一種利用重組大腸桿菌生產l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的方法
【專利摘要】公開了一種利用重組大腸桿菌生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其中，利用重組大腸桿菌生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是指在一定pH值的水溶液中，作用于游離的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的具有氨基酸酯?；D移酶的蛋白質的基因片段重組到載體里并轉入宿主菌，得到帶有重組DNA并且使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強的宿主菌。經過以下階段(1)培養(yǎng)大量表達氨基酸酯?；D移酶的重組大腸桿菌細胞；(2)過量表達階段(1)中的氨基酸酯?；D移酶；(3)將階段(2)所得作為粗酶源，加入到含有L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽底物氨基酸的緩沖溶液中反應，實現L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的高效生產。
【專利說明】一種利用重組大腸桿菌生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法

【技術領域】
[0001] -種利用重組大腸桿菌生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，屬于微生物基因工程 領域。

【背景技術】
[0002] 谷氨酰胺（Gln)作為特別的免疫營養(yǎng)素成為各領域的研宄熱點，尤其在機體應激 狀態(tài)下對維護免疫功能的完整性和維護腸道結構是無法替代的。因此，認為谷氨酰胺是應 激狀態(tài)下的"條件必需氨基酸"。但谷氨酰胺水溶性差（36g/L)，在水溶液、熱消毒及長期儲 存時化學穩(wěn)定性不足，在加熱滅菌的條件下會生成有毒的焦谷氨酸和氨，而含有L-谷氨酰 胺的小肽，具有高熱穩(wěn)定性和水溶性，彌補了 L-谷氨酰胺的不足，擴大了其在臨床上作為 靜脈營養(yǎng)制劑的應用范圍，而L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在穩(wěn)定性和水溶性上均優(yōu)于其他含 L-谷氨酰胺的小肽。
[0003] 目前，生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法有化學合成法、微生物發(fā)酵法以及生物 轉化法。由于化學合成法在合成過程中需要引入和去除保護基團，合成步驟過多，成本過 高，并且需要用到有毒試劑，不適合工業(yè)生產；微生物發(fā)酵法成本低廉，環(huán)境溫和，但是產量 較低，離大規(guī)模生產還有一定距離；隨著DNA重組技術的發(fā)展以及微生物資源的發(fā)現，使得 微生物轉化法生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成為工業(yè)上很有前景的生產方法。其中微生物 轉化法生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的報道相對較少，其中Yoshinori Hirao等人報導的通 過培養(yǎng)表達氨基酸酯?；D移酶的重組大腸桿菌酶法生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，在50L 發(fā)酵罐中，以2. OmL/h的速度流加葡萄糖，發(fā)酵培養(yǎng)24h，取一定量的發(fā)酵液加入到含500mM 底物的IL發(fā)酵罐中反應40min，終產量達到67. 9g/L。


【發(fā)明內容】

[0004] 針對目前生物轉化法獲得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成本高，產量較低的缺陷，本發(fā) 明要解決的問題是提供一種使含有重組DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性 增強的方法。
[0005] 本發(fā)明為了高效利用氨基酸酯?；D移酶生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，提供了一 種使宿主菌中的氨基酸酯?；D移酶合成基因的拷貝數增加的方法，利用該方法可高效生 產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
[0006] 本發(fā)明是一種使含有重組DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強 的方法。其特征是：含有重組DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)是指在一定pH 值的水溶液中，作用于游離的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，生成L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺的具有氨基酸酯?；D移酶的蛋白質的基因片段重組到載體里并轉入進宿主菌，得到 帶有重組DNA并且使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強的宿主菌，經過以下階 段（1)培養(yǎng)大量表達氨基酸酯?；D移酶的重組大腸桿菌細胞；（2)過量表達階段（1)中 的氨基酸酯酰基轉移酶；（3)將階段（2)所得作為粗酶源，加入到含有L-谷氨酰胺和L-丙 氨酸甲酯鹽酸鹽底物氨基酸的一定pH值的水溶液中反應，實現L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的 尚效生廣。
[0007] 上述的氨基酸酯?；D移酶是在一定pH條件下，可使游離的L-谷氨酰胺和L-丙 氨酸甲酯鹽酸鹽轉化為L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶。
[0008] 上述的宿主菌除了大腸桿菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等屬的微生 物菌珠外，還可以使用酵母菌或者動物細胞宿主等。
[0009] 上述的宿主菌以大腸桿菌等作為宿主菌時，氨基酸酯?；D移酶表達載體在微生 物中獨立復制的同時，最好由啟動子、核糖體結合序列、氨基酸酯?；D移酶基因、轉錄終 止序列組成。
[0010] 上述的宿主菌以大腸桿菌為宿主菌時，表達載體有pET21a、PUC19、pET28a等質 粒。
[0011] 上述的表達載體中啟動子可采用Iac啟動子、PL、trp啟動子、trp串聯啟動子或 者T7啟動子等。
[0012] 上述的表達載體中核糖體結合序列，只要在大腸桿菌等宿主中能表達即可，核糖 體結合位點和起始密碼子之前保留適當的距離
[0013] 上述的宿主菌以大腸桿菌為宿主時，可使用大腸桿菌DH5a、大腸桿菌JM109、大 腸桿菌BL21 (DE3)、大腸桿菌W3310、大腸桿菌SCSllO等。
[0014] 上述的的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強的方法是通過使宿主菌 中的氨基酸酯?；D移酶基因的拷貝數增加來實現。
[0015] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增強的方法中宿主菌中的氨基 酸酯?；D移酶基因的拷貝數增加是通過導入經密碼子優(yōu)化后的氨基酸酯酰基轉移酶基 因來實現的。
[0016] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產方法，為了獲得含有本發(fā)明中用到的產酶的 宿主，例如重組棒狀桿菌、重組大腸桿菌、重組酵母菌等的細胞培養(yǎng)物，只要其能夠在合適 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物就可以了，對用于此目的的培養(yǎng)基，只要其能夠讓微生物正常生長， 就沒有特別限制。該培養(yǎng)基可以是含有必要的普通碳源、有機氮無機氮源、磷源、無機離子 和有機營養(yǎng)源的普通培養(yǎng)基。比如，只要該微生物能利用，就能夠使用任何碳源，能使用的 碳源的具體實施例，包括糖類諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉，醇類包括乙醇、山梨醇 和甘油，有機酸及其鹽包括檸檬酸、琥珀酸、乙酸和丙酸，碳氫化合物包括石蠟及其混合物。
[0017] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產方法，能使用的有機氮源實施例包括胰蛋白 胨、酵母膏、牛肉膏、酵母提取物等等，無機氮源諸如硫酸銨和氯化銨，延胡索酸銨鹽和檸檬 酸銨鹽，另外，培養(yǎng)基中用到的普通氮源，例如無機鹽、痕量金屬鹽和維生素，也能適宜的被 混合和使用。
[0018] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產方法中，作為無機鹽可使用磷酸氫二鉀、磷 酸二氫鉀、硫酸鎂等。
[0019] 上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產方法中，在培養(yǎng)時宿主采用誘導型啟動子的 表達質粒時，根據需要在培養(yǎng)基中補加誘導物。如果使用Iac啟動子或者T 7啟動子的表達 質粒，在培養(yǎng)基中補加乳糖或者IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）等，而使用色氨 酸啟動子的表達質粒時，需在培養(yǎng)基中補加吲哚丙烯酸（IAA)。
[0020] 本發(fā)明所提供的使含有重組DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系統(tǒng)活性增 強的方法，具有重要的工業(yè)應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖L pEAM330質粒圖譜
[0022] 圖 2. pUC19-phoC-SAET 質粒圖譜
[0023] 圖3. PCR產物電泳圖

【具體實施方式】
[0024] 一般性說明：實施例所提及的酶均購自TaKaRa公司，質粒提取試劑盒與PCR產 物純化試劑盒以及膠回收試劑盒均購自上海生物工程有限公司，操作完全按照相應說明進 行。全基因合成由上海旭冠公司完成。
[0025] LB 培養(yǎng)基（％) :1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1 % NaCl，pH 7. 0-7. 2。
[0026] Amp抗性平板：1%胰蛋白胨，0. 5%酵母抽提物，1% NaCl，1. 5%瓊脂糖，氨芐青霉 素 50 μ g/ml〇
[0027] 5XKCM(大腸桿菌轉化緩沖液）：0· 5M KC1，0. 15M CaC12,0. 25M MgC12。
[0028] L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶活測定：取0. 5ml的發(fā)酵液尚心去上清，加入0. 5mL 含有底物氨基酸的pH = 9. 0的IOOmM硼酸-NaOH緩沖溶液中（底物氨基酸濃度為：IOOmM Gln，和 IOOmM Ala-OMe. HC1)，混勻，25°C反應 5min，加入等體積的 I. 7% (ν/ν)Η3Ρ04溶液終 止反應。用0. 22 μ L的有機系濾膜過濾處理，OPA衍生后用HPLC測定L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺濃度，從而計算出酶活。
[0029] L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的產量測定：取0. 5ml的發(fā)酵液離心去上清，加入0. 5mL含 有底物氨基酸的pH = 9的水溶液中（底物氨基酸濃度為：IOOmM Gln，和IOOmM Ala-OMe. HC1)，混勻，25°C反應2h，加入等體積的I. 7% (VZV)H3PO4溶液終止反應。用0. 22 μ L的有 機系濾膜過濾處理，OPA衍生后用HPLC測定L-丙氨酰-L-谷氨酰胺濃度。
[0030] 實施例1 :氨基酸酯?；D移酶基因序列的設計
[0031] 根據大腸桿菌的密碼子使用頻率來優(yōu)化基因密碼子，消除低使用率的密碼子，同 時利用同義轉化方法消除EcoRI酶切位點，為了便于將氨基酸酯?；D移酶基因連接到其 他質粒載體上，因此在終止子后面插入一個酶切位點BamH I (GGATCC)。
[0032] 考慮到mRNA的二級結構，首先要保證AUG起始密碼子及其后的幾個堿基組成的密 碼子翻譯口袋呈打開狀態(tài)，降低核糖體結合到mRNA上的能勢，使得核糖體能夠順利地沿著 起始密碼子向后翻譯。
[0033] 本實施方式中氨基酸酯?；D移酶基因序列的原始序列，見Genbank ACCESSI0NAB610978,優(yōu)化后的氨基酸酯?；D移酶序列見SEQ ID N0:1。
[0034] 實施例2 :磷酸鹽啟動子的設計
[0035] 磷酸鹽啟動子來源于PEAM330質粒，質粒圖譜如說明書附圖1，該質粒的磷酸鹽啟 動子來源于大腸桿菌K12菌株的磷酸鹽操縱子，是一個適合大量積累微生物菌體的弱啟動 子，為了便于將磷酸鹽啟動子和氨基酸酯?；D移酶連接到質粒載體上，在啟動子上游插 入一個EcoR 1酶切位點（GAATTC)，磷酸啟動子序列見SEQ ID N0:2。
[0036] 將實施例1方式中優(yōu)化的氨基酸酯酰基轉移酶基因序列和實施例2方式中的磷 酸鹽啟動子直接相連一起提交給上海旭冠公司人工合成并連接到載體PUC19上，得到質粒 pUC19-phoC-SAET，質粒圖譜如說明書附圖2。
[0037] 實施例3 :氨基酸酯?；D移酶基因表達載體的構建
[0038] 以質粒pUC19-phoC-SAET為模板，利用引物
[0039] CAGAAGCTTATGAAAAACACTATAAGCT 和
[0040] CGAGGATCCTTAGTCTTTCAGAACAGAA，進行 PCR 擴增。得到長度為 1800bp 左右的 DNA 片段，PCR產物電泳圖如圖3所示。
[0041] (I) JM109/pUC19-phoC-SAET 的構建
[0042] 將實施案例1，2中基因合成的質粒pUC19-ph〇C-SAET轉化至大腸桿菌JM109感受 態(tài)細胞中。轉化過程為：將3 μ L連接液加入至50 μ L的JM109感受態(tài)細胞中，然后再加入 10 μ L的5 XKCM緩沖液，混勻后，在冰上放置30min后，42。。熱激90s，然后在冰上放置5min 后，加入500 μ L的LB培養(yǎng)基，37 °C，220rpm培養(yǎng)60min后，涂布至Amp抗性平板上，培養(yǎng)12h 后，挑取單菌，過夜培養(yǎng)，提取質粒進行驗證。然后進一步測序驗證基因序列是否正確。從 而得到了構建好的JM109/pUC19-phoC-SAET重組大腸桿菌。
[0043] (? JMl〇9/pUCl9-ptrp2_SAET 的構建
[0044] 本實施方式中色氨酸串聯啟動子序列為實驗室優(yōu)化并保藏；優(yōu)化后的色氨酸串聯 啟動子序列見SEQ ID NO:3
[0045] 將實施案例3中PCR擴增的SAET基因片段和載體pUC19-ptrp2-HYP (由實驗室保 藏）用限制性內切酶BamH I、Hind III于37°C酶切2h，電泳，切膠回收目的條帶，兩片段在 T4連接酶的作用下16°C連接反應16h，得到pUC19-ptrp2-SAET質粒。連接體系為10 μ L :
[0046] 氨基酸酯?；D移酶基因片段：5 μ L
[0047] pUC19-ptrp2-HYP 膠回收片段：1 μ L
[0048] IOXbuffer ： IyL
[0049] Τ4 DNA Iigase ： IyL
[0050] ddH20: 2 UL
[0051] 16 °C連接過夜后，將3 μ L的連接液轉化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中。轉化過 程為：將3 μ L連接液加入至50 μ L的JM109感受態(tài)細胞中，然后再加入10 μ L的5 X KCM緩 沖液，混勻后，在冰上放置30min后，42°C熱激90s，然后在冰上放置5min后，加入500 μ L的 LB培養(yǎng)基，37 °C，220rpm培養(yǎng)60min后，涂布至Amp抗性平板上，培養(yǎng)12h后，挑取單菌，過夜 培養(yǎng)，提取質粒進行驗證。然后進一步測序驗證基因序列是否正確。從而得到了構建好的 pUC19-ptrp2-SAET重組質粒。將測序正確的質粒pUC19-ptrp2-SAET轉入大腸桿菌JM109 中，得到構建好的重組大腸桿菌JM109/pUC19-ptrp2-SAET。
[0052] 實施例4 :L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的檢測
[0053] OPA衍生方法：50yL樣品，加入200 yL甲醇，200 yL 0· ImM四硼酸鈉，加入50yL 的衍生試劑（50mg 0PA，加入4. 5mL甲醇溶解，加入500ul 0. ImM四硼酸鈉，加入50 μ L的巰 基乙醇，混勻后置4°C保存），于37°C恒溫水浴鍋中加熱衍生25min。
[0054] HPLC檢測方法：日立I HPLC系統(tǒng)（輸液泵、熒光檢測器，柱溫箱，進樣器，數字記 錄及處理裝置），1&七618乂-131^(^(]18(25〇111111\4.6111111，5以111)，操作時柱溫控制在40 <€。流 動相：含17 %乙腈的磷酸緩沖液（pH 7. 2)，流速：lmL/min，檢測波長：激發(fā)波長338nm，發(fā) 射波長450nm〇
[0055] 實施例5 :重組菌株的發(fā)酵實驗
[0056] 搖瓶培養(yǎng)：挑取重組大腸桿菌單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素 50 48/1^)中，30°〇、220印111培養(yǎng)811后，按5%接種量接入含有251^發(fā)酵培養(yǎng)基（2(^/1葡 萄糖，l〇g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L硫酸銨，lg/L磷酸氫二鉀，3g/L磷酸二氫鉀， 〇. 5g/L硫酸鎂）的250mL搖瓶中，在旋轉式搖床中22°C、220rpm培養(yǎng)20h。取發(fā)酵液測定 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺濃度。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的測定方法詳見實施方式一般性說 明。發(fā)酵結果顯示，重組大腸桿菌JM109/pUC19-ph 〇C-SAET的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺產量 達到29mg/L，重組大腸桿菌JM109/pUC19-ptrp2-SAET的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺產量達到 32mg/L〇
[0057]
[0058」

【權利要求】
1. 一種利用重組大腸桿菌生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其中，利用重組大腸桿 菌生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是通過將具有氨基酸酯酰基轉移酶活性的蛋白質的基因片 段重組到載體上并轉入微生物細胞，得到的具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成活性的重 組微生物。
2. 權利要求1所述的利用重組大腸桿菌生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在 于通過優(yōu)化氨基酸酯?；D移酶基因的密碼子，并使重組微生物中的經密碼子優(yōu)化后的氨 基酸酯?；D移酶基因的拷貝數增加來實現。
3. 權利要求2所述的重組微生物中的氨基酸酯?；D移酶基因的拷貝數增加是通過 將經密碼子優(yōu)化后的氨基酸酯?；D移酶基因連接到多拷貝質粒中來實現的。
4. 權利要求3所述的多拷貝質粒包括但不局限于pUC19、pKYPIO等。 5. L-丙氨酰-L-谷氨酰的生產方法，其特征是將權利要求1、2、3所述的重組微生物在 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)物、菌體或者它們的處理物作為酶源，在一定pH值的水溶液 中，作用于游離的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，再從 該水性介質中提取生成的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
6. 權利要求5所述的生產方法，其特征是水性介質是一定pH值的水溶液。
7. 權利要求5所述的生產方法，其特征是向水性介質中添加 L-谷氨酰胺和L-丙氨酸 甲酯鹽酸鹽兩個底物。
8. 權利要求5所述的生產方法，其特征在于菌體培養(yǎng)和酶催化反應分兩步進行。
9. 權利要求1、2、3、5所述的重組微生物包括但不局限于大腸桿菌屬、棒狀桿菌屬、假 單胞菌屬。
【文檔編號】C12R1/19GK104480172SQ201410663050
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權日:2014年11月19日
【發(fā)明者】張震宇, 何艷春, 夏紫薇, 王宇婷 申請人:江南大學