一種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用。一種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。編碼所述內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明所述的褐藻膠裂解酶AlgL-5降解褐藻膠過程中寡糖主產(chǎn)物包括不飽和二糖、不飽和三糖、和不飽和四糖不飽和五糖。酶的最小不飽和寡糖底物是五糖，最小不飽和寡糖產(chǎn)物是二糖。重組酶的性質(zhì)穩(wěn)定，具備一定工業(yè)應(yīng)用的潛質(zhì)。
【專利說明】一種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 褐藻膠是由a -L-古羅糖醒酸（Guluronic acid, G)和β -D-甘露糖醒酸 (Mannuronic acid, Μ)兩種糖單元通過糖苷鍵鏈接而成的線性多糖，分子內(nèi)聚M段、聚G段 和Μ/G混合段交替排列。通常，褐藻膠由海帶、馬尾藻等食用型褐藻加工制得。銅綠假單胞 菌、棕色固氮菌等微生物能分泌具有乙?；揎椀暮衷迥z。
[0003] 大型海藻來源的褐藻膠，與瓊膠、卡拉膠并稱產(chǎn)量最大、用途最廣的三大海洋多 糖，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥和食品行業(yè)。最新研究表明：用褐藻膠制備的聚M段寡糖藥物 "971"能抑制β淀粉樣細(xì)胞的聚集和細(xì)胞毒性，正用于抗阿爾茲海默癥的二期臨床研究； 聚G寡糖可與抗生素協(xié)同抑制臨床多耐藥致病菌。因此，組成特殊、聚合度特定的褐藻膠寡 糖具有重要應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，實(shí)現(xiàn)這類寡糖的高效制備具有重要意義。
[0004] 褐藻膠裂解酶通過β -消去機(jī)制催化褐藻膠分子內(nèi)糖苷鍵的斷裂，產(chǎn)生非還原性 末端含有共軛結(jié)構(gòu)且在232nm附近具有特征吸收的系列寡糖。與化學(xué)降解相比，褐藻膠的 酶法降解具有條件溫和、易控制，且底物選擇性強(qiáng)等特征，因而具有推廣應(yīng)用的潛質(zhì)。已發(fā) 現(xiàn)的褐藻膠裂解酶主要分離自海螺消化系統(tǒng)、海藻降解菌或海藻病毒等。受限于天然褐藻 膠裂解酶的產(chǎn)量低，轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)褐藻膠裂解酶雖易提高產(chǎn)量，但多數(shù)酶的水溶性、活性較差 等綜合因素的影響，直至今日，與β -瓊膠酶、纖維素酶等同類產(chǎn)品相比，少見廣泛應(yīng)用的 商品化褐藻膠裂解酶。
[0005] 中國專利文獻(xiàn)CN102994407A(申請?zhí)?01110424529. 2)公開了一種內(nèi)切褐藻膠裂 解酶Alg2A的基因序列及其制備方法與應(yīng)用。該發(fā)明所涉及的褐藻膠裂解酶Alg2A來源 土壤新分離菌株Flavobacterium sp.S20。該發(fā)明還提供了一種制備該新型褐藻膠裂解酶 的方法，即利用基因工程的技術(shù)方法，將該新褐藻膠裂解酶的基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載 體上，獲得可異源表達(dá)該酶的大腸桿菌重組菌株，用該菌株異源表達(dá)制備的褐藻膠裂解酶 Alg2A，具有降解褐藻酸鈉制備褐藻酸鈉寡糖的功能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶及其編碼基因與應(yīng) 用。該酶能降解褐藻膠并最終產(chǎn)生以不飽和二糖、不飽和三糖及不飽和四糖為主產(chǎn)物的系 列寡糖，且摩爾比約為1:2. 7:2. 8 ;該酶最小的不飽和寡糖底物是五糖，最小的不飽和寡糖 產(chǎn)物是二糖；該酶以內(nèi)切方式降解不飽和五糖，產(chǎn)生等量的不飽和二糖與不飽和三糖，且不 飽和二糖產(chǎn)生自底物的非還原性末端。
[0007] -種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5,氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 上述內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5的編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] -種重組表達(dá)載體，在表達(dá)載體中插入了上述內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5的編 碼基因。
[0010] 一種重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在宿主細(xì)胞或細(xì)胞系中插入了上述內(nèi)切型褐藻膠裂 解酶AlgL-5的編碼基因。
[0011] 上述內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5在分解褐藻膠、褐藻膠寡糖或制備不飽和寡糖 中的應(yīng)用。
[0012] 有益效果
[0013] 1、本發(fā)明所述的褐藻膠裂解酶AlgL-5，由火色桿菌屬細(xì)菌（Flammeovirga ya eyamenSiS)MY04的基因組編碼，是細(xì)菌中首次報(bào)道的內(nèi)切型褐藻膠裂解酶，且酶的性質(zhì) 穩(wěn)定，具備工業(yè)應(yīng)用的潛質(zhì)。
[0014] 2、本發(fā)明制備的內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5對褐藻膠的比活可達(dá)到940U/mg，適 用于系列不飽和寡糖的生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1、褐藻膠裂解酶AlgL-5功能模塊構(gòu)成的BLAST分析結(jié)果；
[0016] 圖2、重組外切型褐藻膠裂解酶rAlgL-5表達(dá)及純化情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳 圖（SDS-PAGE);
[0017] 其中：M、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶自上至下大小為116kD，66. 2kD，45kD，35kD， 25kD，18. 4kD，14. 4kD ;泳道1、對照菌株破壁前菌體，上樣量10 μ L，泳道2、重組菌破壁前菌 體，上樣量10 μ L，泳道3、重組菌破壁后上清，上樣量10 μ L，泳道4、經(jīng)鎳柱純化的rAlgL-5， 上樣量10 μ L ;
[0018] 圖3、溫度對重組褐藻膠裂解酶rAlgL-5的活性影響曲線；
[0019] 圖4、pH值對重組褐藻膠裂解酶rAlgL-5的活性影響曲線；
[0020] 圖5、溫度對重組褐藻膠裂解酶rAlgL-5的穩(wěn)定性影響曲線；
[0021] 圖6、pH值對重組褐藻膠裂解酶rAlgL-5的穩(wěn)定性影響曲線；
[0022] 圖7、金屬離子對重組褐藻膠裂解酶rAlgL-5活性的影響柱形圖；
[0023] 圖8、用重組褐藻膠裂解酶rAgaL-5降解褐藻酸鈉后寡糖產(chǎn)物的分子凝膠色 譜-HPLC分析圖；（1)DP2,不飽和二糖；（2)DP3,不飽和三糖；（3)DP4,不飽和四糖；（4)DP5， 不飽和五糖；（5) DP6,不飽和六糖；
[0024] 圖9、用重組褐藻膠裂解酶rAgaL-5降解所制備系列不飽和寡糖的HPLC分析圖；
[0025] 圖10、外切型褐藻膠裂解酶rAlgL-5不同時(shí)間降解還原性末端被熒光標(biāo)記的不飽 和五糖的產(chǎn)物的HPLC分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例的闡述，是為了全面公開本發(fā)明如何實(shí)施的一些常用技術(shù)，而不是為 了限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。發(fā)明人已經(jīng)盡最大努力確保實(shí)施例中個(gè)參數(shù)的準(zhǔn)確性（例如 量，溫度，等等），但是一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差也應(yīng)該予以考慮。除非另有說明，本發(fā)明中分子 量是指重均分子量，溫度是攝氏度。
[0027] 生物材料來源
[0028] 火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04來源于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC NO. 2777,地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2008年11月27日。
[0029] 實(shí)施例1、火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株基因組DNA的提取
[0030] 將火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04接種至液體培養(yǎng)基YT04中，在 28°C、200rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)至600nm吸光值（0D_)為1.2 ;取培養(yǎng)菌液10mL，在 12, 000 Xg (g，地球引力常數(shù)）條件下離心15min，收集菌體沉淀；用IOmL的溶菌酶緩沖液 (IOmM Tris-HCl，pH8. 0)懸浮菌體,在12, OOOrmp條件下離心15min，收集菌體沉淀。
[0031] 上述液體培養(yǎng)基YT04的每升組分如下：
[0032] 胰蛋白胨10g、酵母提取物5. 0g、氯化鈉30g，水定容至1L，ρΗ7· 2。
[0033] 向上述菌體沉淀中，每管加入溶菌酶緩沖液6. OmL，得到約7. OmL的菌液，分別加 入濃度為20mg/mL的溶菌酶溶液各280 μ L，使溶菌酶終濃度為800 μ g/mL ;置于冰水浴中 I. 〇h，然后轉(zhuǎn)移至37°C水浴中，溫浴2h，至反應(yīng)體系粘稠；加入濃度為100mg/mL的十六烷基 磺酸鈉溶液〇. 41mL、lOOmg/mL的蛋白酶K溶液30 μ L，在52°C溫浴I. Oh ;加入Tris-平衡過 的酚/氯仿/異戊醇（體積比25 :24 :1)溶液7. 5mL，輕輕顛倒混勻；在10, 000 X g、4°C條件 下離心IOmin,收集上清，并加入I. OmL的NaAc-HAc (pH5. 2, 3. 0M)緩沖液，以及8. 5mL的無 水乙醇，充分混勻；用〇. 5mL的槍頭挑出絲狀DNA，轉(zhuǎn)移至I. 5mL的EP離心管中，以70%乙 醇（貯于-20°C )，洗滌2次，微離心后棄掉上清；在10, 000Xg、4°C條件下離心2min，徹底 棄掉上清；將DNA沉淀于無菌工作臺中風(fēng)吹干燥，然后用無菌去離子水在4°C過夜溶解DNA 樣品，制得基因組DNA。
[0034] 實(shí)施例2、火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis)MY04菌株基因組的掃描及其序 列分析。
[0035] 將實(shí)施例1制得的基因組DNA，采用焦磷酸測序技術(shù)進(jìn)行基因組的掃描 測序，由上海美吉生物公司完成。用NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)網(wǎng)站的在線軟件對DNA測序結(jié)果進(jìn)行分 析。所用到的 NCBI 網(wǎng)站的分析軟件是 Open Reading Frame Finder(0RF Finder, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST, http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)〇
[0036] 用上述生物學(xué)軟件分析的結(jié)果顯示，火色桿菌（Flammeovirga yaeyamensis) MY04菌株基因組DNA上攜帶一個(gè)褐藻膠裂解酶的編碼因 algL-5,基因 algL-5的編碼區(qū)長 1701bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示?；?algL-5所編碼的褐藻膠裂解酶AlgL-5共 含有566個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。用BLAST軟件在線分析，結(jié)果顯 示，褐藻膠裂解酶AlgL-5與Zobellia galactanivorans的基因組序列所編碼的由446個(gè) 氨基酸組成的褐藻膠裂解酶（NCBI注冊號：WP_013992548. 1)有42%的同源性，其如圖1所 示：蛋白質(zhì)的中段含有可結(jié)合碳水化合物的F5-F8-type C結(jié)構(gòu)域，C-端含有褐藻膠裂解酶 超級家族2中保守的催化結(jié)構(gòu)域。用生物學(xué)軟件Bi〇Edit7. 0. 5. 3進(jìn)行分析，顯示蛋白質(zhì) AlgL-5的理論分子量約為61kD。用信號肽在線預(yù)測軟件SignalP4. lServer(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)在線分析，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中不含有分泌型信號 肽。
[0037] 實(shí)施例3、基因 algL-5在大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中的重組表達(dá)
[0038] 以實(shí)施例1制得的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：
[0039] if 向引物 AlgL5-F :5, -CGGATCCGATGAACAACCAGTACAATG-3' (BamH I)；
[0040] 反向引物 AlgL5-R :5' -GCTCGAGGTGACTTACTTTTAGGTAAC-3' (Xho I)；
[0041] 正向引物AlgL5_F中下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)切酶BamH I位點(diǎn)，反向引物 AlgL5-R下劃線標(biāo)注的是限制性內(nèi)切酶Xho I位點(diǎn)。所用高保真DNA聚合酶Primerstar HS 購自中國大連寶生物公司，所用PCR反應(yīng)試劑按照該公司提供的產(chǎn)品說明進(jìn)行操作。
[0042] PCR 反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 110s，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min ;4°C穩(wěn)定15min。
[0043] 將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳回 收酶切后的PCR產(chǎn)物。將購于美國Invitrogen公司的產(chǎn)品pET-22b (+)質(zhì)粒DNA，用Xho I 和BamH I雙酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切后的產(chǎn)物片段。限制性內(nèi)切酶Xho I和 BamH I均購于中國大連寶生物公司，酶切所用到的酶與底物反應(yīng)的體系、溫度和時(shí)間，均按 照該公司提供的產(chǎn)品說明操作。
[0044] 將經(jīng)過Xho I和BamH I雙酶切的PCR產(chǎn)物，與同樣經(jīng)過雙酶切的pET-22b (+)質(zhì) 粒載體，在DNA連接酶的催化下進(jìn)行接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，涂布于含有 100 μ g/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)基固體平板上，37 °C培養(yǎng)16h后，挑取單克 ??；將單克隆接入含有IOOu g/mL氨節(jié)青霉素的液體Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì) 粒；將質(zhì)粒用正向引物AlgL5-F和反向引物AlgL5-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果得到大小為I. 7kb 的擴(kuò)增產(chǎn)物，初步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確；接著將該重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果表明，在 pET-22b(+)的BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)之間插入SEQ ID NO. 1所示的基因 algL-5,且插 入方向正確，所以進(jìn)一步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確，將該重組質(zhì)粒命名為pE22-AlgL5。
[0045] 將重組質(zhì)粒pE22-AlgL5轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)(購自美國Invitrogen公 司），然后按照該公司提供的操作步驟，使用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行重組瓊膠酶 rAlgL-5的誘導(dǎo)表達(dá)。并用Ni-瓊脂糖凝膠對rAlgL-5進(jìn)行純化，純化條件按照凝膠的產(chǎn)品 手冊操作。用聚丙烯酰胺凝變性膠電泳檢測重組瓊膠酶rAlgL-5的純化情況。結(jié)果如圖2 所示：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的BL21 (DE3)菌體中，rAlgL-5的產(chǎn)量不低于400mg/L菌體培養(yǎng) 物；純化后的重組瓊膠酶rAlgL-5在電泳膠上呈單一條帶，且位置與預(yù)測的分子量相吻合； 將純化后的rAlgL-5樣品裝入最小分子截留量為IOkDa的透析袋，在4°C環(huán)境中對緩沖液透 析，所說緩沖液的成分是50mM Tris、150mM NaCl，pH7. 5,制得重組酶rAlgL-5酶液。
[0046] 實(shí)施例4、重組酶rAlgL-5最適溫度的測定
[0047] 用去離子水配制質(zhì)量體積濃度為1. 2%的褐藻酸鈉底物溶液，加熱溶解后，置于 0°C、10°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、70°C水浴環(huán)境中降溫 lh。 向每900 μ L底物溶液中添加實(shí)施例3制得的重組酶rAlgL-5的稀釋液100 μ L，重組酶 rAlgL-5的稀釋液濃度為10 μ g/mL，混勻后繼續(xù)反應(yīng)，隔時(shí)取樣。每個(gè)溫度條件下6個(gè)平行 樣品，以沸水浴滅活的重組酶制劑為對照組。
[0048] 用DNS-還原糖法測定各反應(yīng)體系中新生成還原糖的濃度（OD54tl)，并計(jì)算平均值， 進(jìn)行偏差分析。最大吸收值對應(yīng)的反應(yīng)溫度為重組酶的最適溫度，相對酶活（RA)定義為： 各吸收值與最大吸收值的百分比。結(jié)果如圖3所示：rAlgL-5在40°C反應(yīng)時(shí)達(dá)到最大活力， 這表明重組酶rAlgL-5的最適反應(yīng)溫度是40°C。在O?20°C的活性高于在40°C時(shí)酶活的 50%，這表明rAlgL-5具有適冷的酶學(xué)性質(zhì)。
[0049] 實(shí)施例5、重組酶rAlgL-5最適pH的測定
[0050] 分別用濃度為50mM的NaAc-HAC緩沖液、50mM的NaH2PO 4-Na2HPO4緩沖液、50mM的 Tris-HCl緩沖液，分別與瓊脂糖配制質(zhì)量體積濃度（g/mL)為1.2%的瓊脂糖底物溶液，所 對應(yīng)的pH值分別為5、6,6、7、8,7、8、9、10三個(gè)區(qū)段，各pH值均在最適溫度下調(diào)定。將底 物加熱溶解后，置于最適溫度中降溫lh，然后向每900 μ L底物溶液中添加實(shí)施例4制得的 重組酶rAlgL-5的稀釋液100 μ L,混勻后開始反應(yīng),并隔時(shí)取樣。每個(gè)pH條件下6個(gè)平行 樣品，以沸水浴滅活的重組酶制劑為對照組。用DNS-還原糖法測定各反應(yīng)體系中新生成 的還原糖濃度（OD 54tl),并計(jì)算平均值和偏差。相對酶（RA)活定義為：各組平均吸收值與最 大吸收值的百分比。最大吸收值對應(yīng)的pH為重組酶的最適pH。結(jié)果如圖4所示：重組酶 rAlgL-5的最適反應(yīng)pH為7. 0。
[0051] 實(shí)施例6、重組酶rAlgL-5的溫度穩(wěn)定性分析
[0052] 將實(shí)施例3制得的重組酶rAlgL-5酶液在不同溫度（(TC?70°C )下熱處理Ih后， 分別與用蒸餾水配置的質(zhì)量體積濃度（g/mL)為1.2%的褐藻酸鈉，按1 :9(體積比）的比 例混合，然后在最適溫度下測定剩余酶活，以不經(jīng)過熱處理的酶液酶活定義為100%相對活 力。結(jié)果如圖5所示：重組酶rAlgL-5在低于40°C的溫度下預(yù)處理Ih后，仍然具有>90% 的殘余活性，表現(xiàn)出一定的熱穩(wěn)定性。
[0053] 實(shí)施例7、重組酶rAlgL-5的pH穩(wěn)定性分析
[0054] 將實(shí)施例3制得的重組酶rAlgL-5的酶液，在最適溫度（40°C )、不同的pH(pH5? 10)環(huán)境中分別預(yù)孵育Ih后，與質(zhì)量體積濃度（g/mL)為1.2%的褐藻酸鈉底物溶液按1 : 9 (體積比）的比例混合，然后在最適溫度下測定剩余酶活，以不經(jīng)過預(yù)處理的酶液酶活定 義為100%相對活力。結(jié)果如圖6所示，在pH5?9的范圍內(nèi)預(yù)處理lh，rAlgL-5酶活仍保 持80 %以上。這表明rAlgL-5對pH值耐受范圍較廣。
[0055] 實(shí)施例8、金屬離子對重組酶rAlgL-5活性的影響
[0056] 將用去離子水配置的質(zhì)量濃度為1. 2 %褐藻酸鈉底物、實(shí)施例3制得的重組酶 rAlgL-5酶液、以及水按5 :1 :4(體積比）的比例混合后，接著向反應(yīng)體系中添加不同的金 屬離子，添加的離子終濃度為ImM或1〇禮，然后在45°C反應(yīng)40min，按前述的DNS-還原糖 法測酶的活力。對照組為不加任何金屬離子時(shí)rAlgL-5的活性（設(shè)定為100%)。結(jié)果圖 7所示，在ImM或IOmM濃度下：（l)Na+、K+、Li +等三種一價(jià)金屬試劑對rAlgL-5的活性表現(xiàn) 為微弱的作用，Ag+具有顯著抑制作用；（2)Cu 2+、Hg2+、Pb2+等二價(jià)金屬例子，Cr3+、Fe 3+等三價(jià) 金屬離子對酶活具有抑制作用；（3) β -巰基乙醇有促進(jìn)活性，在IOmM濃度下使酶活提高至 135. 9%。
[0057] 實(shí)施例9、DNS-還原糖法測定重組酶rAlgL-5的酶活
[0058] 將用去離子水配置的質(zhì)量濃度為1. 2%的褐藻酸鈉、濃度為10 μ g/mL的重組酶 rAlgL-5酶液、150mmol/L的HAc-NaAc (pH6. 0)緩沖液以及水按1 :1 :1(體積比）的比例 混合后，40°C下反應(yīng)40min。將反應(yīng)產(chǎn)物在沸水浴中加熱lOmin，轉(zhuǎn)入冰水浴中5min，在 12, 000 X g、4°C條件下離心15min，收集上清；將一定體積的上清與等體積的DNS (3, 5-對硝 基二甲苯）-反應(yīng)液混勻，在沸水浴中加熱lOmin，降至室溫，在540nm測定吸收值。用分析 純葡萄糖醛酸鈉內(nèi)酯作標(biāo)準(zhǔn)品，同樣方法操作，繪制葡萄糖醛酸內(nèi)酯的摩爾濃度與OD54tl之 間的量效關(guān)系曲線。用購于上海生工生物工程有限公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒測定重組酶 rAlgL-5酶液的蛋白含量。按照國際標(biāo)準(zhǔn)定義計(jì)算酶的活力單位，即在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每分鐘 內(nèi)產(chǎn)生1 μ mol產(chǎn)物所需的酶量為1個(gè)IU。結(jié)果表明：重組rAlgL-5能以褐藻酸鈉為底物， 酶解并產(chǎn)生還原糖產(chǎn)物，酶活為450U/mg。
[0059] 實(shí)施例10、重組酶rAlgL-5降解褐藻酸鈉的產(chǎn)物的高效液相（HPLC)分析 [0060] 用去離子水配制質(zhì)量體積濃度（g/mL)為1. 2%的褐藻酸鈉底物，加熱溶解后，置 于40°C水浴環(huán)境中降溫lh。向每100 μ L底物中添加實(shí)施例^制得的重組酶rAlgL-5的 稀釋液100 μ L，混勻后繼續(xù)反應(yīng)，隔時(shí)取樣。將反應(yīng)產(chǎn)物在沸水浴中加熱lOmin，轉(zhuǎn)入冰水 浴中5!1^11。在12,000\8、41：條件下離心51^11，收集上清。
[0061] 用濃度為 0· 20mol/L 的 NH4HCO3 溶液，平衡 Superdex P印tidel0/300GL(GE 公司） 分子凝膠色譜柱，流速〇. 40mL/min，至少2柱床。將上述褐藻酸鈉的不同酶解時(shí)間的樣品， 以自動(dòng)進(jìn)樣器加載20 μ L/樣品，其它條件不變，232nm檢測。用HPLC操作軟件，分析各寡糖 組分的積分面積，計(jì)算相對摩爾濃度。
[0062] 如圖8所示，在上述條件下，褐藻酸鈉底物被降解后，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加， 具有232nm特征吸收的寡糖產(chǎn)物的含量逐漸增加，且相對含量趨于穩(wěn)定。這表明rAlgL-5 是褐藻膠裂解酶而非褐藻膠水解酶。酶解反應(yīng)的寡糖主產(chǎn)物是HPLC分析中出峰時(shí)間為 34. 8'、36. 0'、38. 2'、40. 5'和43. 2'的五個(gè)主產(chǎn)物。其中，出峰時(shí)間為38. 2'、40. 5'和 43. 2'的三個(gè)主產(chǎn)物，面積比穩(wěn)定為3:3:1，提示其摩爾比為3:3:1。
[0063] 實(shí)施例11、重組酶rAlgL-5降解褐藻酸鈉的產(chǎn)物的分子量鑒定
[0064] 按照實(shí)施例10所述，將共50mg褐藻酸鈉用rAlgL-5徹底酶解，樣品分批上樣、過 柱，并按照出峰時(shí)間分別收集單個(gè)寡糖樣品。將寡糖樣品分別集中后，反復(fù)冷凍干燥以脫 鹽。用無菌去離子水溶解所得寡糖樣品，進(jìn)行一級質(zhì)譜（MS)分析，確定各寡糖的相對分子 量。
[0065] 陰離子模式一級質(zhì)譜結(jié)果表明，重組酶rAlgL-5降解褐藻酸鈉后的寡糖主產(chǎn)物， 對應(yīng)實(shí)施例10中所述的出峰時(shí)間分別為38. 2'、40. 5'和43. 2'的、且在232nm具有特征 吸收的三個(gè)寡糖主產(chǎn)物，其ESI (-)-MS所顯示的分子量分別是703, 527, 351。這表明，這三 個(gè)寡糖主產(chǎn)物分別是rAlgL-5降解褐藻膠之后所產(chǎn)生的不飽和四糖（UDP4)、不飽和三糖 (UDP3)及不飽和二糖（UDP2)。結(jié)合圖9的結(jié)果，說明不飽和二糖是重組酶rAlgL-5降解褐 藻膠之后聚合度最小的的寡糖主產(chǎn)物。
[0066] 實(shí)施例12、重組酶rAlgL-5最小不飽和寡糖底物的分析
[0067] 用去離子水和實(shí)施例11所制備的不飽和五糖、不飽和四糖、不飽和三糖及不飽 和二糖，分別配置底物溶液，與濃度為1〇μ g/mL的重組酶rAlgL-5酶液、150mmol/L的 HAC-NaAc(pH6.0)緩沖液以及水按1 :1 :1(體積比）的比例混合后，40°C反應(yīng)0_12h。隔時(shí)取 樣，按照實(shí)施例10所述色譜操作條件，進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果如圖10所示，重組酶rAlgL-5 降解不飽和六糖（UDP6)之后產(chǎn)生不飽和四糖、不飽和三糖和不飽和二糖，降解不飽和五糖 (UDP5)之后產(chǎn)生等量的不飽和三糖和不飽和二糖，但與不飽和四糖、不飽和三糖或不飽和 二糖反應(yīng)前后無顯著變化。這表明，不飽和五糖是重組酶rAlgL-5的最小不飽和寡糖底物， 且rAlgL-5以內(nèi)切酶方式降解寡糖底物。
[0068] 實(shí)施例13、重組酶rAlgL-5酶切模式的熒光-高效液相色譜（HPLC)分析
[0069] 取約含10 μ g不飽和五糖的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸干。加入含過量鄰氨基苯甲酰胺（2-AB)、 硼腈化鈉的二甲亞砜（DMSO)溶液，混勻后置60°C水浴中溫育2h。旋轉(zhuǎn)蒸干，加入500μ L 去離子水溶解樣品，將樣品與200 μ L氯仿共振蕩，離心，收集上清。繼續(xù)用氯仿反復(fù)抽提， 不少于7次，得到還原性末端被熒光標(biāo)記了的不飽和五糖（2-AB-UDP5)。同樣方法標(biāo)記不飽 和褐藻膠寡糖的分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
[0070] 取上述 2-AB-UDP5 樣品、150mmol/L 的 HAc-NaAc (ρΗ6. 0)緩沖液、實(shí)施例 43 制得 的重組酶rAlgL-5的稀釋液，按照體積比1: 1:1混勻，置于40°C水浴中反應(yīng)0?12h，隔時(shí) 取樣。將反應(yīng)體系置沸水浴中l(wèi)〇min，轉(zhuǎn)至冰水浴5min，在12,000Xg、4°C條件下離心至少 15min。收集上清，作為重組酶rAlgL-5的寡糖降解產(chǎn)物。以預(yù)先在沸水浴中加熱IOmin的 rAlgL-5酶液，做陰性對照反應(yīng)。
[0071] 按照實(shí)施例10所述的色譜條件，將2-AB-UDP5及其不同酶解時(shí)間的樣品，以自動(dòng) 進(jìn)樣器加載20 μ L/樣品，其它條件不變，330nm激發(fā)，420nm檢測。用HPLC操作軟件，分析 各寡糖組分的積分面積，計(jì)算相對摩爾濃度。參照分子量標(biāo)準(zhǔn)物的信號，確定各寡糖的相對 分子量。
[0072] 如圖10所示，重組酶rAlgL-5降解還原性末端含有熒光標(biāo)記的2-AB-UDP5后，產(chǎn) 生等摩爾的含有熒光標(biāo)記的不飽和三糖（2-AB-UDP3)。這表明rAlgL-5作為內(nèi)切型褐藻膠 裂解酶，進(jìn)行酶解反應(yīng)時(shí)是從底物的非還原性末端釋放出最小產(chǎn)物不飽和二糖的。
【權(quán)利要求】
1. 一種內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5,氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 權(quán)利要求1所述內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5的編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. -種重組表達(dá)載體，在表達(dá)載體中插入了權(quán)利要求2所述內(nèi)切型褐藻膠裂解酶 AlgL-5的編碼基因。
4. 一種重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在宿主細(xì)胞或細(xì)胞系中插入了權(quán)利要求2所述內(nèi)切型 褐藻膠裂解酶AlgL-5的編碼基因。
5. 權(quán)利要求1所述內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5在分解褐藻酸鈉或制備系列不飽和寡 糖中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述內(nèi)切型褐藻膠裂解酶AlgL-5在降解不飽和褐藻膠寡糖中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P19/00GK104293754SQ201410469861
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】李福川, 韓文君, 方玉春, 程媛媛, 古靜燕 申請人:山東大學(xué)