一種具有過氧化氫酶活性的酶及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種具有過氧化氫酶活性的酶及其編碼基因。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)手段將該基因轉(zhuǎn)化入黑曲霉（Aspergillusniger)中，構(gòu)建得到了高效表達(dá)該酶的重組菌株，從而有利于實(shí)現(xiàn)該酶的工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。本發(fā)明所述酶的氨基酸序列為SEQIDNO：1,其最適作用溫度為60°C，最適作用pH為6.0，能有效的催化過氧化氫分解生成水和氧氣。利用本發(fā)明所述酶處理H202，15min時(shí)即將H202全部分解，性能優(yōu)于市售產(chǎn)品，因此可廣泛的運(yùn)用于食品、紡織、醫(yī)藥、造紙等工業(yè)生產(chǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】一種具有過氧化氫酶活性的酶及其編碼基因

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能基因篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有過氧化氫酶活性的酶及其 編碼基因。

【背景技術(shù)】
[0002] 過氧化氫酶（Hydrogen Peroxidase)又稱觸酶（Catalase,簡稱CAT)，是一類催化 底物氧化還原反應(yīng)的酶，其主要功能是催化過氧化氫分解成氧氣和水。CAT廣泛分布于動(dòng) 物、植物組織中和絕大多數(shù)的好氧菌和少數(shù)的厭氧微生物中。動(dòng)物肝臟、紅細(xì)胞、植物葉綠 體以及放線菌、細(xì)菌、真菌也含有CAT，其中哺乳動(dòng)物組織中CAT含量差異較大，肝臟和結(jié)締 組織含量分別為最高和最低，CAT在上述細(xì)胞組織中主要是與細(xì)胞器如線粒體和過氧化物 體結(jié)合的形式存在，紅細(xì)胞中則以可溶的狀態(tài)存在。不同來源的CAT的性質(zhì)差距較大，從動(dòng) 植物和人體內(nèi)獲得的CAT的熱穩(wěn)定性較差；而微生物來源的CAT的穩(wěn)定性相對表現(xiàn)較好，此 夕卜，微生物還具有易培養(yǎng)、來源廣、生產(chǎn)周期短且成本低等優(yōu)點(diǎn)。
[0003] 目前國內(nèi)市場的過氧化氫酶主要來源動(dòng)植物提取，而來自微生物細(xì)胞提取的也較 多。2001年廖文俊等從基因工程菌表達(dá)產(chǎn)物中分離純化獲得過氧化氫酶。王凡強(qiáng)等從重 組大腸桿菌培養(yǎng)后的菌體破碎液中，經(jīng)熱處理，硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-SephadexA-50離子 交換層析、HiPrepl6/10Phenyl疏水作用層析、Superdex200HR10/30凝膠層析提取后得到 電泳純的過氧化氫酶。2005年張心齊等從一株低度嗜鹽嗜堿芽孢桿菌中純化得到一種堿 性過氧化氫酶。2009年T · C ·道奇K · M ·霍夫曼等在里氏木霉中表達(dá)來自黑曲霉的catR 基因，獲得與黑曲霉中catR表達(dá)相比提高的過氧化氫酶產(chǎn)量（中國專利號(hào)101960006)。 2011年Chen Jian等通過在芽孢桿菌發(fā)酵中補(bǔ)加六偏磷酸鈉使得發(fā)酵液過氧化氫酶活性 達(dá)19700U/mL(美國專利號(hào)8, 722, 364)。2013年屈玲等對幽門螺桿菌的過氧化氫酶進(jìn)行重 組表達(dá)和純化，經(jīng)親和層析的重組蛋白純度約為85%。因此，微生物過氧化氫酶必將成為過 氧化氫酶工業(yè)化發(fā)展的重要方向，利用基因工程技術(shù)手段開發(fā)出新型活性高的過氧化氫酶 菌株具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種具有過氧化氫酶活性的酶及其編碼基因。本發(fā)明采用基 因工程技術(shù)手段將該酶的編碼基因轉(zhuǎn)化入黑曲霉（Aspergillus niger)中，構(gòu)建得到了高 效表達(dá)該酶的重組菌株，從而有利于實(shí)現(xiàn)該酶的工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明一方面提供了一種基因，所述的基因編碼如下的酶：
[0006] 1)其氨基酸序列為SEQ ID NO :1 ;
[0007] 2)在1)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸得到的，具有1)中 酶的活性，由1)所衍生的酶。
[0008] 上述的基因是從粉紅粘帚霉（Gliocladium roseum)中分離的。
[0009] 上述基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
[0010] 本發(fā)明提供了 一種表達(dá)載體，其包含上述基因的核苷酸序列。
[0011] 本發(fā)明提供了一種表達(dá)宿主細(xì)胞，其攜帶有上述的表達(dá)載體。
[0012] 上述表達(dá)宿主細(xì)胞為黑曲霉（Aspergillus niger)。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。
[0014] 上述酶在降解過氧化氫中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明所述酶具有過氧化氫酶活性，其最適作用溫度為60°C，最適作用pH為6. 0， 能有效的催化H2O2分解生成水和氧氣。利用本發(fā)明的酶處理H2O 2,15min時(shí)即將H2O2全部 分解；而對照組所述市售過氧化氫酶，在20min時(shí)才將H 2O2全部分解，且其在5min，lOmin， 15min時(shí)對H2O 2的分解效果均低于本發(fā)明所述過氧化氫酶。本發(fā)明的酶性能優(yōu)于市售產(chǎn)品， 因此可廣泛的運(yùn)用于食品、紡織、醫(yī)藥、造紙等工業(yè)生產(chǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1 :本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pGm-2092圖譜。
[0017] 圖2 :陽性轉(zhuǎn)化子黑曲霉ZL-3發(fā)酵液上清SDS-PAGE電泳圖，其中箭頭所指87. 2KD 處的蛋白條帶即為本發(fā)明的酶。
[0018] 圖3 :本發(fā)明分離的酶作用溫度-酶活曲線圖。
[0019] 圖4 :本發(fā)明分離的酶作用pH-酶活曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。但實(shí)例僅限于說明，并不限于此。下 列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook) 等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。本領(lǐng)域 相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要 求范圍不限于所提供的案例。
[0021] 實(shí)施例1 :基因的克隆
[0022] 以粉紅粘帚霉（Gliocladium roseum)全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中 PCR過程所用到的引物分別為：
[0023] 正向引物：
[0024] 5' -GTTAATTAAAGGATGCCTGAGCACACACTCTCCCCCC-3' '
[0025] 反向引物：
[0026] 5' ~TGCTCTAGACTAGTGTACGTTGTTCTGCTTGCGG~3,；
[0027] 其中下劃線處分別表示Pacl、Xbal兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
[0028] PCR 擴(kuò)增條件為：98°C 30s ;98°C IOs ;72°C I. 5min30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin,所用的 DNA聚合酶為Phusion DNA聚合酶；利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0029] 用Pacl和Xbal兩種限制性內(nèi)切酶分別對PCR產(chǎn)物以及載體pGm進(jìn)行酶切；運(yùn)用 膠純化試劑盒對這兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，并用T 4DNA連接酶連接上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物；將連 接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，用氨芐青霉素進(jìn)行選擇。為確保正確，對若干個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn) 行菌落PCR并進(jìn)行測序。
[0030] 測序結(jié)果顯示，上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列為SEQ ID NO :2 ;其編碼的氨基酸 序列為SEQ ID NO :1 ;多個(gè)克隆的測序結(jié)果都一致。
[0031] 經(jīng)NCBI Blast 比對發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO : 1 與來源于 Pseudogymnoascus destructans 的過氧化氫酶同源性最高，為64%，與來源于Beauveria bassiana的過氧化氫酶同源性為 63%。因此表明本發(fā)明應(yīng)是一個(gè)編碼過氧化氫酶的新等位基因。
[0032] 使用質(zhì)粒中量制備試劑盒（Axygen)從測序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中提取重組 質(zhì)粒，命名為pGm-2092(質(zhì)粒圖譜見圖1)。
[0033] 實(shí)施例2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黑曲霉Gl菌株及驗(yàn)證
[0034] 吸取黑曲霉（Aspergillus niger)Gl孢子懸浮液于CMA平板中心（9cm培養(yǎng)皿）， 待菌落長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，切1/4大小的培養(yǎng)基于200mL CM液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm 的條件培養(yǎng)14?16h。
[0035] 用無菌的Miracloth濾布收集菌體，并用solution A沖洗一次，在無菌條件下用 棉簽將其轉(zhuǎn)移到40ml的裂解液中，在30°C、200rpm條件下裂解兩個(gè)小時(shí)，用顯微鏡觀察原 生質(zhì)體的形成情況。
[0036] 用無菌的Miracloth濾布過濾上述裂解液，用兩個(gè)50ml無菌離心管收集原生質(zhì) 體并用solution B沖洗定容使每管大約25ml。在2000rpm條件下離心5min棄去上清，用 20ml solution B對沉淀再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于IOmLsolution B中，并用血球 計(jì)數(shù)板對原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。將原生質(zhì)體再次離心并棄去上清液，根據(jù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果，力口 入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質(zhì)體數(shù)目在I X IO7個(gè)/mL左右。
[0037] 在冰上向預(yù)先冷卻的15ml離心管中加入100 μ L上述原生質(zhì)體、10 μ L重組質(zhì)粒 pGm-2092、12.5yL solution C冰浴20min。與此同時(shí)將預(yù)先配制好的上層試管MMSA融化 并置于55°C水浴中。
[0038] 取出冰浴中的15ml離心管，向其加入Iml solution C、2ml solution B并混勻后 作為混合液。
[0039] 向3個(gè)融化的上層麗SA試管中的每一個(gè)中加入Iml上述混合液混勻并立即倒于 MMSA平板中，將此平板在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10d直到長出轉(zhuǎn)化子。
[0040] 將長出的轉(zhuǎn)化子菌株接入到二次篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至長出黑色菌落；提取 菌落的基因組DNA，并按照實(shí)施例1所述PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；通過膠回收與測 序驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果正確的菌株即為陽性轉(zhuǎn)化子，將其中一株陽性轉(zhuǎn)化子命名為黑曲霉 ZL-3 (Aspergillus niger ZL-3)〇
[0041] Solution A :2. 5mLlM K2HPO4, 2. 5mLlM KH2PO4,48. 156g MgSO4,加入 dlH20 至終體 積500mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0042] Solution B :5mLlM Tris (ρΗ7· 5)，2. 77g CaCl2,109. 32g 山梨醇，加入 dlH20 至終 體積500mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0043] Solution C :250g PEG4000, 2. 77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7· 5)，加入 dlH20 至終體 積500mL，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0044] 裂解液：將 0· 6g 裂解酶（Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum，Sigma) 溶解于40mL溶液A中，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0045] MMSA 平板：0· 59g 乙酰胺（Sigma)，3. 4g CsCl (Sigma)，0· 52g KCl，I. 52g KH2PO4, 218. 5g山梨醇，Iml微量元素（見下），20g瓊脂，加入dlH20至終體積972. 5mL，高壓蒸汽滅 菌后加入用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2. 5mL20% MgS04。
[0046] MMSA 上層瓊脂試管：0· 59g 乙酰胺（Sigma)，3. 4g CsCl (Sigma)，0· 52g KCl， I. 52g KH2PO4, 218. 5g山梨醇，Iml微量元素（見下），IOg低熔點(diǎn)瓊脂糖，加入dlH20至終體 積972. 5mL，高壓蒸汽滅菌后，在培養(yǎng)基未凝固時(shí)，加入用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的 25II1L401%葡萄糖和2. 5II1L201% MgSO4，之后立即分裝于無菌試管中，每管10mL。
[0047] 微量元素：在 250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4 · 7H20,8. 8g ZnSO4 · 7Η20,0· 4g CuSO4 · 5Η20,0· 15g MnSO4 · 4Η20,0· Ig Na2B4O7 · IOH2O, 50mg (NH4) 6Μ〇7024 · 4Η20,0· 2mL 濃 HCl， 完全溶解后用dlH20定容至1L，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0048] CM平板：20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體積 IOOOmL,高壓蒸氣滅菌。
[0049] CM液體培養(yǎng)基：20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，加入dlH20至終體積 IOOOmL,高壓蒸氣滅菌。
[0050] 二篩培養(yǎng)基：0· 59g 乙酰胺（Sigma)，3. 4g CsCl (Sigma)，0· 52g KCl，I. 52gKH2P04， Iml微量元素，20g瓊脂，加入dlH20至終體積972. 5mL，高壓蒸汽滅菌后加入用0. 22 μ m的 微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2. 5mL20% MgS04。
[0051] 實(shí)施例3陽性轉(zhuǎn)化子菌株的發(fā)酵驗(yàn)證
[0052] 挑取陽性轉(zhuǎn)化子黑曲霉ZL-3,接種于20ml TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的 條件下培養(yǎng)5d ;所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在HOOOg條件下離心lOmin，收集上清 液；將上清液在濃度為10%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳分析。結(jié)果如圖2所示，箭頭所指 87. 2kDa處有一清晰的蛋白條帶，與本發(fā)明所述酶的理論分子量大小一致，從而說明所述酶 在黑曲霉ZL-3中得到有效表達(dá)。
[0053] TSB 發(fā)酵培養(yǎng)基：12g NaNO3,0· 5g KCl，I. 5g KH2PO4, 2. 05g MgSO4 · 7H20, 3. 5g NaH2PO4 · H20,45g胰蛋白大豆肉湯，70g檸檬酸鈉，Ig吐溫80, ImL微量元素（見下），加入 dlH20至終體積700mL，高壓蒸氣滅菌后加入300mL用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的40 % 麥芽糖。
[0054] 微量元素：在 250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4 · 7H20,8. 8g ZnSO4 · 7Η20,0· 4g CuSO4 · 5Η20,0· 15g MnSO4 · 4Η20,0· Ig Na2B4O7 · IOH2O, 50mg (NH4) 6Μ〇7024 · 4Η20,0· 2mL 濃 HCl， 完全溶解后用dlH20定容至1L，用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0055] 實(shí)施例4過氧化氫酶活性測定
[0056] 1、測定方法：紫外分光光度法
[0057] 2、測定的原理：過氧化氫在240nm波長下有強(qiáng)吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫， 使溶液的吸光度（A 24tl)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測量吸光度的變化速度可測出過氧化氫酶 的活性。
[0058] 3、測定過程：將紫外分光光度計(jì)通電后預(yù)熱30min，在吸收波長240nm處機(jī)械調(diào)零 后用磷酸鹽緩沖液調(diào)零。用5ml的移液管準(zhǔn)確移取2. 9ml底物溶液至Icm石英比色皿中， 用50-250ul的微量移液器移取IOOul待測樣品，加入上述石英比色皿中，搖勻后立即在吸 收波長240nm處測A值，每隔5s記錄一個(gè)A值，測定時(shí)間為30s.在Excel中將吸光度對時(shí) 間做一次方程曲線，選取曲線方程斜率K的絕對值計(jì)算酶活?？刂芀值在0. 0031-0. 0020 之間，若K不在此區(qū)域內(nèi)，需將樣品重新稀釋到合適倍數(shù)測定。
[0059] 4、酶活力計(jì)算：
[0060] 酶活力（IU/ml 或 IU/g) = NXKX4. 13X104
[0061] 式中：
[0062] N-稀釋倍數(shù)，
[0063] K-吸光度變化的曲線的斜率的絕對值，
[0064] 采用上述方法測得重組菌株黑曲霉ZL-3發(fā)酵上清液的酶活高達(dá)640. 15U/mL，也 說明了本發(fā)明所述酶具有過氧化氫酶活性。
[0065] 實(shí)施例5酶學(xué)性質(zhì)分析
[0066] 1、最適作用溫度
[0067] 以 NaH2PO4-Na2HPO4 為緩沖溶液（ρΗ7· 0)，分別在 30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C 條件下測定上述黑曲霉ZL-3發(fā)酵液上清的酶活，作溫度-酶活曲線（圖3)。從圖3可以看 出，本發(fā)明所述酶的最適作用溫度為60°C。
[0068] 2、最適作用pH
[0069] 以pH為0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液分別稀釋上述 黑曲霉ZL-3發(fā)酵液上清，并在60°C條件下測定上清的酶活，作pH-酶活曲線（圖4)。從圖 4可以看出，本發(fā)明所述酶的最適作用pH為6.0。
[0070] 實(shí)施例6本發(fā)明所述酶的實(shí)際應(yīng)用
[0071] 1、試劑：
[0072] 1)用 NaH2PO4-Na2HPO4 為緩沖溶液（ρΗ7· 0)配制濃度為 200mg/L H2O2IL ;
[0073] 3)本發(fā)明所述酶1000U/mL。
[0074] 2、儀器：
[0075] 容量瓶等玻璃儀器；BL-3IOA精密電子天平；DragonMed標(biāo)準(zhǔn)移液器100? IOOOul ;5?50ul ;DMI_010鉆石牌數(shù)字式石英電子秒表。
[0076] 3、測定方法：
[0077] 1)測定原理：
[0078] 過氧化氫酶能夠分解H2O2生成氧氣和水，將酶與H 2O2作用一段時(shí)間后，用H2O2試紙 測試殘余的H2O2量，殘余量越小說明過氧化氫酶的效果越好。
[0079] 2)具體測定：
[0080] 量取IOOmL H2O2溶液（200mg/L)，40°C水浴，預(yù)熱5min ;然后加入0· 5mL本發(fā)明所 述酶（1000U/mL)，立即計(jì)時(shí)（加液時(shí)開始計(jì)算時(shí)間）；加完酶液后，攪拌均勻，即得待測液； 分別于5!1^11、1〇1^11、151^11、2〇1^11時(shí)，將!1 202試紙（默克）浸于待測液中，186(3后取出，1586〇 后讀數(shù)。同時(shí)以市售過氧化氫酶產(chǎn)品作為對照組，稀釋至l〇〇〇U/mL，在相同添加量的情況 下，與本發(fā)明所述酶進(jìn)行效果比較。具體結(jié)果如表1所示：
[0081] 表1過氧化氫酶對H2O2濃度的影響
[0082]

【權(quán)利要求】
1. 一種基因，其特征在于，所述的基因編碼如下的酶： 1) 氨基酸序列為SEQ ID NO :1的酶， 2) 在1)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸得到的，具有1)中酶的 活性，由1)所衍生的酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
3. -種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體攜帶有權(quán)利要求1所述的基 因。
4. 一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的重組宿主細(xì)胞攜帶有權(quán)利要求3所述重組 表達(dá)載體。
5. 如權(quán)利要求4所述的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為黑曲霉。
6. 權(quán)利要求4所述的重組宿主細(xì)胞在降解過氧化氫中的應(yīng)用。
7. -種酶，其特征在于，所述的酶是由權(quán)利要求1所述的基因編碼的，其氨基酸序列為 SEQ ID NO :1。
8. 權(quán)利要求7所述的酶在降解過氧化氫中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/80GK104212820SQ201410469853
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】王華明, 張亮, 張煉敏, 趙彩熒 申請人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所