一種快速檢測化膿性鏈球菌的分子信標(biāo)探針及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測化膿性鏈球菌的分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針的堿基序列為：BeaconSPY：5’-CY3- CATTG TACGCCCATAATTCGGAC CAATG –BHQ1-3’；所述探針的5’端用Cy3標(biāo)記，3’端用BHQ1標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長552nm，檢測波長570nm。本發(fā)明的分子信標(biāo)探針信號強(qiáng)度高，并且特異性高，可以有效、快速地檢測化膿性鏈球菌。本發(fā)明還公開了一種快速檢測化膿性鏈球菌的試劑盒及檢測方法。
【專利說明】一種快速檢測化膿性鏈球菌的分子信標(biāo)探針及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種分子信標(biāo)探針和試劑盒，通過使用熒 光原位雜交的手段，檢測樣品中少量的化膿性鏈球菌。

【背景技術(shù)】
[0002] 化膿性鏈球菌又稱A組鏈球菌（GAS)，是人類細(xì)菌感染中最重要的病原之一?；?膿性鏈球菌可侵及人體的任何部位，但以上呼吸道、其次皮膚軟組織感染為最常見的原發(fā) 感染部位?；撔枣溓蚓梢鸹撔约膊〖胺腔撔圆l(fā)癥兩類疾病。由化膿性鏈球菌 間接所致的非化膿性并發(fā)癥即免疫性疾?。猴L(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎?；撔枣溓蚓鷣喰?多，各型間無交叉免疫，故常反復(fù)感染。近年來由化膿性鏈球菌所引起的嚴(yán)重感染，侵襲性 化膿性鏈球菌感染發(fā)病率的增長及其所致嚴(yán)重后果，也引起了人們對該類細(xì)菌感染更大的 關(guān)注。
[0003] 目前臨床上檢測化膿性鏈球菌最常用的方法是涂片檢測法，據(jù)不同疾病采取不同 的標(biāo)本。如傷口的膿液，咽喉、鼻腔等病灶的棉拭，敗血癥時取血液等。檢測抗體時取血清。 直接涂片鏡檢膿液標(biāo)本可直接涂片，革蘭染色后鏡檢。膿液標(biāo)本鏡下觀察時，細(xì)菌常呈雙或 以單個形式存在，而不是呈典型的鏈狀。該方法具有簡單、快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是靈敏 度低，痰內(nèi)或者其它標(biāo)本內(nèi)含菌量少時往往不能得出陽性結(jié)果。
[0004] 分離培養(yǎng)法的結(jié)果相對可靠，特異性高，是目前診斷化膿性鏈球菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)。 但化膿性鏈球菌不能在普通瓊脂平板及肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需要在培養(yǎng)基中加入血液方能 生長，有時還需要在培養(yǎng)基中加入多種生長因子，且需要3-5天才能看到檢測結(jié)果。由此可 見，化膿性鏈球菌的臨床診斷，急需更簡潔、靈敏的檢測方法。
[0005] 分子信標(biāo)探針（Molecular beacon probe)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、只有和革巴序 列雜交上了才會發(fā)出熒光等優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于熒光原位雜交。本發(fā)明通過對大量結(jié)核分枝桿 菌和化膿性鏈球菌菌株的16S rRNA序列進(jìn)行比對，挑選化膿性鏈球菌的特異性序列，設(shè)計、 合成分子信標(biāo)探針，建立穩(wěn)定的分子信標(biāo)原位雜交反應(yīng)體系，克服了化膿性鏈球菌當(dāng)前臨 床檢測的諸多問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種分子信標(biāo)探針，通過熒光原位雜交的手段，建立一種 快速、靈敏、特異性地檢測樣品中化膿性鏈球菌的方法。
[0007] -種快速檢測化膿性鏈球菌的分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針的 堿基序列為：
[0008] Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ；
[0009] 所述探針的5'端用Cy3標(biāo)記，3'端用BHQl標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長552nm，檢測 波長570nm。
[0010] 進(jìn)一步地，所述分子信標(biāo)濃度為long/ μ L。 toon] 本發(fā)明還提供了一種快速檢測化膿性鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 包括：
[0012] ⑴裂解液：4%氫氧化鈉
[0013] (2)雜交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺，0· 1% (w/v) 焦磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0. 1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7· 5)，IOng/ μ L分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針的堿基 序列為：
[0014] Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ；
[0015] (3)終止液：1 稀硫酸；
[0016] (4)洗滌液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100, pH 值為 10。
[0017] 本發(fā)明最后提供了一種上述試劑盒快速檢測化膿性鏈球菌的方法，其特征在于包 括如下步驟：
[0018] ⑴吸取10 μ L樣品滴在載玻片上，自然風(fēng)干；
[0019] (2)在風(fēng)干的樣品上加入IOyL裂解液，待其自然風(fēng)干后，浸入無水乙醇中，浸泡5 分鐘；
[0020] (3) 52 °C 雜交 10 分鐘；
[0021] (4)液侵泡1分鐘，終止反應(yīng)；
[0022] (5)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20 X物鏡掃視和計數(shù)，用60或100X物 鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。
[0023] 本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)或原理：突光原位雜交（Flourescence in situ Hybridization，F(xiàn)ISH)是一種應(yīng)用標(biāo)記有熒光物質(zhì)的探針，通過雜交的方法來檢測細(xì)胞或 組織內(nèi)特異性DNA或RNA的方法；分子信標(biāo)探針是一種具有獨(dú)特"發(fā)夾"空間結(jié)構(gòu)的探針，在 未與靶序列結(jié)合時，分子信標(biāo)呈"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，有一環(huán)序列（loop)和一莖序列（stem)，其中 環(huán)序列是與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基序列，而莖序列是與靶位點(diǎn)無關(guān)的互補(bǔ)序列；在探針的兩端 分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)，當(dāng)探針處于發(fā)卡結(jié)構(gòu)時，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)相鄰， 產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)，使得熒光基團(tuán)被猝滅，不能產(chǎn)生熒光信號，而當(dāng)探針與靶位點(diǎn)結(jié)合 時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開，產(chǎn)生熒光信號，通過熒光顯微鏡可以檢測 到該突光信號。
[0024] 本發(fā)明通過比對多個化膿性鏈球菌和其它鏈球菌的16S rRNA序列，篩選出1條化 膿性鏈球菌特有的靶序列。根據(jù)該靶序列，人工合成分子信標(biāo)探針，其堿基組成為：
[0025] Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ；
[0026] 探針的5'端用Cy3標(biāo)記，3'端用BHQl標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長552nm，檢測波長 570nm〇
[0027] 本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)，確定熒光原位雜交的最佳溫度為52°C，甲酰胺最佳濃度為 20%，分子信標(biāo)最佳濃度為IOng/ μ L。
[0028] 本發(fā)明分子信標(biāo)探針5'端的熒光標(biāo)記，包括但不限于FITC、FAM或Cy3等等，3'端 的熒光猝滅標(biāo)記，包括但不限于DABCYL、BDH、BHQ1或TANRA等，熒光基團(tuán)或熒光猝滅基團(tuán)可 以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行添加。
[0029] 本發(fā)明的分子信標(biāo)探針能夠用于檢測的樣本范圍廣泛，包括但不限于，痰、咽拭 子、胃灌洗液、支氣管灌洗液、活體組織、吸引物、咳出物、體液（脊髓、胸腹水、心包液等）、 血液、膿液、骨髓、尿液、組織切片、食物樣本、來自土壤、空氣和水的樣本，以及它們的培養(yǎng) 物。這些樣本經(jīng)相應(yīng)處理后，原則上是只要保持細(xì)胞形態(tài)完整并且靶核酸未被破壞，均可使 用本發(fā)明的分子信標(biāo)探針檢測。這些樣本的處理方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的，例如：
[0030] 痰：痰液涂片法；
[0031] 膿液：同痰液涂片法；
[0032] 病灶組織：先用組織研磨器磨碎后再行涂片；
[0033] 尿液：留全量夜尿，靜置4?5h后，棄上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，離 心30min,取沉淀物涂片；
[0034] 胸、腹水標(biāo)本：參照尿液涂片法；
[0035] 腦脊液：無菌操作收集腦脊液，放置冰箱或室溫24h，待薄膜形成后涂片。也可將 腦脊液離心沉淀，3000rpm,離心30min,棄上清液，取沉淀物涂片。
[0036] 本發(fā)明的分子信標(biāo)探針信號強(qiáng)度高，并且特異性高，可以有效、快速地檢測化膿性 鏈球菌。

【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但下列實(shí)施例僅用于說明 本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造 商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn) 品。
[0038] 實(shí)施例1 :分子信標(biāo)探針及寡聚核苷酸序列的設(shè)計與合成
[0039] 選擇出能特異性地檢測化膿性鏈球菌的靶序列，在該段靶序列上設(shè)計與其完全互 補(bǔ)的分子信標(biāo)探針：
[0040] Beacon SPY : (5, -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG - BHQ1-3,）；
[0041] 該分子信標(biāo)是由堿基組成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)的特異序列，其中探針的5'端用Cy3標(biāo)記， 3'端用BHQl標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長552nm，檢測波長570nm ;人工設(shè)計合成分子信標(biāo)及與 其完全互補(bǔ)的寡核苷酸（5' -GTCCGGAATTACTGGGCGTA-3'）。通過對分子信標(biāo)和寡聚核苷酸 做熱變性曲線實(shí)驗(yàn)，確定熒光原位雜交的最佳反應(yīng)溫度為52°C，去離子甲酰胺的最佳濃度 為 20%。
[0042] 實(shí)施例2 :使用分枝信標(biāo)探針FISH檢測鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。
[0043] 鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購自ATCC，共檢測5種化膿性鏈球菌和12種其它鏈球菌。
[0044] 檢測試劑盒包括：
[0045] (1)裂解液：4%氫氧化鈉
[0046] (2)雜交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，IOmM NaCl，20% (v/v)甲酰胺，0· 1% (w/v) 焦磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0. 1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7· 5)，IOng/ μ L分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針的堿基 序列為：
[0047] Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ；
[0048] (3)終止液：1 %稀硫酸
[0049] (4)洗滌液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100, pH 值為 10。
[0050] 檢測方法：
[0051] (I)吸取10 μ L痰液樣品滴在載玻片上，自然風(fēng)干；
[0052] (2)在風(fēng)干的樣品上加入IOyL裂解液，待其自然風(fēng)干后，浸入無水乙醇中，浸泡5 分鐘；
[0053] (3)在樣品上加入10 μ L雜交液，置于雜交爐中52°C雜交10分鐘；
[0054] (4)用終止液侵泡1分鐘,終止反應(yīng)；
[0055] (5)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20 X物鏡掃視和計數(shù)，用60或100X物 鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。在暗色背景中，化膿性鏈球菌發(fā)出紅色熒光。
[0056] 結(jié)果判定方法：
[0057] 化膿性鏈球菌陰性:連續(xù)觀察50個不同視野，未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。
[0058] 化膿性鏈球菌陽性（報告菌數(shù)）：1-9條/50視野。
[0059] 化膿性鏈球菌陽性（1+) : 10-99條/50視野。
[0060] 化膿性鏈球菌陽性（2+) : 1-9條每視野。
[0061] 化膿性鏈球菌陽性（3+) :10-99條每視野。
[0062] 化膿性鏈球菌陽性（+) :>100條每視野。
[0063] 檢測結(jié)果如表1所示。
[0064] 表1使用化膿性鏈球菌分子信標(biāo)探針FISH檢測細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測化膿性鏈球菌的分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)探針的堿 基序列為： Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ； 所述探針的5'端用Cy3標(biāo)記，3'端用BHQ1標(biāo)記，熒光基團(tuán)激發(fā)波長552nm，檢測波長 570nm〇
2. 如權(quán)利要求1所述的分子信標(biāo)探針，其特征在于，所述分子信標(biāo)濃度為10ng/y L。
3. -種快速檢測化膿性鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (1)裂解液：4%氫氧化鈉 ⑵雜交液：10% (w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20% (v/v)甲酰胺,0.1% (w/v)焦 磷酸鈉，0.2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0.1% (v/v) TritonX-100, 50mM Tris/HCl (pH 7. 5)，10ng/ ii L分子信標(biāo)探針，所述分子信標(biāo)探針的堿基 序列為： Beacon SPY :5' -CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG-BHQ1-3' ； (3) 終止液：1%稀硫酸； (4) 洗滌液：5mM Tris，15mM NaCl，0. 1% (v/v)Triton X-100，pH 值為 10。
4. 一種利用權(quán)利要求3所述試劑盒快速檢測化膿性鏈球菌的方法，其特征在于包括如 下步驟： (1) 吸取10 U L樣品滴在載玻片上，自然風(fēng)干； (2) 在風(fēng)干的樣品上加入10 y L裂解液，待其自然風(fēng)干后，浸入無水乙醇中，浸泡5分 鐘； (3) 在樣品上加入10 y L雜交液，置于雜交爐中52°C雜交10分鐘； (4) 用終止液侵泡1分鐘，終止反應(yīng)； (5) 滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用20 X物鏡掃視和計數(shù)，用60或100 X物鏡觀 察細(xì)菌形態(tài)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388557SQ201410635299
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】洪冉, 方華成, 易春, 劉振世 申請人:蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司