一種快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的分子信標(biāo)探針及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針的堿基序列為：BeaconSAG：5’-FAM- CACCA TTCTGCTCCGAAGAGAAAGC TGGTG -DABCAL-3’；所述探針的5’端用FAM標(biāo)記，3’端用DABCAL標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)495nm，檢測(cè)波長(zhǎng)520nm。本發(fā)明的分子信標(biāo)探針信號(hào)強(qiáng)度高，并且特異性高，可以有效、快速地檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌。本發(fā)明還公開(kāi)了一種快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的試劑盒及檢測(cè)方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的分子信標(biāo)探針及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種分子信標(biāo)探針和試劑盒，通過(guò)使用熒 光原位雜交的手段，檢測(cè)樣品中少量的無(wú)乳鏈球菌。

【背景技術(shù)】
[0002] 無(wú)乳鏈球菌亦稱(chēng)B群鏈球菌（Group B Streptococcus, GBS)，是新生兒和女性生 殖系統(tǒng)感染的重要細(xì)菌。尤其是新生兒時(shí)期的感染，是危及生命的重要原因，其并發(fā)癥包括 敗血癥、肺炎和腦膜炎等。在成年婦女的陰道內(nèi)，有15%左右可以檢測(cè)出無(wú)乳鏈球菌，這類(lèi) 女性分娩的新生兒感染該菌的幾率會(huì)比較高。
[0003] 新生兒無(wú)乳鏈球菌感染分為早發(fā)性感染和晚發(fā)性感染兩種。早發(fā)性感染一般是感 染后一周內(nèi)發(fā)病，在美國(guó)新生兒早發(fā)性感染的死亡率為4%-6%;晚發(fā)型感染多見(jiàn)于出生后 7天?3月足月兒，主要表現(xiàn)為腦膜炎，常呈隱匿性發(fā)病。臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、昏睡、顱內(nèi)高壓 等，如伴發(fā)敗血癥則預(yù)后較差。多數(shù)感染都是因?yàn)槟阁w生殖系統(tǒng)攜帶的無(wú)乳鏈球菌，經(jīng)由破 裂的胎膜進(jìn)入羊水，然后感染胎兒。細(xì)菌感染呼吸道可引起肺炎，進(jìn)入血液系統(tǒng)可引起敗血 癥、腦膜炎和骨髓炎等。
[0004] 目前臨床上檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌最常用的方法是CAMP法：在血平板上B群鏈球菌能產(chǎn) 生CAMP因子，能促進(jìn)金黃葡萄球菌溶血素活性--在血瓊脂平板上用金黃色葡萄球菌培養(yǎng) 物劃一條直線(xiàn)，然后將鏈球菌培養(yǎng)物劃一條線(xiàn)，與金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物的劃線(xiàn)相互垂直， 但不要接觸，二者相距3_5mm，各鏈球菌分離菌劃線(xiàn)間距10?20mm。置37°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h 后觀(guān)察結(jié)果。在兩劃線(xiàn)交界處出現(xiàn)箭頭樣的溶血區(qū)為陽(yáng)性。該方法具有簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu) 點(diǎn)，缺點(diǎn)是靈敏度較低，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。樣本內(nèi)含菌量少時(shí)往往不能得出陽(yáng)性結(jié)果，并且 不能區(qū)分是無(wú)乳鏈球菌還是其它B群鏈球菌。利用PCR方法可在短時(shí)間內(nèi)使特定的核酸序 列拷貝數(shù)幾何級(jí)數(shù)增加，有很高的靈敏度和特異性，但缺點(diǎn)是假陽(yáng)性率高，另一方面，患者 分泌物中有往往含有抑制PCR反應(yīng)的成分，這又會(huì)導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)，這兩方面的缺點(diǎn)限 制了 PCR檢測(cè)的臨床應(yīng)用。由此可見(jiàn)，無(wú)乳鏈球菌臨床診斷，急需更簡(jiǎn)潔、靈敏的檢測(cè)方法。
[0005] 分子信標(biāo)探針（Molecular beacon probe)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、只有和革巴序 列雜交上了才會(huì)發(fā)出熒光等優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于熒光原位雜交。本發(fā)明通過(guò)對(duì)大量無(wú)乳鏈球菌 和其它鏈球菌菌株的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，挑選無(wú)乳鏈球菌的特異性序列，設(shè)計(jì)、合成分 子信標(biāo)探針，建立穩(wěn)定的分子信標(biāo)原位雜交反應(yīng)體系，克服了無(wú)乳鏈球菌當(dāng)前臨床檢測(cè)的 諸多問(wèn)題，為無(wú)乳鏈球菌感染的診斷、預(yù)防和控制提供新的檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種分子信標(biāo)探針，通過(guò)熒光原位雜交的手段，建立一種 快速、靈敏、特異性地檢測(cè)樣品中無(wú)乳鏈球菌的方法。
[0007] -種快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針的堿 基序列為：
[0008] Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3' ；
[0009] 所述探針的5'端用FAM標(biāo)記，3'端用DABCAL標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)495nm，檢 測(cè)波長(zhǎng)520nm。
[0010] 進(jìn)一步地，所述分子信標(biāo)濃度為IOng/ μ L。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 括：
[0012] ⑴裂解液：4%氫氧化鈉
[0013] (2)雜交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺，0· 1% (w/v) 焦磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0. 1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7· 5)，IOng/ μ L分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針的堿基 序列為：
[0014] Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3' ；
[0015] (3)終止液：1 稀硫酸
[0016] (4)洗滌液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100, pH 值為 10。
[0017] 本發(fā)明最后提供了一種上述試劑盒快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的方法，其特征在于包括 如下步驟：
[0018] ⑴吸取10 μ L樣品滴在載玻片上，自然風(fēng)干；
[0019] (2)在風(fēng)干的樣品上加入IOyL裂解液，待其自然風(fēng)干后，浸入無(wú)水乙醇中，浸泡5 分鐘；
[0020] (3) 52 °C 雜交 10 分鐘；
[0021] (4)液侵泡1分鐘，終止反應(yīng)；
[0022] (5)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20 X物鏡掃視和計(jì)數(shù)，用60或100X物 鏡觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)。
[0023] 本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)或原理：突光原位雜交（Flourescence in situ Hybridization，F(xiàn)ISH)是一種應(yīng)用標(biāo)記有熒光物質(zhì)的探針，通過(guò)雜交的方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或 組織內(nèi)特異性DNA或RNA的方法；分子信標(biāo)探針是一種具有獨(dú)特"發(fā)夾"空間結(jié)構(gòu)的探針，在 未與靶序列結(jié)合時(shí)，分子信標(biāo)呈"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，有一環(huán)序列（loop)和一莖序列（stem)，其中 環(huán)序列是與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列，而莖序列是與靶位點(diǎn)無(wú)關(guān)的互補(bǔ)序列；在探針的兩端 分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)，當(dāng)探針處于發(fā)卡結(jié)構(gòu)時(shí)，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)相鄰， 產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)，使得熒光基團(tuán)被猝滅，不能產(chǎn)生熒光信號(hào)，而當(dāng)探針與靶位點(diǎn)結(jié)合 時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開(kāi)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)熒光顯微鏡可以檢測(cè) 到該突光信號(hào)。
[0024] 本發(fā)明通過(guò)比對(duì)多個(gè)無(wú)乳鏈球菌和其它鏈球菌的16S rRNA序列，篩選出1條無(wú)乳 鏈球菌特有的靶序列。根據(jù)該靶序列，人工合成分子信標(biāo)探針，其堿基組成為：
[0025] Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3'
[0026] 探針的5'端用FAM標(biāo)記，3'端用DABCAL標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)495nm，檢測(cè)波 長(zhǎng) 520nm。
[0027] 本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，確定熒光原位雜交的最佳溫度為52°C，甲酰胺最佳濃度為 20%，分子信標(biāo)最佳濃度為IOng/ μ L。
[0028] 本發(fā)明分子信標(biāo)探針5'端的熒光標(biāo)記，包括但不限于FITC、FAM或Cy3等等，3'端 的熒光猝滅標(biāo)記，包括但不限于DABCYL、BDH或TANRA等，熒光基團(tuán)或熒光猝滅基團(tuán)可以根 據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行添加。
[0029] 本發(fā)明的分子信標(biāo)探針能夠用于檢測(cè)的樣本范圍廣泛，包括但不限于，痰、咽拭 子、胃灌洗液、支氣管灌洗液、活體組織、吸引物、咳出物、體液（脊髓、胸腹水、心包液等）、 血液、膿液、骨髓、尿液、組織切片、食物樣本、來(lái)自土壤、空氣和水的樣本，以及它們的培養(yǎng) 物。這些樣本經(jīng)相應(yīng)處理后，原則上是只要保持細(xì)胞形態(tài)完整并且靶核酸未被破壞，均可使 用本發(fā)明的分子信標(biāo)探針檢測(cè)。這些樣本的處理方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的，例如：
[0030] 痰：痰液涂片法；
[0031] 膿液：同痰液涂片法；
[0032] 病灶組織：先用組織研磨器磨碎后再行涂片；
[0033] 尿液：留全量夜尿，靜置4?5h后，棄上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，離 心30min，取沉淀物涂片；
[0034] 胸、腹水標(biāo)本：參照尿液涂片法；
[0035] 腦脊液：無(wú)菌操作收集腦脊液，放置冰箱或室溫24h，待薄膜形成后涂片。也可將 腦脊液離心沉淀，3000rpm，離心30min，棄上清液，取沉淀物涂片。
[0036] 本發(fā)明的分子信標(biāo)探針信號(hào)強(qiáng)度高，并且特異性高，可以有效、快速地檢測(cè)無(wú)乳鏈 球菌。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明 本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造 商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn) 品。
[0038] 實(shí)施例1 :分子信標(biāo)探針及寡聚核苷酸序列的設(shè)計(jì)與合成
[0039] 選擇出能特異性地檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的靶序列，在該段靶序列上設(shè)計(jì)與其完全互補(bǔ) 的分子信標(biāo)探針：
[0040] Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3'
[0041] 該分子信標(biāo)是由堿基組成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異序列，其中5,端用FAM標(biāo)記，3,端用 DABCTL標(biāo)記，熒光基團(tuán)要求激發(fā)波長(zhǎng)495nm，檢測(cè)波長(zhǎng)520nm ;人工設(shè)計(jì)合成分子信標(biāo)及與 其完全互補(bǔ)的寡核苷酸（5' -AGGTCCGGGTTCTCTCGGAT-3'）。通過(guò)對(duì)分子信標(biāo)和寡聚核苷酸 做熱變性曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)，確定熒光原位雜交的最佳反應(yīng)溫度為52°C，去離子甲酰胺的最佳濃度 為 20%。
[0042] 實(shí)施例2 :使用分子信標(biāo)探針FISH檢測(cè)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。
[0043] 無(wú)乳鏈球菌和其他細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自ATCC，共檢測(cè)5種無(wú)乳鏈球菌和12種其它鏈 球菌。檢測(cè)試劑盒包括：
[0044] (1)裂解液：4%氫氧化鈉
[0045] (2)雜交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺，0· 1% (w/v) 焦磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0. 1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7· 5)，IOng/ μ L分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針的堿基 序列為：
[0046] Beacon SAG :5, -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3,；
[0047] (3)終止液：1 %稀硫酸
[0048] (4)洗滌液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100, pH 值為 10。
[0049] 檢測(cè)方法：
[0050] (I)吸取10 μ L培養(yǎng)樣品滴在載玻片上，自然風(fēng)干；
[0051] (2)在風(fēng)干的樣品上加入IOyL裂解液，待其自然風(fēng)干后，浸入無(wú)水乙醇中，浸泡5 分鐘；
[0052] (3)在樣品上加入10 μ L雜交液，置于雜交爐中52°C雜交10分鐘；
[0053] (4)用終止液侵泡1分鐘,終止反應(yīng)；
[0054] (5)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20 X物鏡掃視和計(jì)數(shù)，用60或100 X物 鏡觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)。在暗色背景中，無(wú)乳鏈球菌發(fā)出綠色熒光。
[0055] 結(jié)果判定方法：
[0056] 無(wú)乳鏈球菌陰性:連續(xù)觀(guān)察50個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。
[0057] 無(wú)乳鏈球菌陽(yáng)性（報(bào)告菌數(shù)）：1-9條/50視野。
[0058] 無(wú)乳鏈球菌陽(yáng)性（1+) :10-99條/50視野。
[0059] 無(wú)乳鏈球菌陽(yáng)性（2+) : 1-9條每視野。
[0060] 無(wú)乳鏈球菌陽(yáng)性（3+) :10-99條每視野。
[0061] 無(wú)乳鏈球菌陽(yáng)性（+) :>100條每視野。
[0062] 表一：使用無(wú)乳鏈球菌分子信標(biāo)探針FISH檢測(cè)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株
[0063]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針的堿基 序列為： Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3' ； 所述探針的5'端用FAM標(biāo)記，3'端用DABCAL標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)495nm，檢測(cè)波 長(zhǎng) 520nm。
2. 如權(quán)利要求1所述的分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)濃度為10ng/y L。
3. -種快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (1)裂解液：4%氫氧化鈉； ⑵雜交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20% (v/v)甲酰胺,0.1% (w/v)焦 磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0.1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7. 5)，10ng/ ii L分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針的堿基 序列為： Beacon SAG :5' -FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3' ； (3) 終止液：1%稀硫酸； (4) 洗滌液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100，pH 值為 10。
4. 一種利用權(quán)利要求3所述試劑盒快速檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的方法，其特征在于包括如下 步驟： (1) 吸取10 U L樣品滴在載玻片上，自然風(fēng)干； (2) 在風(fēng)干的樣品上加入10 y L裂解液，待其自然風(fēng)干后，浸入無(wú)水乙醇中，浸泡5分 鐘； (3) 在樣品上加入10 y L雜交液，置于雜交爐中52°C雜交10分鐘； (4) 用終止液侵泡1分鐘，終止反應(yīng)； (5) 滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20 X物鏡掃視和計(jì)數(shù)，用60或100 X物鏡觀(guān) 察細(xì)菌形態(tài)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104388558SQ201410635596
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】方華成, 洪冉, 劉振世, 易春 申請(qǐng)人:蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司