甾烯雙酮誘導(dǎo)16-48h小時(shí)；(5)左旋乙基甾烯雙酮轉(zhuǎn)化加入底物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，采用將左旋乙基甾烯雙酮底物用促溶劑溶解后加入發(fā)酵液的轉(zhuǎn)化方式，轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)速180-240r/min，轉(zhuǎn)化溫度為25-30℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間90-150h；(6)萃取制備成品料液經(jīng)過(guò)濾，所得濾餅經(jīng)萃取處理，即得15α羥基化左旋乙基甾烯雙酮。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，其特征在于所述促溶劑包括甲醇、乙醇、丙二醇、甘油、1， 3-丁二醇、聚乙二醇、苯甲醇二甲亞砜、二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基乙酰胺、乳酸乙酯、油酸乙酯，促溶劑濃度1-6%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，其特征在于所述步驟(6)中濾餅的萃取方法是將濾餅烘干后，以與原發(fā)酵液l:10-1: 20的體積比采用萃取劑萃取。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的15a羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，其特征在于所述萃取劑是乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、正己垸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種15α羥基化左旋乙基甾烯雙酮的生物制備方法，步驟是(1)將雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌種接種于斜面培養(yǎng)基，制備出菌懸液；(2)一級(jí)種子培養(yǎng)；(3)二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)；(4)添加底物誘導(dǎo)；(5)進(jìn)行左旋乙基甾烯雙酮轉(zhuǎn)化；(6)萃取制備成品。本發(fā)明采用的微生物轉(zhuǎn)化方法具有很高的立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性，提高了底物轉(zhuǎn)化率，在3‰投料量情況下，其轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)90％以上，簡(jiǎn)化了目標(biāo)產(chǎn)物制備與純化的過(guò)程，避免大量有機(jī)溶劑的使用，既符合環(huán)保要求，又降低生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P33/12GK101597634SQ200910069539
公開(kāi)日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者別松濤, 杜連祥, 毛淑紅, 王春霞, 蔣彥潔, 路福平 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)