專利名稱：多肽內(nèi)二硫鍵的定位方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽結(jié)構(gòu)的測定方法，尤其涉及多肽內(nèi)二硫鍵的定位方法。
背景技術(shù)：
當一條多肽鏈中含有多個半胱氨酸且形成多對二硫鍵時，其側(cè)鏈巰基可能有多種連接方式，如何確定巰基的配對方式是多肽研究領(lǐng)域非常重要的一項技術(shù)。在已發(fā)表的文獻和專利中，多肽內(nèi)二硫鍵的定位主要有以下幾種方法1)酶切法、2)對角線電泳法、3)部分還原結(jié)合Edman降解法，Edman降解測序，該方法費時、費力，且分析結(jié)果不穩(wěn)定。4)X射線晶體衍射法、5) 二維核磁法等，而部分還原法聯(lián)合MS/MS進行多肽內(nèi)二硫鍵定位的方法還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種定位多肽內(nèi)二硫鍵連接結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟
1)制備部分還原產(chǎn)物將待測多肽與二硫蘇糖醇在高溫下孵育10-60min，優(yōu)選20-40min，加入TCEP反應(yīng)5_60min，優(yōu)選20_30min ;分離得到部分還原產(chǎn)物；
2)制備烷基化的部分還原產(chǎn)物將部分還原產(chǎn)物與碘乙酰胺在高溫下反應(yīng)5-60min，優(yōu)選10-20min，使二硫鍵斷開部位的巰基烷基化；分離得到烷基化的部分還原產(chǎn)物；
3)斷開所有二硫鍵將烷基化的部分還原產(chǎn)物與二硫蘇糖醇在45-55°C反應(yīng)5-60min，優(yōu)選20-30min，使烷基化的部分還原產(chǎn)物中所有二硫鍵斷開；
4):用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜和電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜，采用納噴技術(shù)結(jié)合碰撞誘導(dǎo)解離方法對斷開所有二硫鍵的烷基化多肽進行檢測分析，根據(jù)氨基酸被烷基化的情況以及多肽的以及一級結(jié)構(gòu)定位二硫鍵連接結(jié)構(gòu)；
所述的高溫指35-75 °C，優(yōu)選55-65 °C。步驟I)制備部分還原產(chǎn)物
所述的待測多肽是指肽鏈內(nèi)具有二硫鍵結(jié)構(gòu)的多肽；這些“部分還原產(chǎn)物”有一對、二對、三對……或更多對二硫鍵被還原；之所以稱為“部分還原產(chǎn)物”是由于測定所需要的產(chǎn)物不是完全被還原或完全未被還原的多肽，而是只有部分被還原的多肽，二硫鍵是處于斷開的狀態(tài)，比如多肽中含有3對二硫鍵，部分還原產(chǎn)物為一對二硫鍵或二對二硫鍵被還原的產(chǎn)物，部分被還原的產(chǎn)物是指2種物質(zhì)，而不包括三對二硫鍵全部被還原的產(chǎn)物，也不包括一對都未還原的多肽原始結(jié)構(gòu)。實踐中發(fā)現(xiàn)，控制待測多肽處于部分還原狀態(tài)是技術(shù)難點，本領(lǐng)域的技術(shù)人員難以掌握其中的訣竅。申請人研究發(fā)現(xiàn)，控制待測多肽完全被還原而處于部分被還原的狀態(tài)，需要控制還原劑的用量和反應(yīng)時間。所以經(jīng)過申請人經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動確定影響還原的因素如下
待測多肽與二硫蘇糖醇的用量質(zhì)量比為1:2-1:4。申請人發(fā)現(xiàn)二硫蘇糖醇可以將包裹在空間結(jié)構(gòu)內(nèi)部的二硫鍵打斷。
所述的孵育是指在一定溫度條件下進行反應(yīng)的過程，是實現(xiàn)二硫鍵斷裂的過程。待測多肽與三羧乙基磷(TCEP)的用量質(zhì)量比為2:1-4: I?？刂芓CEP的用量，從而達到部分還原的效果，為后續(xù)測定提供3對、2對及I對二硫鍵被還原的產(chǎn)物。本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用二硫蘇糖醇與TCEP，該方法可以將包裹在多肽空間結(jié)構(gòu)內(nèi)的二硫鍵打開，同時通過控制還原劑的量和反應(yīng)時間，又保證其二硫鍵不會被全部還原。當反應(yīng)能夠符合測量目的后，可以采用三氟乙酸(TFA)終止反應(yīng)，待測多肽與三氟乙酸的用量質(zhì)量比為30:1-10:1
分離反應(yīng)產(chǎn)物優(yōu)選采用色譜法，更有選采用高效液相色譜法，即采用HPLC。比如采用HPLC法分離得到二硫鍵斷開的部分還原產(chǎn)物，HPLC分離體系可以為A相0. 1-0. 2%TFA，B 相ACN。 每斷開一對二硫鍵，原樣分子量增加2Da (Da是分子量單位道爾頓)，所有部分還原產(chǎn)物可以經(jīng)質(zhì)譜確認。步驟2 :部分還原產(chǎn)物烷基化
部分還原產(chǎn)物量未知，無法計算與碘乙酰胺用量比，經(jīng)過申請人摸索發(fā)現(xiàn)，當每100 i! L部分還原產(chǎn)物加入20-30 I. OM碘乙酰胺溶液時可實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。故碘乙酰胺的用量可以根據(jù)反應(yīng)規(guī)模進行換算。申請人:檢測烷基化的部分還原產(chǎn)物與碘乙酰胺具有一定的量比關(guān)系，質(zhì)量比為1:2-1:3。當反應(yīng)能夠符合測量目的后，可以采用三氟乙酸(TFA)終止反應(yīng)，待測多肽與三氟乙酸的用量質(zhì)量比為1:200-1:300
分離反應(yīng)產(chǎn)物優(yōu)選采用色譜法，更有選采用高效液相色譜法，即采用HPLC。比如采用HPLC法分尚。每個巰基與碘乙酰胺完成烷基化反應(yīng)后，分子量增加116 Da，烷基化的部分還原產(chǎn)物可以經(jīng)質(zhì)譜確認。本發(fā)明通過控制碘乙酰胺的用量，保證烷基化的反應(yīng)完全，同時，又不會殘留過多碘乙酰胺，對后續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生影響。步驟3 :斷開所有二硫鍵
3)斷開所有二硫鍵將烷基化的部分還原產(chǎn)物與二硫蘇糖醇在高溫下反應(yīng)5-60min，優(yōu)選20-30min，使烷基化的部分還原產(chǎn)物中所有二硫鍵斷開；
烷基化的部分還原產(chǎn)物與二硫蘇糖醇的用量質(zhì)量比為1:2-1:3。步驟4 :采用串聯(lián)質(zhì)譜(MS\MS)測序
利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F)和電噴霧(四極桿-飛行時間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF)兩種質(zhì)譜儀采用納噴技術(shù)結(jié)合碰撞誘導(dǎo)解離(Nano)方法對二硫鍵全部打開的烷基化多肽進行檢測分析，根據(jù)氨基酸被烷基化的情況分析二硫鍵形成的位點。本發(fā)明采用MALDI-T0F和ESI-Q-TOF具有以下優(yōu)勢1)這兩種質(zhì)譜對分子量的測定具有互補性，MALDI-T0F適合檢測1000-6000范圍內(nèi)物質(zhì)，ESI-Q-TOF適合檢測2000以下的物質(zhì)。2)這兩種的電離強度較低，可以較好的保持多肽結(jié)構(gòu)的完整性。以上兩個優(yōu)勢，可以使檢測結(jié)果更加準確。
本發(fā)明的多肽內(nèi)ニ硫鍵的定位方法，采用部分還原法聯(lián)合MS/MS定位多肽內(nèi)ニ硫鍵，操作簡便，效率較高，結(jié)果準確。


圖I:實施例I待測多肽樣品ー級結(jié)構(gòu)
圖2 :待測多肽經(jīng)過部分還原后的RP-HPLC分離圖譜
圖3 :N色譜峰洗脫液質(zhì)譜圖
圖4 :A色譜峰洗脫液質(zhì)譜圖
圖5 :B色譜峰洗脫液質(zhì)譜圖
圖6 :R色譜峰洗脫液質(zhì)譜圖
圖7 :A峰烷基化RP-HPLC分離圖譜
圖8 :峰A洗脫液烷基化后質(zhì)譜檢測結(jié)果
圖9 :B峰烷基化RP-HPLC分離圖譜
圖10 :峰B洗脫液烷基化后質(zhì)譜檢測結(jié)果
圖11 :烷基化的A峰洗脫液經(jīng)全部還原后質(zhì)譜(MS)檢測結(jié)果
圖12 :烷基化的B峰洗脫液經(jīng)全部還原后質(zhì)譜(MS)檢測結(jié)果
圖13 :全部還原的烷基化A峰洗脫液MS/MS圖譜
圖14 :全部還原的烷基化B峰洗脫液MS/MS圖譜
圖15 :兩對ニ硫鍵斷開并烷基化產(chǎn)物序列
圖16 一對_■硫鍵斷開并燒基化廣物序列
圖17:待測多肽結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式實施例I :
為了充分說明本發(fā)明的技術(shù)方案，舉例定位一條由30個氨基酸(其中有6個半胱氨酸相互形成ニ硫鍵)組成的多肽(分子量3140)中二硫鍵的連接方式，其ー級結(jié)構(gòu)如圖I所
/Jn ο第一歩、待測多肽樣品ニ硫鍵部分還原
將 2mg 的樣品加 100 μ L O. 5Μ DTT 溶液(ρΗ6· 5)孵育 30min(60°C )，加 10 μ L TCEP(O. 2Μ)溶液，60°C反應(yīng)20 min,加O. 2%TFA水溶液50 μ L終止反應(yīng)。在美國Waters公司515HPLC上分離，分離柱為Kromasil 250*4. 6mm C18柱,分離梯度如下
權(quán)利要求
1.一種多肽內(nèi)二硫鍵的定位方法，包括以下步驟 1)制備部分還原產(chǎn)物將待測多肽與二硫蘇糖醇在高溫下孵育10-60min，加入TCEP反應(yīng)5-60min，分離得到部分還原產(chǎn)物； 2)制備烷基化的部分還原產(chǎn)物將部分還原產(chǎn)物與碘乙酰胺在高溫下反應(yīng)5-60min，使二硫鍵斷開部位的巰基烷基化；分離得到烷基化的部分還原產(chǎn)物； 3)斷開所有二硫鍵將烷基化的部分還原產(chǎn)物與二硫蘇糖醇在高溫下反應(yīng)5-60min，使烷基化的部分還原產(chǎn)物中所有二硫鍵斷開； 4):用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜和電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜，采用納噴技術(shù)結(jié)合碰撞誘導(dǎo)解離方法對斷開所有二硫鍵的烷基化多肽進行檢測分析，根據(jù)氨基酸被烷基化的情況以及多肽的以及一級結(jié)構(gòu)定位二硫鍵連接結(jié)構(gòu)； 所述的高溫指35-75 °C。
2.一種如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟I)中的待測多肽與二硫蘇糖醇的用量質(zhì)量比為1:2-1:4。
3.—種如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟I)中的待測多肽與TCEP的用量質(zhì)量比為2:1-4: I。
4.一種如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟I)中的待測多肽與TCEP的用量質(zhì)量比為2:1-4: I。
5.一種如權(quán)利要求1-4任意一項所述的方法，其特征在于步驟2)中的部分還原產(chǎn)物與碘乙酰胺的用量比為每IOOii L部分還原產(chǎn)物加入20-30ii L I. OM碘乙酰胺溶液。
6.一種如權(quán)利要求1-4任意一項所述的方法，其特征在于步驟2)中的烷基化的部分還原產(chǎn)物與二硫蘇糖醇的用量質(zhì)量比為1:2-1:3。
7.—種如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟2)中的烷基化的部分還原產(chǎn)物與二硫蘇糖醇的用量質(zhì)量比為1:2-1:3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多肽結(jié)構(gòu)的測定方法，尤其是一種定位多肽內(nèi)二硫鍵連接結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟1)將待測多肽與二硫蘇糖醇在高溫下孵育，加入TCEP反應(yīng)，分離得到部分還原產(chǎn)物；2)將部分還原產(chǎn)物與碘乙酰胺在高溫下反應(yīng)，使二硫鍵斷開部位的巰基烷基化；分離得到烷基化的部分還原產(chǎn)物；3)將烷基化的部分還原產(chǎn)物與二硫蘇糖醇反應(yīng)，使烷基化的部分還原產(chǎn)物中所有二硫鍵斷開；4)用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜和電噴霧-四極桿-飛行時間質(zhì)譜檢測分析，定位二硫鍵連接結(jié)構(gòu)；本發(fā)明的多肽內(nèi)二硫鍵的定位方法，采用部分還原法聯(lián)合MS/MS定位多肽內(nèi)二硫鍵，操作簡便，效率較高，結(jié)果準確。
文檔編號G01N27/62GK102721734SQ20121021419
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月27日
發(fā)明者宓鵬程, 康旭, 袁建成, 馬亞平 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司