專(zhuān)利名稱(chēng)：Mmp14雙靶點(diǎn)高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)制藥領(lǐng)域。尤其是MMP14高效結(jié)合肽和確認(rèn)的MMP14分子作 用靶點(diǎn)目標(biāo)物的獲取和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)生命和健康的疾病，尋求腫瘤早期診斷和有效預(yù)防 治療的方法和藥物一直是生命科學(xué)家們追求的目標(biāo)。在腫瘤相關(guān)的各類(lèi)重要靶蛋白中，基 質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。MMPs是一類(lèi)Zn2+依賴(lài)的內(nèi)切蛋白酶家族，與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞外基 質(zhì)(ECM)降解過(guò)程密切相關(guān)。研究表明，惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)誘 導(dǎo)產(chǎn)生的MMPs水平呈正相關(guān)，MMPs在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。獲得高效MMPs結(jié) 合肽、深入研究MMPs結(jié)合肽與腫瘤抑制的關(guān)系，對(duì)腫瘤的預(yù)防和治療，具有重要的意義和 價(jià)值。由于MMPs與腫瘤的發(fā)生、增殖和血管生成密切相關(guān)，近20年來(lái)基于MMPs靶點(diǎn)的 多種抗腫瘤藥物先后進(jìn)入臨床研究，也取得了較好的成效。但也面臨很多的問(wèn)題，其中之 一就是藥物副作用大、選擇性差。人工合成的不同類(lèi)型的MMPs抑制劑治療腫瘤，臨床使用 效果并不理想，其中的一個(gè)重要原因是因?yàn)檫@些抑制劑具有廣譜的特異性，不僅抑制了靶 酶，也抑制了一些有益酶。MMP14是MMPs家族中重要的一員，與pro_MMP2結(jié)合進(jìn)一步激活MMP2，本身降解 ECM成分，被認(rèn)為是MMPs家族中與腫瘤侵襲關(guān)系最密切的酶，成為抗腫瘤藥物的新靶標(biāo)。隨 著MMP14調(diào)節(jié)的多向機(jī)制逐漸被揭示，發(fā)現(xiàn)其復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)可能與它在不同情況下的功 能有關(guān)，阻斷MMP14多向調(diào)節(jié)機(jī)制中的某一環(huán)節(jié)，可能是一種調(diào)控MMP14活性的有效方式， 而這種方法在體內(nèi)將更具有酶特異性和組織特異性。MMP14以膜蛋白的形式表達(dá)在細(xì)胞膜表面，一方面可以在細(xì)胞表面直接進(jìn)行篩選， 同時(shí)相對(duì)于其它MMPs，這種方法篩選獲得的結(jié)合多肽可望更接近于內(nèi)源性的抑制劑，用于 治療則可能副作用更小，療效更好。雙及多靶點(diǎn)藥物的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)一直是藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，本發(fā)明利用MMP14含Zn2+ 和細(xì)胞表面表達(dá)的特點(diǎn)消減篩選和獲得一組雙靶點(diǎn)MMP14和Zn2+的新型多肽序列，并發(fā)現(xiàn) 其在MMP14上的分子對(duì)接位點(diǎn)，可望用于基于MMPs靶點(diǎn)的腫瘤先導(dǎo)藥物研發(fā)、診斷及蛋白 親和純化應(yīng)用等領(lǐng)域，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的如上缺點(diǎn)或不足，本發(fā)明的目的在于研究一種MMP14雙靶點(diǎn)高效 結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取途徑，采用如下的方法MP14雙靶點(diǎn)高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取方法，從MMP14蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的
3人成骨肉瘤MG63細(xì)胞表面篩選和獲得一組新型的雙靶點(diǎn)MMP14和Zn2+的多肽，包括基于 MG63細(xì)胞靶向誘導(dǎo)表達(dá)MMP14的噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)體外消減篩選，通過(guò)“吸附-消減-吸 附_洗脫_擴(kuò)增”的循環(huán)篩選獲得富集噬菌體，經(jīng)3-5輪篩選，將最后一輪篩選富集的噬菌 體鋪板，挑取單克隆噬菌體制備ssDNA并測(cè)序。本發(fā)明的目的還在于，所獲得結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列在作為先導(dǎo)分子用于疾病治 療藥物研發(fā)和用于腫瘤診斷，以及用于蛋白質(zhì)分離純化、分子標(biāo)簽以及重金屬污染生物修 復(fù)、采礦等方面的用途。采用本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，從MMP14蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的人成骨肉瘤MG63細(xì)胞表面篩 選和獲得一組新型的雙靶點(diǎn)MMP14和Zn2+的多肽序列，序列含A-H-Q/S-L_H/P、P_E/Q-P_L、 A-L-H/K-H-H/T-H、WiZe-P-L-U P-X-P、H-H-X-H、M-P-K-S, M-K-P-S 等多肽結(jié)構(gòu)序列，并與 MMP14.MMP15等蛋白的重要結(jié)構(gòu)域His-Asn-Glu、Asn-His_His良好對(duì)接，對(duì)MG63細(xì)胞增殖 有較好的抑制生長(zhǎng)作用。本發(fā)明所獲得的全序列或多肽結(jié)構(gòu)序列可望作為先導(dǎo)分子用于疾 病治療藥物的研發(fā)和用于腫瘤等疾病的診斷以及蛋白質(zhì)分離純化、分子標(biāo)簽以及重金屬污 染修復(fù)、采礦等領(lǐng)域。


如下圖1是MG63細(xì)胞消減篩選的噬菌體富集圖。圖2是MMP14結(jié)合肽結(jié)構(gòu)序列分析圖。圖3是MTT法測(cè)定合成多肽對(duì)MG-63細(xì)胞抑制作用效果圖。表1是富集測(cè)定的結(jié)合肽序列。表2是單克隆結(jié)合肽噬菌體針對(duì)Zn2+Ni2+的親和力測(cè)定。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明建立了基于細(xì)胞消減技術(shù)的雙靶點(diǎn)MMP14和Zn2+高效結(jié)合多肽的篩選方 法，并獲得一組新型的雙靶向MMP14和Zn2+的高效結(jié)合多肽和多肽結(jié)構(gòu)序列，更且確定了其 在MMP14上的分子對(duì)接靶點(diǎn)。本發(fā)明通過(guò)如下思路和途徑實(shí)現(xiàn)了雙靶點(diǎn)MMP14和Zn2+高 效結(jié)合多肽和多肽結(jié)構(gòu)序列的獲得及用途1)有效利用MMP14的細(xì)胞表面膜蛋白和誘導(dǎo) 大量表達(dá)的特性；2)利用全細(xì)胞消減篩選技術(shù)進(jìn)行靶向MMP14的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選和 小分子結(jié)合多肽的獲得，共獲得25條不同的目的序列；3)通過(guò)生物信息分析和序列比對(duì)、 分子對(duì)接等計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)確認(rèn)篩選獲得的序列的原始創(chuàng)新性、重要多肽結(jié)構(gòu)序列以 及 MMP14 上分子對(duì)接的目標(biāo)靶點(diǎn)；確認(rèn) ΑΗΟ/3Ι /Ρ、ΡΕ/ΘΡ 、ΙννΕΡΙ^、ΑΙ /κΗΗ/τΗ、ΡΧΡ、ΗΗΧΗ、 MPKS (MKPS)等多條多肽結(jié)構(gòu)序列，并發(fā)現(xiàn)其在ΜΜΡ14上的分子對(duì)接靶點(diǎn)是His-Asn-Glu，在 MMP15上的分子對(duì)接靶點(diǎn)是Asn-His-His ；4)采用親和力反篩測(cè)定、免疫熒光、金屬螯合樹(shù) 脂親和測(cè)定、MTT生物學(xué)活性測(cè)定等方法確認(rèn)篩選得到的多肽對(duì)雙靶點(diǎn)MMP14和Zn2+等金 屬離子的較高親和力和專(zhuān)一性以及對(duì)MG63腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用；5)所述結(jié)合肽及所 含多肽結(jié)構(gòu)序列的其它用途。I，用于蛋白質(zhì)分離純化利用結(jié)合肽及所含結(jié)構(gòu)序列對(duì)Zn2+、 Ni2+等金屬離子的親和力，可如同現(xiàn)有商品化的6X組氨酸的作用方式，將其構(gòu)建于蛋白 質(zhì)融合表達(dá)載體中，用于基于金屬螯合樹(shù)脂的蛋白質(zhì)親和純化分離；II，用作分子標(biāo)簽如 同現(xiàn)有商品化的6X組氨酸的分子標(biāo)簽方式，將其構(gòu)建于蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，通過(guò)Western 等免疫檢測(cè)方法，用于蛋白質(zhì)表達(dá)的測(cè)定；III，用于重金屬污染的生物修復(fù)、采礦利用結(jié)合肽及所含結(jié)構(gòu)序列對(duì)Zn2+、Ni2+等重金屬離子的親和力，通過(guò)基因工程方法將其重組和展 示在生物體(微生物(細(xì)菌、酵母、噬菌體等)、植物細(xì)胞的表面，用于重金屬的吸附修復(fù)或 礦區(qū)重金屬離子的吸附分離采礦。下面結(jié)合實(shí)例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但其不代表為 本發(fā)明的唯一實(shí)施方式。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明共采用三種技術(shù)手段。1)基于MG63細(xì) 胞靶向誘導(dǎo)表達(dá)MMP14的細(xì)胞消減篩選技術(shù)和方法；2)靶向結(jié)合肽序列的確定、分析及分 子對(duì)接；3)雙靶向單克隆結(jié)合肽噬菌體的生物學(xué)特性等測(cè)定。(一)基于MG63細(xì)胞靶向誘導(dǎo)表達(dá)MMP14的細(xì)胞消減篩選技術(shù)和方法1. MG63細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)以及雌二醇誘導(dǎo)的MMP14細(xì)胞表面大量表達(dá)。2. MMP14表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)a.雌二醇誘導(dǎo)MG63細(xì)胞大量表達(dá)MMP14 ；b.多聚甲醛固定；c. PBS洗2 X Imin ；山羊血清封閉，室溫孵育20min ；d.滴加兔抗MMP14抗體，輕微振搖過(guò)夜；e. PBS洗3 X 2min，滴加二抗鼠抗兔IgG，輕微振搖孵育30min ；f. PBS洗3 X 2min,加入SABC-FITC復(fù)合物，輕微振搖孵育30min ；g.PBS 洗 4X5min ；h.熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大量MMP14的誘導(dǎo)表達(dá)。3.基于MG63細(xì)胞靶向誘導(dǎo)表達(dá)MMP14的噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)體外消減篩選
a. MG63細(xì)胞的6孔板培養(yǎng)；b.換 1 % FBS、DMEM 的培養(yǎng)；c.換含 0. 25% BSA 的 DMEM 的培養(yǎng)；d.預(yù)冷的PBS洗兩次，除去殘余液體；e.噬菌體十二肽庫(kù)加至培養(yǎng)有細(xì)胞的6孔板孔內(nèi)，4°C振搖孵育1. 5h ；f. 4°C預(yù)冷的PBS洗板，收集所有未結(jié)合噬菌體；g. 4°C預(yù)冷Gly-HCl緩沖液洗脫，Tris-HCl中和洗脫液；h.測(cè)定步驟f的未結(jié)合噬菌體(記為D)，步驟g的洗脫噬菌體(記為T(mén))滴度，并 擴(kuò)增，測(cè)定擴(kuò)增后噬菌體滴度；i.重復(fù)步驟a-d，培養(yǎng)MG63細(xì)胞，雌二醇誘導(dǎo)；j. 0. 25% BSA 的 DMEM 洗板 2 次，0. 25% BSA 的 DMEM、37°C封閉 Ih ；k. PBS洗2次，以步驟h獲得的擴(kuò)增后噬菌體重復(fù)步驟e，PBS洗板，g_h，獲得記號(hào) D、T的洗脫噬菌體。1.測(cè)定D、T洗脫噬菌體滴度，擴(kuò)增后測(cè)定擴(kuò)增噬菌體滴度，進(jìn)入下一輪篩選。m.重復(fù)步驟i，跳至步驟d_g，獲得洗脫噬菌體(記為X)，滴度測(cè)定、擴(kuò)增，進(jìn)入下
一輪篩選。各輪噬菌體富集見(jiàn)附圖1(第一輪R1，第二輪R2.....)。經(jīng)3-5輪篩選，噬菌體
總體呈現(xiàn)富集的特性，在第5輪噬菌體得到高度富集。( 二)靶向結(jié)合肽序列的確定、分析及分子對(duì)接1.本發(fā)明根據(jù)噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)目標(biāo)序列確定的原理和方法，將最后一輪篩選噬菌 體鋪板，共挑取27個(gè)單克隆噬菌體，制備ssDNA并送公司測(cè)序。獲得25條不同序列，見(jiàn)表 1。
5 2、結(jié)合肽的生物信息分析與序列比對(duì)對(duì)篩選得到的結(jié)合肽序列進(jìn)行文獻(xiàn)檢索和和分析，未發(fā)現(xiàn)與已知序列完全相同的 序列，NCBI GeneBank Blast搜索，也未發(fā)現(xiàn)與其他生物體存在同源序列，說(shuō)明本發(fā)明篩選 獲得的25條序列為新序列。對(duì)所獲結(jié)合肽序列進(jìn)行ClustalXl. 81多重序列比對(duì)，結(jié)果發(fā) 現(xiàn) ΑΗ0/ΑΗ/Ρ、ΡΕ/ΘΡ 、ΙννΕΡΙ^、ΑΙ /κΗΗ/τΗ、ΡΧΡ、ΗΗΧΗ、ΜΡΚ5 (MKPS)等多肽結(jié)構(gòu)序列的存在。 見(jiàn)附圖2。3.結(jié)合肽的計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接本發(fā)明為了確定發(fā)現(xiàn)的多肽結(jié)構(gòu)序列對(duì)ΜΜΡ14靶向特性，利用Molegro. Virtual. Docker分子對(duì)接軟件和Swiss-PDB Viewer對(duì)確認(rèn)的多條多肽結(jié)構(gòu)序列(AHQLH、PQPL, LPLL, PEPL, HHHH)與MMP14的ZnMc-MMP (aa. 118-284)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接分析，結(jié) 果確認(rèn)其與ZnMc-MMP (aa. 118-284)的保守結(jié)構(gòu)域aa. 121-123位置的His-Asn-Glu實(shí)現(xiàn)有 效對(duì)接，而后者又恰是MMP14的Zn2+結(jié)合區(qū)域。不僅如此，該多肽結(jié)構(gòu)序列還與MMP15對(duì)接 成功，對(duì)接位置位于aa. 36-38的Asn-His-His處，推斷MMP15的Asn-His-His序列極有可 能成為MMP15抑制劑篩選的一個(gè)重要靶向結(jié)構(gòu)域。(三)雙靶向單克隆結(jié)合肽噬菌體的生物學(xué)特性等測(cè)定1. MG-63細(xì)胞表面單克隆結(jié)合肽噬菌體的親和力反篩測(cè)定篩選獲得的結(jié)合肽序列之單克隆噬菌體擴(kuò)增后，如(一)/步驟3操作，測(cè)定部 分結(jié)合肽噬菌體的P/N值，(P:噬菌體與誘導(dǎo)細(xì)胞結(jié)合的洗脫噬菌體滴度，N:噬菌體與對(duì)照細(xì)胞結(jié)合的洗脫噬菌體滴度)，P/N值越高則親和力越強(qiáng)。結(jié)果顯示，VSFYHVSDPSAP、 TSIHLATASTHN、SVSVGMKPSPRP、LMPKSRMLPLLL、SSPLYHLISSAL 等序列具有較強(qiáng)的親和力。2.單克隆結(jié)合肽噬菌體的免疫熒光測(cè)定MG63細(xì)胞培養(yǎng)板接種和誘導(dǎo)，加入擴(kuò)增的單克隆結(jié)合肽噬菌體，經(jīng)孵育、洗滌、固 定等步驟，加入鼠抗M13單克隆抗體，經(jīng)結(jié)合、洗滌等步驟，加入FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗IgG， 甘油封片，熒光顯微鏡觀察篩選獲得的單克隆結(jié)合肽噬菌體與細(xì)胞表面分子MMP14的結(jié) 合，計(jì)算熒光細(xì)胞率。結(jié)果顯示與對(duì)照相比，加入結(jié)合肽噬菌體的處理樣品，其熒光細(xì)胞數(shù) 大大增加，呈現(xiàn)顯著差異。3.單克隆結(jié)合肽噬菌體的金屬離子結(jié)合特性選取部分序列對(duì)金屬離子Zn2+、Ni2+進(jìn)行親和力測(cè)定(測(cè)定方法參見(jiàn)易卓林，茆 燦泉，微生物學(xué)報(bào)，2006，46 (5) 745-748)，結(jié)果見(jiàn)表2。
可見(jiàn)篩選獲得的各條序列對(duì)Zn2+、Ni2+均具有一定的親和力，其中序列EREAHQLHSHHK、 ALHHHRTGHSP、DPALRHTHHNLR具有很高的親和力，結(jié)合對(duì)MMP14的親和力和含Zn2+的特性， 確定篩選獲得的多肽為雙靶點(diǎn)結(jié)合肽。P/N 含金屬離子樹(shù)脂結(jié)合的洗脫噬菌體滴度與去除 金屬離子樹(shù)脂結(jié)合的洗脫噬菌體滴度的比值。4.單克隆結(jié)合肽噬菌體的體外細(xì)胞生物學(xué)初步測(cè)定。根據(jù)綜合分析結(jié)果，我們對(duì)兩條多肽序列(AHQLH和LPLL)進(jìn)行多肽合成，并進(jìn)行 濃度梯度下的MG63細(xì)胞抑制效率測(cè)定，細(xì)胞顯微觀察和48孔板MMT細(xì)胞增殖曲線(xiàn)顯示1) 隨著處理濃度的增加，兩條多肽序列對(duì)MG63細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，死亡細(xì)胞逐漸 增多，合成多肽對(duì)MG-63細(xì)胞的抑制作用，見(jiàn)圖3。2)隨著處理時(shí)間的增加，死亡細(xì)胞也逐 漸增多，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增高。
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權(quán)利要求
MMP14雙靶點(diǎn)高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取方法，從MMP14蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的人成骨肉瘤MG63細(xì)胞中篩選和獲得一組新型的雙靶點(diǎn)MMP14和Zn2+的多肽，包括基于MG63細(xì)胞靶向誘導(dǎo)表達(dá)MMP14的噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)體外消減篩選，通過(guò)“吸附 消減 吸附 洗脫 擴(kuò)增”的循環(huán)篩選獲得富集噬菌體，經(jīng)3 5輪篩選，將最后一輪篩選富集的噬菌體鋪板，挑取單克隆噬菌體制備ssDNA并測(cè)序。
2.由權(quán)利要求1所述方法獲得的結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列，其特征在于，所述靶向MMP14 富集噬菌體至少含有以下一種多肽結(jié)構(gòu)序列A-H-Q/S-L-H/P、P-E/q-P-L、A-L-H/k-H_H/t-H、 L/I/e-P-L-L、P-X-P, H-H-X-H、M-P-K-S、M-K-P-S ；所述結(jié)合肽多肽結(jié)構(gòu)序列分子對(duì)接在 MMP14和MMP15上的結(jié)合結(jié)構(gòu)域分別主要是His-Asn-Glu和Asn-His-His。
3.權(quán)利要求2所述結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的用途，其特征在于，所述結(jié)合肽及多肽結(jié) 構(gòu)序列作為先導(dǎo)分子用于疾病治療藥物研發(fā)和用于腫瘤診斷。
4.權(quán)利要求2所述結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的用途，其特征在于，所述結(jié)合肽及多肽結(jié) 構(gòu)序列用于蛋白質(zhì)分離純化、分子標(biāo)簽以及重金屬污染生物修復(fù)、采礦等領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種MMP14雙靶點(diǎn)高效結(jié)合肽及多肽結(jié)構(gòu)序列的獲取方法和目標(biāo)物的用途。從MMP14蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的人成骨肉瘤MG63細(xì)胞中篩選和獲得一組新型的雙靶點(diǎn)MMP14和Zn2+的多肽，包括基于MG63細(xì)胞靶向誘導(dǎo)表達(dá)MMP14的噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)體外消減篩選，經(jīng)3-5輪篩選，獲得富集的雙靶向MMP14和Zn2+的結(jié)合肽噬菌體和多肽結(jié)構(gòu)序列。目標(biāo)物作為先導(dǎo)分子用于疾病治療藥物研發(fā)和用于腫瘤診斷，還可用于蛋白質(zhì)分離純化、分子標(biāo)簽以及重金屬污染生物修復(fù)、采礦等。
文檔編號(hào)A62D3/02GK101928740SQ200910167829
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者梁志娟, 茆燦泉, 黃敬雙 申請(qǐng)人:西南交通大學(xué)