來自化膿性鏈球菌的內(nèi)切糖苷酶及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種內(nèi)切糖苷酶，稱為EndoS49，氨基酸序列為SEQIDNO:1。EndoS49分離自化膿性鏈球菌NZ131菌株，是EndoS的同源物。EndoS49在天然IgG上具有特異的內(nèi)切糖苷酶活性并比EndoS裂解更多種類的Fc聚糖。本發(fā)明制備了其一個突變體，其中SEQIDNO:1第186位點的谷氨酸被取代，所述突變體缺乏內(nèi)切糖苷酶活性但能夠結(jié)合至IgG。本發(fā)明公開了使用EndoS49、其缺失體和所述突變體的方法，特別是用于評價IgG糖基化或分離IgG。
【專利說明】來自化膿性鏈球菌的內(nèi)切糖苷酶及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及新的內(nèi)切糖苷酶、其缺乏聚糖水解活性的突變體、以及其在水解糖蛋白的聚糖的方法中用途。
【背景技術】
[0002]內(nèi)切糖苷酶S (EndoS)由化膿性鏈球菌的多種血清型菌株分泌，并且對天然IgG具有特異的內(nèi)切糖苷酶活性，其水解連接至IgG的重鏈上的第297位天冬酰胺殘基的保守多糖。Collin and Olsen, The EMBO Journal, 2001, 20 3046-3055.EndoS 是第一個知道的對天然IgG有獨特特異性的細菌酶。相反，其他已知的內(nèi)切糖苷酶的活性需要糖蛋白底物的變性或其活性通過該變性而增強。
[0003]抗體(例如IgG)在基礎研究和診斷及藥物開發(fā)中有許多應用。在某些這些應用中，例如免疫組化、免疫分析、腫瘤檢測、放療、抗體結(jié)合位點的晶體研究以及免疫打靶，使用Fab片段比使用整個IgG分子更方便。使用Fab片段的一些優(yōu)點在于，它們不會受細胞上的Fe受體或受沉淀抗原的影響，它們表現(xiàn)出降低的免疫原性并且對吞噬作用較不敏感，放射性標記的Fab片段比整個IgG分子更快速地從組織中清除。在另外的應用中，可能期望使用去糖基化的抗體或其他糖蛋白。
[0004]IgG分解為Fab和Fe片段通常使用蛋白水解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)來進行。這些酶通常分解其他蛋白，因此分解反應通常必須對純化的IgG組分進行。而且，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶通常在不止一個位點分解IgG。這意味著，所獲得的片段通常不對應于整個Fab或Fe片段，并且即使分解不產(chǎn)生Fab和Fe片段，它們通常會進一步分解成較小的片段。Fe片段與Fab片段的分離通常使用蛋白質(zhì)A或G親和分離柱來進行，其使用了細菌蛋白質(zhì)A和G的Fe-結(jié)合性質(zhì)。
[0005]許多不同的糖蛋白在治療應用中具有用途。分析這些蛋白的糖基化的方法在藥物蛋白的研發(fā)中具有用途。也可能期望提供這些蛋白的不同的糖基化形式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明人從血清型M49化膿鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了新的內(nèi)切糖苷酶，本文稱EndoS49。EndoS49分離自NZ131菌株，它是血清型M49的致腎炎且高度可轉(zhuǎn)化菌株。NZ131菌株是在新西蘭從一例急性鏈球菌感染后腎小球腎炎的患者中臨床分離得到的。在蛋白質(zhì)水平，EndoS49與EndoS具有小于40%的一致性，并且是一個90kDa蛋白質(zhì)，而EndoS是一個108kDa的蛋白質(zhì)。EndoS49比EndoS具有對更廣范圍的蛋白質(zhì)的去糖基化活性。
[0007]這種酶是90kDa的酶，具有家族18糖苷水解酶催化結(jié)構域。EndoS49水解人糖蛋白上的聚糖，特別是IgGl-4和α-1-微球蛋白。EndoS49可被用在人糖蛋白(包括IgG和α-1-微球蛋白)上 的聚糖的水解中。因此，EndoS49可被用在糖基化概括分析(glycoprofiling analysis)中,其中酶與糖蛋白接觸,所產(chǎn)生的產(chǎn)物被分離以分析聚糖和蛋白。EndoS49也可被用來制備去糖基化的蛋白。該酶可被修飾以降低或去除內(nèi)切糖苷酶活性。
[0008]缺乏內(nèi)切糖苷酶活性的經(jīng)修飾的EndoS49多肽可被用在分離糖基化的和/或功能上有活性的IgG的方法中。通過與其他能結(jié)合變性的和/或去糖基化的IgG的IgG結(jié)合試劑結(jié)合使用這種經(jīng)修飾的EndoS49多肽，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了一種評價含IgG樣品的糖基化狀態(tài)或功能質(zhì)量的方法。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，其提供一種多肽，包含:
(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
(b)與SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少50%—致性且具有內(nèi)切糖苷酶活性的變體；或
(c)它們的任一個的具有內(nèi)切糖苷酶活性的片段。
[0010]本發(fā)明還提供了一種能夠結(jié)合至IgG并且不具有內(nèi)切糖苷酶活性的多肽，該多肽包含
(a)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(b)與SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少50%—致性的變體，其中相當于186位點處的谷氨酸的氨基酸被取代；或
(C)它們的任一個的片段。
[0011]本發(fā)明還提供編碼或表達本發(fā)明的多肽的多核苷酸、表達載體和宿主細胞。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽在測定或分析蛋白質(zhì)(特別是抗體，特別是IgG抗體)的糖基化狀態(tài)的方法中的用途。
[0012]本發(fā)明還提供用于從含IgG樣品中分離IgG的方法，該方法包括:
(a)將所述含IgG樣品與缺乏IgG內(nèi)切糖苷酶活性的經(jīng)修飾的EndoS49多肽相接觸，
(b)將所述EndoS49與被接觸的樣品分離；
從而獲得分離的IgG。
[0013]另外，本發(fā)明提供評價含IgG樣品的糖基化狀態(tài)或功能質(zhì)量的方法，該方法包括獲取該含IgG樣品的第一和第二子樣品，其中對第一子樣品實施根據(jù)以上方法的步驟(a)和(b)，并且對第二子樣品實施以上步驟(a)和(b)，只是EndoS49多肽被能夠結(jié)合變性的和/或去糖基化的IgG的另一種IgG結(jié)合試劑替代，該方法進一步包含:
(c)對結(jié)合至第一子樣品中的EndoS49多肽的IgG的量，以及結(jié)合至第二子樣品中的另一種IgG結(jié)合試劑的IgG的量，進行定量；和
(d)對比(c)中測定的被結(jié)合的IgG的兩個量；
從而評價含IgG樣品的糖基化狀態(tài)或功能質(zhì)量。
[0014]本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶也可被用在分離IgG的Fab或Fe片段的方法中。本發(fā)明的方法利用來自化膿性鏈球菌的高度特異性IgG裂解酶，IdeS (化膿性鏈球菌的免疫球蛋白G降解酶)，以及EndoS49多肽。
[0015]在本發(fā)明的一個方法中，含IgG的樣品與IdeS和EndoS49多肽接觸，其是經(jīng)修飾的EndoS49多肽，如上所述，該多肽缺乏內(nèi)切糖苷酶活性。
[0016]在本發(fā)明的方法中，通常IdeS將IgG裂解為Fab片段和Fe片段，EndoS49多肽結(jié)合至Fe片段。Fe片段隨后與Fab片段分離。
[0017]該方法對于從包含純化的IgG的樣品中分離Fab或Fe片段特別有用。更具體而言，使用本發(fā)明的經(jīng)修飾的EndoS49多肽來從包含純化的IgG樣品中分離Fab或Fe片段是有用的。但是，該方法也可適用于含有非純化的IgG的樣品，例如血清、細胞裂解物或細胞培養(yǎng)物。
[0018]本發(fā)明還提供了進行本發(fā)明的方法的試劑盒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1.EndoS49和EndoS的ClustalW比對顯示出兩種不同的蛋白質(zhì)。使用MacVector 軟件中的 ClustalW 來比對 EndoS49 和 EndoS。GH18 催化模體(D#D*D*E)存在于179-186位點，Glul86是催化殘基。
[0020]圖2.EndoS49對糖蛋白具有活性。A.1 Pg的EndoS49、其催化突變體和平截形式與3 Ag人IgG在PBS中溫育過夜(37°C )并在SDS-PAGE凝膠上分析，并進行LCA凝集素印跡。B.1 μδ EndoS49和EndoS49 (E186L)與3 Pg的人IgG的亞類1_4溫育，并進行如上分析。C.1 Pg EndoS49及其突變體與3 μδ α-1-微球蛋白溫育，并在10%SDS_PAGE凝膠上分析。
[0021]圖3.EndoS49結(jié)合至IgG。4gg、2Pg和I Kg的EndoS49及其突變體被固定在PVDF膜上并與人IgG溫育，隨后與結(jié)合有HRP的蛋白質(zhì)G —起溫育。
[0022]圖4.ndoS49和ndoS的基因組文本。在MacVector中進行GAS菌株NZ131 (M49)和5005 (Ml)中的ndoS49和ndoS周圍的基因的對比。
[0023]圖5.EndoS49和其他細菌內(nèi)切糖苷酶的系統(tǒng)發(fā)生分析。
[0024]圖6.在用EndoS或EndoS49消化、隨后用IdeS消化,再測定阿伐斯汀(Avastin)和愛必妥(Erbitux)的SDS PAGE凝膠。
[0025]序列簡述
SEQ ID NO:1是從化膿性鏈球菌M49血清型NZ131中分離的EndoS49多肽的氨基酸序列。
[0026]SEQ ID NO: 2是衍生自SEQ ID NO:1的序列的經(jīng)修飾EndoS49多肽(E186L)的氨
基酸序列。
[0027]SEQ ID NO:3是編碼EndoS49多肽的核苷酸序列。
[0028]SEQ ID NO:4是分離自化膿性鏈球菌APl的IdeS的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0029]一般多肽特性
本發(fā)明涉及新的多肽EndoS49。本發(fā)明還提供利用細菌蛋白質(zhì)EndoS49和IdeS以及其他蛋白質(zhì)的各種方法。術語蛋白質(zhì)、肽和多肽在本發(fā)明中可互換使用。要理解的是，本發(fā)明的某些多肽和方法需要具有內(nèi)切糖苷酶活性的EndoS49，而本發(fā)明的其他多肽和方法需要缺乏所述活性的經(jīng)修飾EndoS49多肽。
[0030]以下部分設計本發(fā)明的所有多肽的一般特性，特別涉及包含在本發(fā)明的多肽內(nèi)的氨基酸序列的變化、改變、修飾或衍生。要理解的是，如本文中所描述的多肽的這些變化、改變、修飾或衍生要滿足的條件是這些多肽保留如可能在說明書的后續(xù)部分指出的任何進一步要求的活性或特征。[0031]本發(fā)明的多肽變體可通過特定水平的氨基酸一致性來定義，這將在下文更詳細地描述。氨基酸一致性可利用合適的算法來計算。例如，F(xiàn)ILEUP和BLAST算法可被用來計算同源性或排列序列(例如識別等價或?qū)蛄?(通常依賴它們的默認設置)。例如，如在Altschul S.F.(1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S， F et al (1990) J MolBiol 215:403-10 中所描述的。進行 BLAST 分析的軟件可從 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)獲取。該算法包括首先識別高分值序列對(HSP)，這通過在查詢序列中識別長度為W的短單字來進行，當與數(shù)據(jù)庫序列中的相同長度單字比對時，這些短單字匹配或滿足一些正值閾值分值T。T被稱為相鄰單字分值閾值(見以上Altschul等)。這些最初的相鄰單字命中結(jié)果用作啟動搜索的種子，以尋找含有它們的HSP。單字命中結(jié)果然后沿每個序列的兩個方向延伸，直到可以增加累計比對分值。單字命中沿兩個方向的延伸在下列情況下停止:累計排列分值從所達到的最大值下降了 X ;由于一種或多種負分殘基排列的累計作用，累計分值為零或以下；或者到達序列的終點。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對的敏感性和速度。BLAST程序使用以下默認值:單字長度(W)為11，BL0SUM62計分矩陣(見Henikoff and Henikoff (1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89: 10915-10919)比對
(B)為50，期望值(E)為10，M = 5，N = 4，雙鏈都進行比較。
[0032]BLAST算法在兩個序列間進行相似度的統(tǒng)計學分析；參見例如Kar I in andAltschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90: 5873-5787。BLAST 算法提供的相似度的一個量度是最小總和概率(P(N))，它預示兩種核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的可能性。例如，如果在第一序列與第二序列的比較中，最小總和概率小于約0.1，更優(yōu)選地小于約0.01，最優(yōu)選地小于約0.001，那么認為該第一序列與第二序列是相似的?；蛘撸琔ffGCG軟件包提供了 BESTFIT程序，該程序可被用來計算同源性(例如基于其默認設置使用)(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395)。
[0033]要理解的是，本發(fā)明的多肽變體也包括取代變體。取代變體優(yōu)選地涉及一個或多個氨基酸被相同數(shù)目的氨基酸替換并形成保守氨基酸取代。例如，一個氨基酸可悲具有相似性質(zhì)的另一氨基酸取代，例如另一堿性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一帶電氨基酸、另一親水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一極性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸?？杀挥脕磉x擇合適的取代的主要的20種氨基酸的一些性質(zhì)如下所示。
【權利要求】
1.一種多肽，包括 (a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列； (b)與SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少50%—致性并具有內(nèi)切糖苷酶活性的變體；或 (c)它們的任一個的具有內(nèi)切糖苷酶活性的片段。
2.一種能夠結(jié)合至IgG并且不具有內(nèi)切糖苷酶活性的多肽，所述多肽包括
(a)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列； (b)與SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少50%—致性的變體，其中等價于第186位點的谷氨酸的氨基酸被取代；或 (c)它們的任一個的片段。
3.一種多核苷酸，包含編碼權利要求1或權利要求2的多肽的序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的多核苷酸，其包括 (i)SEQ ID NO:3或其互補序列； (?)在嚴格條件下與(i)中定義的序列雜交的序列； (iii)由遺傳密碼子造成與(i)或(ii)中定義的序列簡并的序列； (iv)與(i)、(ii)或(iii)中定義的序列具有至少60%—致性的序列； (v)序列(i)、(ii)、(iii)或(iv)的任一個的片段，并且該片段編碼具有內(nèi)切糖苷酶活性的多肽；或 (vi)序列(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(V)的任一個的變體，該變體包含位于編碼的氨基酸的第186位點或其等價位點處的谷氨酸的取代，并且該變體編碼不具有內(nèi)切糖苷酶活性但能夠結(jié)合至IgG的多肽。
5.—種表達載體,包含權利要求3或4中定義的多核苷酸。
6.一種水解糖蛋白的聚糖的方法，該方法包括將所述糖蛋白與權利要求1中定義的多肽一起溫育。
7.一種評價糖蛋白的糖基化狀態(tài)的方法，該方法包括將糖蛋白與權利要求1的多肽一起溫育，并分析所產(chǎn)生的產(chǎn)物。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述方法包括: (a)將所述糖蛋白與權利要求1的多肽接觸從而水解糖蛋白的聚糖； (b)將所述聚糖與去糖基化的蛋白質(zhì)分離； (C)分析所產(chǎn)生的所述聚糖和/或去糖基化的蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權利要求6或7的任一項的方法，其中所述糖蛋白包含IgG抗體或單克隆IgG抗體。
10.一種從含IgG的樣品中分離IgG的方法，所述方法包括: (a)將所述含IgG的樣品與缺乏IgG內(nèi)切糖苷酶活性的EndoS49多肽接觸，從而允許形成IgG-EndoS49多肽復合物； (b)從被接觸的樣品中分離所述EndoS49； 從而獲得分離的IgG。
11.一種確定樣品中是否存在IgG的方法,該方法包括: (a)將所述樣品與缺乏IgG內(nèi)切糖苷酶活性的EndoS49多肽接觸，從而允許形成IgG-EndoS49多肽復合物； (b)任選地從被接觸的樣品中分離所述EndoS49;和 (c)確定被分離的EndoS49是否結(jié)合至IgG； 從而確定樣品中是否存在IgG。
12.根據(jù)權利要求10或11所述的方法，其中所述EndoS49多肽包括: (a)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列； (b)與SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少50% —致性且具有IgG結(jié)合活性的變體；或 (c)它們的任一個的具有IgG結(jié)合活性的片段。
13.根據(jù)權利要求10至12的任一項所述的方法，其中所分離或檢測的IgG為其天然的、功能上有活性的形式。
14.根據(jù)權利要求10至13的任一項所述的方法，其中所分離或檢測的IgG包含IgG亞類IgGp IgG2, IgG3和IgG4的至少一個、優(yōu)選兩個、三個或所有四個亞類。
15.根據(jù)權利要求10至14的任一項所述的方法，其中步驟(a)額外地包括將所述樣品與能夠結(jié)合至EndoS49多肽的磁性納米顆粒群接觸，并且其中步驟(b)包括在被接觸的樣品上進行磁場分離。
16.一種評價含IgG的樣品的糖基化狀態(tài)或功能質(zhì)量的方法，所述方法包括獲取所述含IgG的樣品的第一和第二子樣品，其中權利要求10或12至14的任一項中的步驟(a)和(b)被施用至第一子樣品，并且權利要求10或12至14的任一項中的步驟(a)和(b)被施用至第二子樣品，只是EndoS49多肽被能夠結(jié)合未糖基化的和/或未變性的、失活的IgG的另一種IgG結(jié)合試劑替代，該方法進一步包括: (a)定量結(jié)合至第一子樣品中的EndoS49多肽的IgG的量，以及結(jié)合至第二子樣品中所述另一種IgG結(jié)合試劑的IgG的量；和 (b)比較(c)中測定的被結(jié)合的IgG的兩個量； 從而評價含IgG的樣品的糖基化狀態(tài)或功能質(zhì)量。
17.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述另一種IgG結(jié)合試劑包含蛋白質(zhì)G和/或蛋白質(zhì)A。
18.—種從含IgG的樣品分離Fab片段的方法，所述方法包括: (a)將所述含IgG的樣品與IdeS和EndoS49多肽接觸； (b)將所述IdeS和所述EndoS49多肽與被接觸的樣品分離； 從而分離Fab片段。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中步驟(a)額外地包括將所述樣品與能夠結(jié)合至IdeS多肽和EndoS49多肽的磁性納米顆粒群接觸，其中步驟(b)包括在被接觸的樣品上進行磁場分離，和/或其中EndoS49多肽是權利要求12中定義的EndoS49多肽。
20.一種從含IgG的樣品中分離Fe片段的方法，所述方法包括: (a)將所述含IgG的樣品與IdeS接觸； (b)從步驟(a)中獲得的混合物中分離IdeS，從而分離Fab片段和Fe片段； (c)將所述Fab片段和Fe片段與EndoS49多肽接觸從而允許形成Fe片段_EndoS49多肽復合物；(d)從步驟(c)中獲得的混合物中分離所述Fe片段-EndoS49多肽復合物；以及 (e)從步驟(d)中獲得的所述Fe片段-EndoS49多肽復合物中分離Fe片段。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中步驟(a)額外地包括將所述樣品與能夠結(jié)合至IdeS的磁性納米顆 粒群接觸，步驟(C)額外地包括將步驟(b)中獲得的分離的Fab片段和Fe片段與能夠結(jié)合至EndoS49多肽的磁性納米顆粒群接觸，其中步驟(b)和(d)包括分別在被接觸的樣品或分離的Fab片段和Fe片段上進行磁場分離，和/或其中EndoS49多肽是權利要求12所定義的EndoS49多肽。
22.根據(jù)權利要求18至21的任一項所述的方法，所述方法包括在步驟(a)之前進行: (i)將所述含IgG的樣品與權利要求12中定義的EndoS49多肽接觸，從而允許形成IgG-EndoS49多肽復合物； (ii)從被接觸的樣品中分離所述IgG-EndoS49多肽復合物； (iii)從IgG-EndoS49多肽復合物洗脫IgG，從而獲得含IgG的樣品； 其中步驟(a)和(b)對步驟(iii)中獲得的含IgG的樣品進行。
23.一種從含IgG的樣品中分尚IgG的試劑盒，所述試劑盒包括: (a)權利要求12中定義的EndoS49多肽；以及任選地 (b)從樣品中分離所述EndoS49多肽的裝置。
24.一種確定樣品中是否存在IgG的試劑盒，所述試劑盒包括: (a)權利要求12中定義的EndoS49多肽；以及任選地 (b)從樣品中分離所述EndoS49多肽的裝置。
25.一種評價含IgG的樣品的糖基化狀態(tài)或功能質(zhì)量的試劑盒，所述試劑盒包括: (a)權利要求12中定義的EndoS49多肽； (b)能夠結(jié)合變性的和/或去糖基化的IgG的另一種IgG結(jié)合試劑； (c)從樣品中分離所述EndoS49多肽和所述另一種IgG結(jié)合試劑的裝置。
26.根據(jù)權利要求25所述的試劑盒，其中所述另一種IgG結(jié)合試劑包含蛋白質(zhì)G和/或蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)A/G。
27.用于分離IgG的Fab片段或Fe片段的試劑盒，所述試劑盒包括:
(a)IdeS； (b)EndoS49多肽；和 (c)從樣品中分離所述IdeS和所述EndoS49多肽的裝置。
28.根據(jù)權利要求27所述的試劑盒，其中EndoS49多肽是權利要求12中定義的所述EndoS49 多肽。
29.根據(jù)權利要求23至28的任一項所述的試劑盒，其中用于從樣品中分離所述EndoS49多肽、所述另一種IgG結(jié)合試劑或所述IdeS的裝置是磁性納米顆粒群,其中每個磁性納米顆粒群能夠結(jié)合所述多肽/試劑/蛋白質(zhì)中的至少一種，并且任選地，其中所述試劑盒還包括在樣品上進行磁場分離的說明書。
【文檔編號】C12N9/24GK103946377SQ201280044106
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年9月12日 優(yōu)先權日:2011年9月13日
【發(fā)明者】馬提斯·考林, 瑪利亞·奧宏, 喬納森·斯約根 申請人:季諾維斯公司