專利名稱：一種堿性內切葡聚糖酶基因及其重組酶和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種堿性內切葡聚糖酶基因及其重 組酶和應用。
背景技術：
內切葡聚糖酶(卩-l,4-內切葡聚糖酶，Endoglucanase/Endo-l ， 4-卩-Glucanase，
EC3.2丄4)是纖維素酶酶系的重要組分，可將纖維素分子從內部即在p-1,4糖苷 鍵將其切斷。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它往往不是 單種酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，它除了內切葡聚糖酶外，還包括外切 葡聚糖酶(P-l,4-外切葡聚糖酶，Cellobiohydrolase, CBH， EC3.2丄91)和(3-葡萄糖苷酶(BQ f3-Glucosidase， EC3.2丄21)。按催化反應的最適pH值，內切 葡聚糖酶可以分為酸性內切葡聚糖酶(最適pH3 5)、中性內切葡聚糖酶(最 適pH6 8)和堿性內切葡聚糖酶(最適pH8 10)。酸性內切葡聚糖酶主要由 絲狀真菌產生，其產生菌主要包括里氏木霉、康寧木霉、黑曲霉等。酸性內切 葡聚糖酶研究最早，然而，隨著工業(yè)應用范圍的不斷擴展和應用研究的不斷深 入，酸性內切葡聚糖酶也顯現(xiàn)出諸多不足，如堿性條件下酶活性較低或根本沒 有活性、穩(wěn)定性較差、pH值適應范圍窄，而且在酸性條件下處理紡織品后會 產生退色現(xiàn)象等，這極大限制了內切葡聚糖酶在堿性洗滌劑、紡織品酶洗整理 等工業(yè)中的應用。
堿性內切葡聚糖酶(又名堿性纖維素酶)主要由細菌產生。與由真菌產生 的酸性內切葡聚糖酶相比，由細菌產生的堿性內切葡聚糖酶具有其獨特的優(yōu)越 性(l)pH值適應范圍廣， 一般在pH值6 10之間均具有較高的活性；(2) 熱穩(wěn)定性好，可以耐受6(TC的高溫；(3)酶成分單一，主要酶活性成分為內 切葡聚糖酶，便于工業(yè)應用；(4)可用細菌發(fā)酵生產，發(fā)酵周期短；(5)可以 承受很高的pH值，作為洗滌用酶可使衣物經多次洗漆后手感、外觀等保持鮮 艷；(6)可以在中性環(huán)境中處理紡織品，不會造成紡織品退色等。因此，就洗
滌劑、紡織等工業(yè)而言，由細菌產生的中性和堿性內切葡聚糖酶有著傳統(tǒng)酸性 內切葡聚糖酶無可比擬的優(yōu)越性。
內切葡聚糖酶基因的克隆是深入研究酶作用機制及高產工程菌株構建的
基礎。1986年，F(xiàn)ukumori等首次報道了芽孢桿菌萬acz7/w sp. Strain 1139的堿 性內切葡聚糖酶基因的克隆和測序(Fukumori F, Kudo T, Narahashi Y, " J 1986, 132:2329 2335)。目前，國外共有近20個左右堿性內切 葡聚糖酶基因被克隆和測序，其中大部分來源于芽孢桿菌。國內對細菌內切葡 聚糖酶基因的研究相對滯后，尚未能達到產業(yè)化水平。就目前國內有關堿性內
切葡聚糖酶的研究水平來看，主要問題在于(l)酶活性還比較低，在國內 還不能達到工業(yè)化生產水平的要求；(2)對酶的純化、酶學性質研究還很少， 特別是對酶在洗滌劑中的性質研究很少，缺乏具有實際應用價值的酶；(3) 對酶基因的研究不夠深入。這些都阻礙了堿性內切葡聚糖酶的工業(yè)化生產應 用。因此，當前迫切需要解決的問題主要有兩個首先是提高產酶水平，可 通過現(xiàn)代基因工程的方法構建基因工程菌株，以提高酶產量；其次，通過基因 工程尋找酶學性質更優(yōu)并可在洗滌劑及紡織等領域能實際應用的重組酶。

發(fā)明內容
為了克服上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種堿性內切 葡聚糖酶基因III-3-a的基因序列及其氨基酸序列。本發(fā)明根據(jù)酶蛋白質譜分析 所得的肽段及其同源序列設計簡并引物，用PCR的方法成功克隆出堿性內切 葡聚糖酶的酶基因III-3-a。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al。該重組 酶III-3-Al比天然酶在洗滌劑中的穩(wěn)定性更強。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al的應用。
本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn) 一種堿性內切葡聚糖酶基因 m-3-a，所述酶基因序列如表l所示(也即序列表SEQUENCELISTING NO.l
所示的基因序列)
表l堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a酶基因序列 鄉(xiāng)ATGTTGCGCAAAAAGACAAAACAGTTGA'm'CTTCCACTCTTATTTTAGTTTTACT<formula>formula see original document page 7</formula>
所述堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a序列為一個完整的開放閱讀框(ORF)， 該開放閱讀框以起始密碼子ATG開始而以終止密碼子TAA結束，共包括2502 個核苷酸。其中，前90個核苷酸為信號肽編碼序列(ATGATGTTGCGCAAAAA
TTTCCAACAGCTCTAGCAGCA)。
上述堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a編碼的氨基酸序列如表2所示(即序列 表SEQUENCE LISTING N0.2所示的氨基酸序列)
表2堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a編碼的氨基酸序列 國LRKKTKOLJSSTLlLVLL丄SLFgTALAAEGNTREDNFNHLLGNDNVKRPSEAGALOLO EVDGOMTLVDQDGEKIOLRGMSTHGLOWFPEILNDNAYKALTNDWES麗IRLAMYVG ENGYASNPDLIKSRVIKGIDLA正NDMYVIVDWHVHAPGDPRDPVYAGAEDFFREIAALY PNNPHnYELANEPSSNNNGGAGlPNNEEGWNAVKEYADPIVEMLRESGNADDNinVGSP
FGVNGDSPNKELIAVDNE顧TLKISGLDVSNDVSDGNYWANARLSANGWGKSVDILGA
LYHYEVKINVRDITNVODDTLLRNMMnFADVOSDFAGRVFVDNVRFEVAATGP正PEPVDPGEEAPPVDEKEAAKEEREAARGAEKEEREAVKAEREVAREAAKEERETAKEEKKEAT 巡-。
堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a開放閱讀框編碼833個氨基酸，其中， MMLRKKTKQLISSTLILVLLLSLFPTALAA序列(前30個氨基酸)為基因編 碼的信號肽，其在成熟酶蛋白分泌時在Ala^位點被切除。因此，成熟的酶蛋 白從Gh^開始(用下劃線表示)，共計803個氨基酸，其理論分子量(MWt) 為89kD，酶蛋白的等電點(pl)為4.30。
上述重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al的制備方法，包括如下步驟
(1) 重組菌株構建
用PCR方法從S"c說^取ni-3(CGMCC No.2138 )的基因組DNA中克隆 出不含信號肽編碼序列的m-3-a酶基因全長，將其插入到原核表達載體 pET-28a(+)中，得到重組質粒pET-28a-m-3-a，并轉化大腸桿菌E.coli BL21 Star (DE3)菌株；經過篩選后得到高效表達的重組大腸桿菌菌株E.coli III-3-A1;
(2) 誘導表達
將篩選得到的重組大腸桿菌Eco// III-3-A1接種到50ml LB液體培養(yǎng)基中， 待OD值達到0.6時，加入終濃度為0.2mM的IPTG (異丙基-p-D-硫代半乳糖 苷)，于23'C條件下進行誘導培養(yǎng)，并于誘導培養(yǎng)12h加入0.5% (質量百分 比)的EDTA，誘導培養(yǎng)23h終止發(fā)酵；將發(fā)酵液用液氮反復凍融使細胞破碎， 10000r/min高速離心2min后去沉淀即得粗酶液。
(3) 重組堿性內切葡聚糖酶m-3-Al的分離純化 將粗酶液離心收集上清液后直接上用pH 8.0 Tris-HCl預平衡的DEAE
Sepharose CL-6B離子交換柱，用含濃度0.4 1M NaCl的pH 8.0 Tris-HCl以 180mHi"的流速進行梯度洗脫，收集重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al。
所述重組堿性內切葡聚糖酶III-3-A1具有序列表SEQUENCE LISTING NO.l所示的基因序列，具有序列表SEQUENCE LISTING N0.2所示的氨基酸序 列。
所述重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al的最適作用pH為8 10，最適作用溫度 為40 50。C， m-3-Al酶蛋白具有耐Na+、 K+、 Mg2+、 Cu2+、 Fe2+或Ca2+等金屬 離子的良好特性，并對SDS、 EDTA或EGTA等表面活性劑具有良好的耐受性。
所述重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al在洗滌劑和紡織等工業(yè)中的應用。該 重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al在終濃度為0.2% (質量百分比)的洗滌劑(市
售立白洗衣粉)中保存10min后其殘余酶活力無顯著損失，顯示重組堿性內切 葡聚糖酶III-3-Al在洗滌劑和紡織等工業(yè)中的良好應用潛力。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果
(1) 根據(jù)酶基因序列BLAST分析結果結合酶蛋白在分子量、等電點及 酶學特性等方面與已知蛋白的差異判斷，堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a為一新 發(fā)現(xiàn)的4-內切葡聚糖酶基因。
(2) 重組堿性內切葡聚糖酶m-3-Al對SDS具有非常良好的耐受性，與 天然堿性內切葡聚糖酶的酶活性受到SDS抑制有明顯不同。并且該重組堿性 內切葡聚糖酶III-3-Al在終濃度為0.2%的洗滌劑(市售立白洗衣粉)中保存 10min后其殘余酶活力無顯著損失。該重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al非常適 用于洗滌劑和紡織等工業(yè)。


圖1為基因組DNA的凝膠電泳圖。
其中Marker 1為BBI公司的100bp+1.5kb DNA Ladder的Marker; 2為
基因組DNA。
圖2為pET-28a(+)表達載體圖譜。
圖3為pET-28a(+)表達載體多克隆位點圖。
圖4為由PCR方法從Bacillus sp衛(wèi)I-3基因組DNA中擴增III-3-a基因圖。 圖5為重組質粒pET-28a-III-3-a的酶切檢驗圖。
其中，1.*重組質粒pET-28a-III-3-a經HindIII和EcoRI雙酶切的產物；
2:重組質粒pET-28a-III-3-a; 3: IH-3-a基因；M: DNA分子量標記。
圖6為不同時期加入EDTA對胞外酶活的影響圖。
圖7為EDTA添加量對胞外酶活的影響圖。
圖8為誘導培養(yǎng)不同時間的生物量及胞外酶活力圖。
圖9為III-3-Al分離純化的SDS-PAGE電泳圖譜。
其中，1:粗酶液；2: DEAE-S印harose CL-6B離子交換層析酶活峰。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方 式不限于此。
實施例1
(一)材料
1. 菌株
嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.III-3 (CGMCC No.2138 )，所述嗜堿芽孢桿菌 Bacillus sp.III-3菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏日2007年8月22日，保藏號CGMCCNo.2138。大腸桿菌E.coliToplO 購自Invitrogen公司。
2. 儀器
MyCycler thermal cycler PCR儀、DNA及蛋白電泳系統(tǒng)為Bio-rad公司 產品；分光光度計及微量分光光度計為Pharmacia Biotech公司產品； Thermomixer comfort溫控振蕩儀、移液槍、臺式離心機為Eppendorf公司產品； 恒溫搖床及恒溫水浴鍋為WAGEN公司產品；勻漿機、低溫高速離心機為 BECKMAN和Sigma公司產品；Dolphin-DOC成像系統(tǒng)為美國WEALTEC公
司產品。
(二)實驗方法和結果
1. 基因組DNA的提取
禾(J用EZ-10 spin column Genomic DNA Minipreps Kit(For Beteria)試齊lJ盒提 取^c/7/w sp.III-3基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳看到一條較明顯的條 帶(如圖l)，符合基因組DNA提取的要求。
2. 基因克隆
(1) PCR引物設計和擴增 從質譜分析所得到的肽段的保守氨基酸序列(第160-171位氨基酸 DPVYAGAEDFFR，第438-465位氨基酸LSGLDASNDVSEGNYWANARLS ADGWGK)入手，設計本發(fā)明上游895 bp片斷的特異性上下游簡并引物(如 表4-l)。再根據(jù)已克隆的上游895 bp片斷并結合質譜分析所得的相似保守氨 基酸序列(第751-757位氨基酸VFVDNVR)分別設計基因下游928 bp片斷 的上下游引物。最后，根據(jù)已經克隆的中間片斷序列，結合KSM-S237酶基因 5'-端的氨基酸序列和KSM-64酶蛋白C端氨基酸序列，分別設計擴增酶基因 5'-端序列和3'-端序列的PCR引物，引物設計見表4-1 。
__表4-l PCR引物設計__
克隆片斷 引物名稱 引物 設計引物的依據(jù)
上游上游引物A1 5'-GAYCCNGTNTAYGCNGGNGC-3'160: DPVYAGAEDFFR 895bp卜游引物B2 5'-GCRTTNGCCCARTARTTNCC-3' 438: LSGLDASNDVSEGNY 片斷 下游
上游引物AS2
928bp
片斷 下游引物N1
酶基因 上游引物T1 5'-端序列
下游引物T2 上游引物CS2
酶基因
下游引物
3'-端序列
KSM64
5'-AACGATGTTTCTGATGGCAACTA
CTGGG-3' 5'-CKNACRTTRTCNACRAANAC-3'
5'-GYTNMGNAARAARACNAARC-3'
5'-CTACTTGGTTCATTCGCTAA-3' 5'-GC AGGAAGAGTATTCGTAGA-3'
5'-TTATTTTTTCGTAGCCTC-3'
WANARLSADGWGK
已克隆的上游895bp片斷
751:VFVDNVR KSM-S237的酶基因 5'-端的氨基酸序列 已克隆的上游895bp片斷 已克隆的下游928bp片斷
KSM-64酶蛋白C端序列
(2)完整的酶基因序列 通過將PCR得到的各基因片段測序，得到堿性內切葡聚糖酶III-3-a完整的 酶基因序列如表l所示(也即序列表SEQUENCE LISTING NO.l所示的基因序 列)。
堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a的基因序列為一個完整的開放閱讀框 (ORF)，該開放閱讀框以起始密碼子ATG開始而以終止密碼子TAA結束， 共包括2502個核苷酸。其中，前90個核苷酸為信號肽編碼序列(用陰影標出)。
3.堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a編碼的氨基酸序列
堿性內切葡聚糖酶基因m-3-a的酶基因所編碼的氨基酸序列如表2 (即序 列表SEQUENCE LISTING N0.2所示的氨基酸序列)。
經DNAssist Version 2.0軟件分析得到，堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a開 放閱讀框編碼833個氨基酸，其中，MMLRKKTKQLISSTLILVLLLSL FPTALAA序列(前30個氨基酸)為基因編碼的信號肽，其在成熟酶蛋白分 泌時在Ala^位點被切除。因此，成熟的酶蛋白從Gh^開始(用下劃線表示)， 共計803個氨基酸。其理論分子量(MWt)為89kD，與分離到的天然酶蛋白 分子量一致，而與KSM-S237、 KSM-64、萬ac/〃ws sp.1139菌株的堿性內切葡 聚糖酶蛋白分子量(分別為91.5、 91.0、 88.5)不盡一致。in-3-A酶蛋白的等電 點(pl)為4.30，不同于KSM-S237、 KSM-64、 Sac///^ sp.1139菌株的堿性內 切葡聚糖酶的等電點(分別為4.55、 4.4、 3.35)。
通過DNAssist Version 2.0軟件比對III-3-A酶蛋白氨基酸序列與^"c///^ sp.1139、 KSM-64、 KSM-S237和NW-2004a的氨基酸序列。根據(jù)比對結果，把堿性內切葡聚糖酶蛋白序列分為5個區(qū)。將III-3-A酶蛋白氨基酸序列分別 命名為(l)Signal區(qū)1 30位氨基酸(用著重號標明)，富含極性氨基酸， 為酶蛋白分泌所需的信號肽；(2)N端保守結構域區(qū)31 419位氨基酸(用 下劃線標明)，成熟酶蛋白從31位氨基酸開始，其序列高度保守；G)結構域 連接區(qū)Linkage: 420 470位氨基酸，為兩個保守結構域的連接區(qū)，但此連接 區(qū)的相似性較低；(4)近C-端保守結構域471 701位氨基酸(用下劃線標 明)，靠近C-末端約74個氨基酸，其序列保守性相對較高；(5) C-端氨基酸 序列702 833位氨基酸，該端長度隨酶蛋白來源的不同而存在較大差異， 且相似性較低。
根據(jù)DNA序列及氨基酸序列比對結果，發(fā)現(xiàn)不同來源的酶基因及其氨基 酸序列之間存在一定的進化關系。來源于6"a7/"s sp. III-3的酶基因III-3-a與 KSM-S237及KSM-64、 5""7/ms sp.1139的酶基因親緣關系最近，而與Bacz7/m sp. N^V-2004a及fi^/7/w sp.22-28的酶基因親緣關系相對較遠。
III-3-A成熟酶蛋白分子量為89 kD，與KSM-S237、 KSM-64、 6ac說ws sp.1139菌株的堿性內切葡聚糖酶蛋白分子量(分別為91.5、 91.0、 88.5)不盡 一致。等電點(pl)為4.30，不同于KSM-S237、 KSM-64、 sp.1139 菌株的堿性內切葡聚糖酶的等電點(分別為4.55、 4.4、 3.35)。根據(jù)序列分析 結果結合酶蛋白在分子量、等電點及酶學特性等方面的差異判斷，in-3-a酶基 因為一新發(fā)現(xiàn)的{3-1, 4-內切葡聚糖酶基因。
實施例2
一、材料和方法 (一)材料
1. 菌株
嗜堿芽孢桿菌萬acz7/ws sp.III-3菌株(CGMCC No.2138 );宿主菌五.co/ 'BL21 Star (DE3)、五.co/z' Topl0F,均購自Invitrogen公司。
2. 載體
大腸桿菌表達載體pET-28a(+) (Novagen)含有Kan+抗性標記，載體圖 譜和多克隆位點分別見圖2和圖3。
3. 試劑及試劑盒
限制性內切酶、PCR產物片段純化試劑盒、膠回收試劑盒、DNA分子量標 記、T4連接酶為寶生物公司產品； 一步法快速制備感受態(tài)細胞試劑盒(SSCS)為上海生工生物工程公司產品；蛋白分子量標記為Fermentas (MBI )公司產品； 其余試劑均為國產分析純。PCR引物合成和DNA序列測定由Takara公司完成。
4.培養(yǎng)基及緩沖液
(1) 嗜堿芽孢桿菌III-3菌株培養(yǎng)基(質量百分比)1%復合蛋白胨，0.5% 酵母粉，0.5%NaCl， 0.1%KH2PO4， 0.25% Na2HP04'12H20， 2% CMC-Na， 0.5%Na2CO3 (分開滅菌)。
(2) LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaC110g，瓊脂糖(固體 培養(yǎng)基)15g，溶質溶于950ml蒸餾水中，用1M的NaOH調pH至7.0后加水 至1L。 12rC高壓滅菌20min。
(3) LB (含抗生素卡那霉素Kan， Kanamycin):胰化蛋白胨10g，酵母提 取物5g， NaCl 5g，瓊脂糖(固體培養(yǎng)基)15g，溶質溶于950ml蒸餾水中， 用1M的NaOH調pH至7.5后加水至1L。 121。C高壓滅菌20min，待溫度降 至55。C后加入Kan至終濃度50 ug/ml。
(4) TE緩沖液10纖ol/lTris-Hcl， pH8.0， l麵ol/L EDTA, pH8.0。
(5) 堿裂解液I、 II、 III (質粒提取)堿裂解液I:葡萄糖50mmom， Tris-Hcl (pH8.0) 25mmol/L， EDTA 10 mmol/L。每瓶約100ml，滅菌后4°C 貯存。堿裂解液II: NaOH0.2mmol/L， SDS 1%。溶液不可貯存，現(xiàn)用現(xiàn)配。 堿裂解液III:乙酸鉀5醒ol/L，冰乙酸11.5%。
(二)方法
1.目的基因III-3-a的分離
采用PCR的方法從萬"c/〃m sp. m-3菌中分離in-3-a基因。在37。C、 220r/min 搖瓶培養(yǎng)Bacz'〃wssp. m-3菌，84h后離心收集菌體，然后利用EZ-10 spin column Genomic DNA Minipreps Kit(For Beteria)試劑盒提取基因組總DNA。根據(jù)不含 信號肽編碼序列的III-3-a基因，設計引入i^'^/ni和五o Rl酶切位點(斜體) 的PCR弓I物
上游引物五coRl : 5，-GATgaa"cGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3，； 下游引物歷"d III: 5 ， -GTT""gc"TTATTTTTTCGTAGCCTCTTTC-3'; 按照如下條件進行PCR:
PCR反應組分
ddH20 33.75^1
10xPCR Buffer 5^1 dNTP 5^1 5' Primer lpl 3' Primer
模板DNA 4^il Ex Taq DNA聚合酶_Q.25pl
Totol
PCR反應參數(shù)如下:
50nl
72 °C 4°C 7min Pause
94 °C 94 。C55 °C72 °C 5min 30s 30s 3min 30cycle
反應完成后，取8pl反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物與 pUCm-T連接后送Takara公司進行測序鑒定。 2.重組質粒pET-28a-III-3-a的構建
不含信號肽編碼序列的m-3-a基因經歷w/m和五o R I雙酶切后與采用同 樣酶切的大腸桿菌表達載體pET-28a(+)連接，得到重組質粒pET-28a-ni-3-a。 連接反應體系如下
T4連接酶 lpl T4Buffer 1^1 DNA 6nl (2嗎) _￡^_2|al (200ng)
Totol lOjil
16'C水浴中連接過夜后轉化感受態(tài)細胞(連接反應中基因和質粒的摩爾比 為9 : 1)。
3. TOP10F 和BL21 Star(DE3)五.co/z感受態(tài)細胞的制備 用上海生工生物工程公司生產的一步法快速制備感受態(tài)細胞試劑盒制成
感受態(tài)細胞?？闪⒓崔D化或于-7(TC凍存。
4. 轉化TOP10F 感受態(tài)細胞
(1) lOiil連接產物與100nl感受態(tài)細胞混勻，冰浴30min。 (2) 42。C水 浴90秒，冰浴2min。 (3)加入lmlLB培養(yǎng)基，混勻，37°C 180r/min溫浴lh。 (4) 3000r/min離心lmin，吸底部沉淀200nL至LB (含選擇抗生素Kan)平
板，用涂布器涂勻，37。C培養(yǎng)過夜。.
5. 重組質粒的中量制備
(1)挑取抗性平板上的重組菌落至50ml LB (含選擇抗生素Kan)液體 培養(yǎng)基中，200r/min、 37'C培養(yǎng)過夜。(2)將培養(yǎng)液12000 r/min離心3min， 棄上清，收集菌體。(3)將菌體加入200 nl冰預冷的堿裂解液I中，劇烈振 蕩后，將懸浮液轉移至1.5ml小離心管中。(4)加入400 pl新配制的裂解液II ， 反復顛倒數(shù)次(切勿渦旋振蕩)后，置于冰上。(5)加入300 pl冰預冷的堿 裂解液m，蓋緊管口，顛倒數(shù)次，將離心管置于冰上5min。 (6)微量離心機 12000r/min 、 4。C冷凍高速離心5min，上清液移至另一離心管中。(7)加入等 體積的酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)混勻，12000r/min、 4'C離心5min，上清 轉入一支新管中。(8)加入2倍體積無水乙醇，室溫放置2min沉淀核酸。(9) 微量離心機12000r/min、 4"C離心5min，棄上清。(10)加入lml 70%乙醇洗 滌核酸沉淀，微量離心機12000r/min、 4"C離心2min，棄上清。(11)干燥核 酸沉淀，加入100W無菌水溶解核酸。(12)取5^il進行瓊脂糖電泳檢驗，剩 余核酸-2(TC貯存?zhèn)溆谩?br> 6. 五.co// BL21 Star (DE3)的轉化
(1)將從重組TOP10F五.c(^中提取的質粒100昭與100pl感受態(tài)細胞 混勻，冰浴30min。 42。C水浴90秒，冰浴2min。 (2)加入lml LB培養(yǎng)基， 混勻，37°C、 180r/min溫浴lh。 (3) 3000 r/min離心lmin，吸底部沉淀200 pl 至LB (含選擇抗生素Kan)平板，用涂布器涂勻，37。C培養(yǎng)過夜。
7. 酶活性(CMC酶)測定
取1%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液lmL作為底物，加入O.lmL適 當稀釋的酶溶液，在4(TC下反應30min，中性內切葡聚糖酶活力測定控制反 應pH值為7.0，堿性內切葡聚糖酶活力測定控制反應pH值為9.0。終止反應 后，用DNS法于540nm測定還原糖，并扣除空白試驗測定值。將上述條件下 每小時由底物產生l.Omg還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位，用U/mL 表示。菌體濃度采用比色法進行測定。將適當稀釋的菌液于600 nm波長下測 定吸光值，對照采用同樣稀釋度的培養(yǎng)基。
8. 加入表面活性劑對胞外產酶的促進作用 (1)不同時期加入EDTA對胞外酶活的影響
取過夜培養(yǎng)菌液0.5mL接種到裝有50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中培養(yǎng)，
待OD,值達到0.6時加入終濃度為0.2 mM的IPTG,將其等量分裝并置于23 °C 搖瓶培養(yǎng)。分別在誘導后不同時間(0.5、 3、 6、 9、 12和21h)加入0.5%的 EDTA，并分別測定誘導培養(yǎng)23h的胞外酶活力。
(2) EDTA添加量對胞外酶活的影響
取過夜培養(yǎng)菌液0.5mL接種到裝有70ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中培養(yǎng)， 待OD6oo值達到0.6時加入終濃度為0.2 mM的IPTG，將其等量分裝并置于23 °C 搖瓶培養(yǎng)。于誘導培養(yǎng)12h時分別加入不同量的EDTA(0.1。/。、 0.3%、 0.5%、 0.8%、 1%、 1.5%和3%),并分別測定其誘導培養(yǎng)14h和22h的胞外酶活力。
(3) 添加EDTA對產酶的促進作用
取過夜培養(yǎng)菌液0.5ml接種到2個裝有50ml LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中培 養(yǎng)，待OD柳值達到0.6時分別加入終濃度為0.2 mM的IPTG，并置于23。C搖 瓶培養(yǎng)。其中一個搖瓶于加入IPTG后12h加入0.5o/。的EDTA，而另一搖瓶不 加EDTA作對照。分別于預定時間測定生物量和胞外酶活力。通過離心收集 菌體并用液氮反復凍融法破碎細胞后測其胞內酶活力。
9. 重組大腸桿菌五,0//111-341的誘導表達
將篩選得到的重組大腸桿菌五.co// III-3-A1接種到50ml LB液體培養(yǎng)基中， 待OD值達到0.6時加入終濃度為0.2mM的IPTG(異丙基-p-D-硫代半乳糖苷)， 于23"C條件下進行誘導培養(yǎng)，并于誘導培養(yǎng)12h加入0.5%的EDTA，誘導培 養(yǎng)23h終止發(fā)酵。將發(fā)酵液用液氮反復凍融使細胞破碎，10000r/min高速離心 2min后去沉淀即得粗酶液。
10. 重組堿性內切葡聚糖酶的分離純化
采用一步離子交換層析法分離重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al (離子交換 層析介質為DEAE Sepharose CL-6B,層析柱$2.6cmx30cm)。平衡液為pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，洗脫液為含NaClpH8.0Tris-HCl緩沖液。將粗酶液離心收 集上清液后直接上用pH 8.0 Tris-HCl預平衡的DEAE Sepharose CL-6B離子交 換柱，用含不同濃度NaCl(i.e.0.4， 0.45 and 1M)的pH 8.0 Tris-HCl以180 ml-h'1 的流速進行梯度洗脫，收集酶活峰。
二、實驗結果 (一)重組大腸桿菌的構建
1.目的基因III-3-a的獲取
從萬a"7/w sp. m-3菌84 h培養(yǎng)液中，利用EZ-IO spin column Genomic DNA
Minipreps Kit(For Beteria)試劑盒提取基因組總DNA，并用PCR方法擴增得到 m-3-a基因，結果如圖4所示。由于大腸桿菌表達載體pET-28a(+)可使目的蛋白 實現(xiàn)細胞周質表達，因此在設計PCR引物時按照III-3-a成熟酶蛋白的編碼序列 進行設計。由圖4可見，PCR擴增產物的大小為2.4kb，與不含信號肽編碼序列 的lII-3-a基因大小相符。
2. pET-28a-III-3-a重組表達載體的構建
將不含信號肽編碼序列附II-3-a基因用歷Win和￡o>R I進行雙酶切，并 連接到采用同樣酶切的大腸桿菌表達載體pET-28a(+)中，連接物轉化五. TOP10F，，在含25 jLig/mL卡那霉素(Kan)抗性平板上篩選轉化菌落。從這些 菌落中提取質粒進行酶切鑒定，結果如圖5所示。重組質粒經歷Wm和￡coR I 雙酶切得到大小為5.37kb和2.4kb的片段，分別對應于pET-28a(+)和不含信 號肽編碼序列的ni-3-a基因的大小。同時，將重組質粒送Takara公司進行測 序，測序結果顯示重組質粒所攜帶的基因為目的基因。
3. ￡.co//BL21 Star(DE3)的轉化
采用一步法快速制備感受態(tài)細胞試劑盒(SSCS)制備五.co/ BL21 Star (DE3) 的感受態(tài)細胞，并將重組質粒pET-28a-III-3-a轉化大腸桿菌5.co/z'BL21 Star (DE3)，并利用含25 pg/mL卡那霉素(Kan)抗性平板篩選轉化菌落。經過大 量篩選后得到可以高效表達的重組大腸桿菌菌株￡.0>//111-3-八1，其在含有 CMC的LB平板上培養(yǎng)3天可形成相對較大的透明圈。從￡.co//I^-3-Al菌株中提 取基因組DNA后，以III-3-a基因的5'和3'引物進行PCR擴增，結果表明該轉化 菌株含有III-3-a基因。將重組菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，待OD值 達到0.6時加入終濃度為lmmol/L的IPTG過夜培養(yǎng)15h后取樣，并用液氮反復凍 融法破碎細胞后測其酶活性，結果可以檢測到內切酶活性。同時，將重組菌株 送至Takara公司進行測序，測序結果顯示重組質粒所攜帶的基因為目的基因。 可見，？￡丁-28&-111-3-&重組質粒已經成功轉入五.0 //81^21 Star(DE3)。 (二)加入表面活性劑對胞外產酶的促進作用 (1)不同時期加入EDTA對胞外酶活的影響
研究表明，重組大腸桿菌5.co// m-3-Al的細胞外酶活力極微，這與 Sanchez-Torres等的研究結果一致。為了提高重組內切葡聚糖酶III-3-Al的細胞 外表達水平，本發(fā)明通過加入表面活性劑增加細胞膜的通透性以使表達的酶蛋 白滲透到胞外。結果發(fā)現(xiàn)，加入表面活性劑EDTA可顯著提高胞外酶活力。為了確定在菌體誘導培養(yǎng)的不同時期加入EDTA對胞外酶活的影響，在6 個OD6oo為0.6左右的搖瓶培養(yǎng)液中，分別加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導物 IPTG，于23"條件下進行誘導培養(yǎng)，分別在誘導后不同時間(0.5、 3、 6、 9、 12和21h)加入0.5y。的EDTA,并分別測定誘導培養(yǎng)23h的胞外酶活力(結果見 圖7)。圖6表明，在誘導培養(yǎng)6h后加入表面活性劑EDTA均可使胞外酶活力顯 著增加，其中，以誘導培養(yǎng)12h時添加EDTA對胞外產酶的促進作用最大。
(2) EDTA添加量對胞外酶活的影響
在7個經IPTG誘導的搖瓶培養(yǎng)液中，于誘導培養(yǎng)12h時分別加入不同量 的EDTA(0.iy。、 0.3%、 0.5%、 0.8%、 1%、 1.5%和3%)，并分別測定其誘導培 養(yǎng)14h和22h的胞外酶活力，結果如圖7所示。由圖7可以看出，加入適量 的EDTA對胞外產酶有顯著的促進作用，但EDTA添加量過多反而使胞外酶 活力下降。這是由于過量的EDTA對菌體生長的抑制作用之故。當添加0.5% 的EDTA時，誘導培養(yǎng)14h和22h的胞外酶活力均較高，因此，選擇EDTA 的添加量以0.5%左右為宜。
(3) 添加EDTA對產酶的促進作用 為了深入研究添加表面活性劑對重組大腸桿菌胞內外產酶的影響，本實驗
在上述優(yōu)化培養(yǎng)條件下，分別測定在IPTG誘導后不同時間的生物量并檢測加 入表面活性劑EDTA后胞外酶活力的變化，結果如圖8。由圖8可見，在誘導培 養(yǎng)12h時加入EDTA的時間約為菌體對數(shù)生長后期，此時加入EDTA后胞外酶活 力迅速增加，至誘導培養(yǎng)22h左右達到高峰，胞外酶活力達18.5U/mL。同時， 通過對比誘導培養(yǎng)22h時不加EDTA和添加0.5n/。EDTA兩種條件下胞內外酶活 力的變化(如表5-l)，發(fā)現(xiàn)添加EDTA不僅可顯著增加胞外酶活力，而且使胞 內外酶活總量增加26.3%，達到31.2U/mL。可見，添加EDTA可通過增加細胞 膜的通透性而達到促進堿性內切葡聚糖酶胞外分泌的目的。
表5-l 不力BEDTA和添加EDTA兩種條件下胞內外酶活力的對比
誘導培養(yǎng) 誘導培養(yǎng)22h
添加EDTA
酶活力(U/mL)
12h 不加EDTA
胞外酶活力 0.7 5.3 18.5
胞內酶活力 19.3 19.4 12.7
總酶活力20 24.7 31.2 (三)重組堿性內切葡聚糖酶蛋白的分離純化
將50mL上述重組大腸桿菌粗酶液經離心后加到預先用pH8.0 Tris-HCl緩沖 液充分平衡的DEAE-Sepharose CL-6B層析柱，先后用含0.4M、 0.45M和1M NaCl的pH8.0 Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，并收集各峰進行酶活性檢測，酶 活性集中于用0.4 0.45MNaCl的pH8.0 Tris-HCl緩沖液的洗脫峰，其它峰無酶 活。將此酶活峰收集、透析，并經過濃縮后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢 測，結果如圖9。由圖9電泳圖的第2泳道可見，電泳檢測到分子量約為90 kD 的單一蛋白條帶，達到分離純化的預期效果。同時，發(fā)現(xiàn)粗酶液的電泳條帶中 (圖9電泳圖的第1泳道)可見一明顯的相應目的蛋白條帶，這也證明重組堿性 內切葡聚糖酶III-3-Al已經成功分泌到細胞外。 (四)重組堿性內切葡聚糖酶的酶學性質
1. 最適pH和pH穩(wěn)定性
分離純化的重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al酶的最適作用pH為8 10左 右，且在pH6 11的范圍內可保持80%以上酶活性。
2. 最適溫度和熱穩(wěn)定性
重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al的最適作用溫度為40 5(TC左右，其在 55'C以下具有良好的熱穩(wěn)定性。
3. 對金屬離子和表面活性劑的耐受性
將純化的重組堿性內切葡聚糖酶III-3-Al酶蛋白分別置于終濃度為lmM 的Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe2+或Ca2+等金屬離子以及0.05%EDTA、 0.05%EGTA、 0.0P/。SDS中，3(TC保存10min后按照常規(guī)方法測定其酶活力。結果表明，在 上述各種金屬離子和表面活性劑中，殘余酶活力可保持99%以上，說明III-3-Al 酶蛋白具有耐Na+、 K+、 Mg2+、 Cu2+、 F一+和Ca"等金屬離子的良好特性，并 對SDS、 EDTA、 EGTA等表面活性劑均具有良好的耐受性。同時，III-3-A1 在終濃度為0.2%的洗滌劑(市售立白洗衣粉)中保存10min后按常規(guī)方法測 定其酶活力，發(fā)現(xiàn)其殘余酶活力無顯著損失?？梢?，重組堿性內切葡聚糖酶 III-3-A1在洗滌劑等工業(yè)中的良好應用潛力。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
SEQUENCE LISTING <110>邢苗 劉森林 陳偉釗 <120> —種堿性內切葡聚糖酶基因及其重組酶和應用 <130> 30 <160> 2
<170> Patentln version 3.2
<210〉 1
<211〉 2502
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220〉
<223>堿性內切葡聚糖酶基因ni-3-a的基因序列 <400> 1
atgatgttgc gcaaaaagac aaaacagttg atttcttcca ctcttatttt agttttactt 60 ctatctttat ttccaacagc tctagcagca gaaggaaaca ctcgtgaaga caattttaat 120 catttattag gtaatgacaa tgttaagcgc ccttccgagg ctggcgcatt acaattacaa 180 gaagtcgatg gacaaatgac attagtagat caagatggag aaaaaattca attacgtgga 240 atgagtacac acggattaca atggtttcct gagattttaa atgataacgc atacaaagct 300 cttactaacg attgggaatc aaatatgatt cgtctagcta tgtatgtcgg tgaaaatggc 360 tatgettcaa atccagattt aattaaaagc agagtcatta aaggaataga tcttgctatt 420 gaaaatgaca tgtatgtcat tgttgactgg catgtacatg cacctggtga tcctagagat 480 ccggtttayg cwggtgcaga agatttcttt agagaaattg cagcattata tcctaacaat 540 ccacacatta tttatgagtt agcgaatgaa ccaagtagta ataataatgg tggagcaggg 600 attccgaata atgaagaagg ttggaatgca gtaaaagaat acgctgatcc aattgtagaa 660 atgttacgtg aaagtggtaa cgcagatgac aatatcatca ttgtggggag tcctaactgg 720 agtcagcgtc ctgacttagc agctgataat ccaattgatg accaccatac aatgtacaca 780 gttcatttct atacaggttc acatgcagct tcaacggaga gttatccgcc tgaaactcct 840 aactctgaaa gaggaaacgt aatgagtaac actcgttatg cgttagagaa cggagtagcg 900 gtatttgcaa cagaatgggg aacaagtcaa gcaagtggag acggtggtcc ttactttgac 960 gaagcagatg tat鵬ttga atttttaaat gaaaacaaca ttagctgggc taactggtct 1020 ttaacgaata aaaatgaagt gtctggtgca tttacaccat tcgagttagg aaaatctaac1080
gcaactaatc ttgacccagg tccagaccat gtttgggcac ctgaagagtt aagtctttct1140 ggagaatatg tacgtgctcg tattaaaggt跑aactatg agccaatcga ccgtactaaa 1200 tacacgaaag tactttggga ctttaatgat ggaacgaagc aaggatttgg agtgaatgga 1260 gattctccaa ataaagagct tattgcagtt gataatgaaa acaacacttt gaaaatttcg1320 gggttagatg taagtaacga tgtttctgat ggcaactact gggctaatgc tcgtctttca1380 gccaacggtt gggggaaaag tgttgatata ttaggtgctg aaaaactaac tatggatgtt 1440 attgttgatg agccgacgac ggtagcgatt gctgcaattc cacaaggtcc atcagcaaat 1500 tggattaatc caatttgcgc agttaaggtt gagccaactg atttcgtgcc gtttggagat 1560 aagtttaaag cagaattaac tataactaca gcggactctc cagcgataga agcgattgcg1620 atgcatgctg aaaataacaa tatgaacaac atcattctgt tcgtaggaac tgatgcagct1680 gacgttattt atttagataa cattaaagta attggaacag aagttgaaat tccagttgtt1740 cataatccaa aaggagaagc tgtccttccg tctaattttg aagacggcac acgtcaaggt 1800 tgggactggg ctggagagtc tggtgtgaaa acagctttaa ccattgaaga agcaaacggt1860 tctaacgcgc tatcatggga atttggatac ccagaagtaa aacctagtga taactgggcg1920 acagctccac gtttagattt ctggaaatct gacttggttc gcggtgagaa tgattatgta1980 gcttttgact tctatctaga tccagttcgt gcaacagaag gcgcgatgaa tatcaattta 2040 gtatttcagc cacctactaa tggatattgg gttcaagcac cacaaacttt tacggttgac 2100 tttgaagagt tagatcaagc aaatcaagta gacggtctat accattatga agtaaaaatt2160 aatgtaagag atattacaaa cgttcaagat gacactttac tacgtaatat gatgattatt 2220 tttgctgatg tacaaagtga ttttgcagga agagtattcg tagataatgt tcgttttgag 2280 gttgctgeta ctgggccgat tgagcctgaa ccagttgatc ctggcgaaga ggcgcctcct 2340 gtagatgaga aggaagcagc aaaagaagaa agagaagcag ctagaggagc ggagaaagag 2400 gaaagagaag ccgtgaaagc tgaaagagaa gtagctagag aagcagcgaa agaggaaaga 2460 gaaaccgcaa aagaagaaaa gaaagaggct acgaaaaaat aa 2502
<210> 2
<211> 833
<212> PRT
<213> Artificial sequence <220>
<223>堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a編碼的氨基酸序列
<400> 2
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gin Leu He Ser Ser Thr Leu lie 1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala Glu Gly
20 25 30
Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Asn His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gin Leu Gin Glu Val Asp Gly
50 55 60
Gin Met Thr Leu Val Asp Gin Asp Gly Glu Lys lie Gin Leu Arg Gly 65 70 75 80
Met Ser Thr His Gly Leu Gin Trp Phe Pro Glu lie Leu Asn Asp Asn
85 卯 95
Ala Tyr Lys Ala Leu Thr Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met lie Arg Leu
100 105 110
Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Asp Leu lie
115 120 125
Lys Ser Arg Val He Lys Gly lie Asp Leu Ala lie Glu Asn Asp Met
130 135 140
Tyr Val lie Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp 145 150 155 160
Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Glu lie Ala Ala Leu
165 170 175
Tyr Pro Asn Asn Pro His lie lie Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser
180 185 190
Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly lie Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp
195 200 205
Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro lie Val Glu Met Leu Arg Glu
210 215 220
Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn lie He lie VaGly Ser Pro Asn Trp 225 230 235 240
Ser Gin Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro lie Asp Asp His His
245 250 255
Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr
260 265 270
Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met
275 280 285
Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr
290 295 300
Glu Trp Gly Thr Ser Gin Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp 305 310 315 320
Glu Ala Asp Val Trp lie Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn lie Ser Trp
325 330 335
Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
340 345 350
Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro
355 360 365
Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val
370 375 380
Arg Ala Arg lie Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro lie Asp Arg Thr Lys 385 390 395 400
Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gin Gly Phe
405 410 415
Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu lie Ala Val Asp Asn
420 425 430
Glu Asn Asn Thr Leu Lys lie Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val
435 440 445
Ser Asp Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp
450 455 460
Gly Lys Ser Val Asp lie Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val 465 470 475 480lie Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala lie Ala Ala lie Pro Gin Gly
485 490 495
Pro Ser Ala Asn Trp lie Asn Pro lie Cys Ala Val Lys W Glu Pro
500 505 510
Thr Asp Phe Val Pro Phe Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr lie
515 520 525
Thr Thr Ala Asp Ser Pro Ala He Glu Ala lie Ala Met His Ala Glu
530 535 540
Asn Asn Asn Met Asn Asn He lie Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala Ala 545 550 555 560
Asp Val lie Tyr Leu Asp Asn lie Lys Val lie Gly Thr Glu Val Glu
565 570 575
lie Pro Val Val His Asn Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Asn
580 585 590
Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gin Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly
595 600 605
Val Lys Thr Ala Leu Thr lie Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu
610 615 620
Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala 625 630 635 640
Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu
645 650 655
Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr
660 665 670
Glu Gly Ala Met Asn lie Asn Leu Val Phe Gin Pro Pro Thr Asn Gly
675 680 685
Tyr Trp Val Gin Ala Pro Gin Thr Phe Thr Val Asp Phe Glu Glu Leu
6卯 695 700
Asp Gin Ala Asn Gin Val Asp Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys lie 705 710 715 720Asn Val Arg Asp He Thr Asn Val Gin Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn
725 730 735
Met Met lie lie Phe Ala Asp Val Gin Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val
740 745 750
Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Val Ala Ala Thr Gly Pro lie Glu
755 760 765
Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Ala Pro Pro Val Asp Glu Lys
770 775 780
Glu Ala Ala Lys Glu Glu Arg Glu Ala Ala Arg Gly Ala Glu Lys Glu 785 790 795 ■
Glu Arg Glu Ala Val Lys Ala Glu Arg Glu Val Ala Arg Glu Ala Ala
805 810 815
Lys Glu Glu Arg Glu Thr Ala Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Thr Lys 820 825 830
Lys
權利要求
1、一種堿性內切葡聚糖酶基因，其特征在于所述的酶基因序列如下ATGATGTTGCGCAAAAAGACAAAACAGTTGATTTCTTCCACTCTTATTTTAGTTTTACTTCTATCTTTATTTCCAACAGCTCTAGCAGCAGAAGGAAACACTCGTGAAGACAATTTTAATCATTTATTAGGTAATGACAATGTTAAGCGCCCTTCCGAGGCTGGCGCATTACAATTACAAGAAGTCGATGGACAAATGACATTAGTAGATCAAGATGGAGAAAAAATTCAATTACGTGGAATGAGTACACACGGATTACAATGGTTTCCTGAGATTTTAAATGATAACGCATACAAAGCTCTTACTAACGATTGGGAATCAAATATGATTCGTCTAGCTATGTATGTCGGTGAAAATGGCTATGCTTCAAATCCAGATTTAATTAAAAGCAGAGTCATTAAAGGAATAGATCTTGCTATTGAAAATGACATGTATGTCATTGTTGACTGGCATGTACATGCACCTGGTGATCCTAGAGATCCGGTTTAYGCWGGTGCAGAAGATTTCTTTAGAGAAATTGCAGCATTATATCCTAACAATCCACACATTATTTATGAGTTAGCGAATGAACCAAGTAGTAATAATAATGGTGGAGCAGGGATTCCGAATAATGAAGAAGGTTGGAATGCAGTAAAAGAATACGCTGATCCAATTGTAGAAATGTTACGTGAAAGTGGTAACGCAGATGACAATATCATCATTGTGGGGAGTCCTAACTGGAGTCAGCGTCCTGACTTAGCAGCTGATAATCCAATTGATGACCACCATACAATGTACACAGTTCATTTCTATACAGGTTCACATGCAGCTTCAACGGAGAGTTATCCGCCTGAAACTCCTAACTCTGAAAGAGGAAACGTAATGAGTAACACTCGTTATGCGTTAGAGAACGGAGTAGCGGTATTTGCAACAGAATGGGGAACAAGTCAAGCAAGTGGAGACGGTGGTCCTTACTTTGACGAAGCAGATGTATGGATTGAATTTTTAAATGAAAACAACATTAGCTGGGCTAACTGGTCTTTAACGAATAAAAATGAAGTGTCTGGTGCATTTACACCATTCGAGTTAGGAAAATCTAACGCAACTAATCTTGACCCAGGTCCAGACCATGTTTGGGCACCTGAAGAGTTAAGTCTTTCTGGAGAATATGTACGTGCTCGTATTAAAGGTGTGAACTATGAGCCAATCGACCGTACTAAATACACGAAAGTACTTTGGGACTTTAATGATGGAACGAAGCAAGGATTTGGAGTGAATGGAGATTCTCCAAATAAAGAGCTTATTGCAGTTGATAATGAAAACAACACTTTGAAAATTTCGGGGTTAGATGTAAGTAACGATGTTTCTGATGGCAACTACTGGGCTAATGCTCGTCTTTCAGCCAACGGTTGGGGGAAAAGTGTTGATATATTAGGTGCTGAAAAACTAACTATGGATGTTATTGTTGATGAGCCGACGACGGTAGCGATTGCTGCAATTCCACAAGGTCCATCAGCAAATTGGATTAATCCAATTTGCGCAGTTAAGGTTGAGCCAACTGATTTCGTGCCGTTTGGAGATAAGTTTAAAGCAGAATTAACTATAACTACAGCGGACTCTCCAGCGATAGAAGCGATTGCGATGCATGCTGAAAATAACAATATGAACAACATCATTCTGTTCGTAGGAACTGATGCAGCTGACGTTATTTATTTAGATAACATTAAAGTAATTGGAACAGAAGTTGAAATTCCAGTTGTTCATAATCCAAAAGGAGAAGCTGTCCTTCCGTCTAATTTTGAAGACGGCACACGTCAAGGTTGGGACTGGGCTGGAGAGTCTGGTGTGAAAACAGCTTTAACCATTGAAGAAGCAAACGGTTCTAACGCGCTATCATGGGAATTTGGATACCCAGAAGTAAAACCTAGTGATAACTGGGCGACAGCTCCACGTTTAGATTTCTGGAAATCTGACTTGGTTCGCGGTGAGAATGATTATGTAGCTTTTGACTTCTATCTAGATCCAGTTCGTGCAACAGAAGGCGCGATGAATATCAATTTAGTATTTCAGCCACCTACTAATGGATATTGGGTTCAAGCACCACAAACTTTTACGGTTGACTTTGAAGAGTTAGATCAAGCAAATCAAGTAGACGGTCTATACCATTATGAAGTAAAAATTAATGTAAGAGATATTACAAACGTTCAAGATGACACTTTACTACGTAATATGATGATTATTTTTGCTGATGTACAAAGTGATTTTGCAGGAAGAGTATTCGTAGATAATGTTCGTTTTGAGGTTGCTGCTACTGGGCCGATTGAGCCTGAACCAGTTGATCCTGGCGAAGAGGCGCCTCCTGTAGATGAGAAGGAAGCAGCAAAAGAAGAAAGAGAAGCAGCTAGAGGAGCGGAGAAAGAGGAAAGAGAAGCCGTGAAAGCTGAAAGAGAAGTAGCTAGAGAAGCAGCGAAAGAGGAAAGAGAAACCGCAAAAGAAGAAAAGAAAGAGGCTACGAAAAAATAA。
2、根據(jù)權利要求1所述的一種堿性內切葡聚糖酶基因，其特征在于所述 堿性內切葡聚糖酶基因編碼的氨基酸序列如下YASNPDLIKSRVIKGIDLAIENDMYVIVDWHVHAPGDPRDPVYAGAEDFFREIAALYPNNPHIIYELANEPSSNNNGGAGIPNNEEGWNAVKEYADPIVEMLRESGNADDNIHVGSPNWSQRPDLAADNPIDDHHTMYTVHFYTGSHAASTESYPPETPNSERGNVMSNTRYALENGVAWATEPGPDHVWAPEELSLSGEYVRARIKGVNYEPIDRTKYTKVLWDFNDGTKQGFGVNGDSPNK ELIAVDNENNTLKISGLDVSNDVSDGNYWANARLSANGWGKSVDILGAEKLTMDVIVDEP TTVAIAAIPQGPSANWINPICAVKVEPTDFVPFGDKFKAELTITTADSPA正AIAMHAENNNM NNIILFVGTDAADVIYLDNIKVIGTEVEIPVVHNPKGEAVLPSNFEDGTRQGWDWAGESGVDTLLRNMMIIFADVQSDFAGRVFVDNVRFEVAATGP正PEPVDPGEEAPPVDEKEAAKEEREAARGAEKEEREAVKAERE VAREAAKEERETAKEEKKEATKK-。
3、 一種重組堿性內切葡聚糖酶，其特征在于所述重組堿性內切葡聚糖酶 是按下述方法制備而成(1) 重組菌株的構建用PCR方法從石ad//^平III-3(CGMCC No.2138 )的基因組DNA中克隆出 不含信號肽編碼序列附II-3-a酶基因全長，將其插入到原核表達載體pET-28a(+) 中，得到重組質粒pET-28a-m-3-a，并轉化大腸桿菌E.coli BL21 Star (DE3)菌株； 經過篩選后得到高效表達的重組大腸桿菌菌株E.coli III-3-A1;(2) 重組菌株的培養(yǎng)將篩選得到的重組大腸桿菌￡.co// III-3-A1接種到50ml LB液體培養(yǎng)基中， 待OD值達到0.6時加入終濃度為0.2mM的異丙基-P-D-硫代半乳糖苷，于23 °C 條件下進行誘導培養(yǎng)，并于誘導培養(yǎng)12h加入0.5o/。的EDTA，誘導培養(yǎng)23h終 止發(fā)酵；將發(fā)酵液用液氮反復凍融使細胞破碎，10000r/min高速離心2min后去 沉淀即得粗酶液；(3) 重組堿性內切葡聚糖酶的分離純化 將粗酶液離心收集上清液后直接上用pH 8.0 Tris-HCl預平衡的DEAESepharose CL-6B離子交換柱，用含濃度0.4 1MNaCl的pH 8.0 Tris-HCl以180 ml-h'1的流速進行梯度洗脫，收集重組堿性內切葡聚糖酶m-3-Al;所述重組堿性內切葡聚糖酶III-3-A1具有序列表SEQUENCE LISTING NO.l所示的基因序列，具有序列表SEQUENCELISTING N0.2所示的氨基酸序 列。
4、 根據(jù)權利要求3所述的重組堿性內切葡聚糖酶，其特征在于所述重組 堿性內切葡聚糖酶的最適作用pH為8 10，最適作用溫度為40 5(TC，酶蛋白具 有耐Na+、 K+、 Mg2+、 Cu2+、 Fe2+或Ca2+金屬離子，對SDS、 EDTA或EGTA具有 耐受性。
5、 權利要求3所述的重組堿性內切葡聚糖酶在洗滌劑或紡織工業(yè)中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種堿性內切葡聚糖酶的基因，該酶基因序列為一個完整的開放閱讀框，該開放閱讀框以起始密碼子ATG開始而以終止密碼子TAA結束，共包括2502個核苷酸。本發(fā)明還公開了上述重組堿性內切葡聚糖酶及在洗滌劑等工業(yè)中的應用。該重組堿性內切葡聚糖酶對SDS具有非常良好的耐受性，并且重組堿性內切葡聚糖酶在終濃度為0.2％的洗滌劑中保存10min后其殘余酶活力無顯著損失。該重組堿性內切葡聚糖酶適用于洗滌劑、紡織等工業(yè)。
文檔編號C12N15/56GK101182527SQ200710030788
公開日2008年5月21日 申請日期2007年10月10日 優(yōu)先權日2007年10月10日
發(fā)明者劉森林, 苗 邢, 陳偉釗 申請人:邢 苗;劉森林;陳偉釗